專(zhuān)利名稱(chēng)：一種殺蟲(chóng)綠僵菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物新菌株，具體涉及一種殺蟲(chóng)綠僵菌菌株及其應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
稻縱卷葉螟是水稻主要害蟲(chóng)之一，國(guó)內(nèi)稻縱卷葉螟廣泛分布于全國(guó)各稻區(qū)，嚴(yán)重的威脅著我國(guó)糧食生產(chǎn)。目前，主要施用廣譜性化學(xué)農(nóng)藥控制稻縱卷葉螟，不僅直接影響人體健康和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的安全，而且由于稻縱卷葉螟產(chǎn)生抗藥性和化學(xué)農(nóng)藥大量殺傷稻縱卷葉螟天敵，破壞稻田生態(tài)平衡，嚴(yán)重削弱田間自然控制能力，容易導(dǎo)致稻縱卷葉螟的再猖獗、難以控制。昆蟲(chóng)病原真菌是最重要的殺蟲(chóng)微生物類(lèi)群，在自然條件下約70%的昆蟲(chóng)病害是真菌引起的，是唯一具有觸殺特性和流行性的病原微生物，其致病機(jī)制復(fù)雜，因而盡管它是最早應(yīng)用于害蟲(chóng)防治的微生物，但是仍未發(fā)現(xiàn)有抗性害蟲(chóng)產(chǎn)生，對(duì)解決害蟲(chóng)的抗藥性問(wèn)題極具潛力。因此，真菌作為重要的替代農(nóng)藥，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注；國(guó)內(nèi)對(duì)生防真菌的研究始于20世紀(jì)50年代，目前在殺蟲(chóng)真菌液固兩相生產(chǎn)技術(shù)、制劑研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)等方面處于國(guó)際領(lǐng)先地位。迄今為止，國(guó)內(nèi)外先后登記注冊(cè)殺蟲(chóng)真菌農(nóng)藥100多個(gè)。殺蟲(chóng)真菌具有較強(qiáng)的垂直和水平擴(kuò)散能力，容易形成流行病，有助于害蟲(chóng)的持續(xù)控制，對(duì)于遷飛性害蟲(chóng)稻縱卷葉螟的控制尤為有利，但利用真菌控制稻縱卷葉螟尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，其主要原因之一是缺乏高毒力殺蟲(chóng)真菌菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)稻縱卷葉螟具有殺蟲(chóng)效果好、生產(chǎn)性狀好的綠僵菌菌株 CQMa421。本發(fā)明菌株是通過(guò)采集自然感染的稻縱卷葉螟僵蟲(chóng)直接分離篩選出的一株生產(chǎn)性狀好、對(duì)稻縱卷葉螟具有高毒力的金龜子綠僵菌小孢變種(Me tarhizium anisopliae var. miso/^iae)菌株CQMa421，已于2011年02月25日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC NO. 4609。本發(fā)明綠僵菌菌株CQMa421接種在1/4SDA平板上，培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)特征， 顯示在1/4SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期菌落呈白色棉絮狀，產(chǎn)孢時(shí)橄欖綠色；菌絲具有分隔和分支、透明，直徑為1. 5-2. OMffl ；分生孢子孢子梗單生或聚集或緊密排列，呈帚狀分支，直徑約為2. OMffl，其末端產(chǎn)生瓶形小梗，8-16 X 1. 5-2Mfli ；從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成串鏈的分生孢子，分生孢子單細(xì)胞，長(zhǎng)橢圓形，大小4. 8-7 X 2-3 Mm。本發(fā)明綠僵菌菌株CQMa421具體如下的有益效果
本發(fā)明從自然感染的稻縱卷葉螟僵蟲(chóng)直接分離篩選的綠僵菌菌株CQMa421，產(chǎn)孢能力強(qiáng)、產(chǎn)孢率可達(dá)6. 8%、其生產(chǎn)性狀好、生長(zhǎng)迅速，同時(shí)殺蟲(chóng)活性強(qiáng)、殺蟲(chóng)效果好。利用該菌株
3生產(chǎn)的殺蟲(chóng)真菌制劑，有效地控制了稻縱卷葉螟種群數(shù)量。


圖1 CQMa421菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與孢子形態(tài)大小；
圖2 綠僵菌屬OfeiarAiziws)的ITSl — 5. 8S — ITS2 rDNA區(qū)域分支系統(tǒng)樹(shù)； 圖3 CQMa421對(duì)稻縱卷葉螟殺蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果； 圖4 CQMa421對(duì)稻縱卷葉螟室外防治生測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1 菌株的分離
將采集到的自然感染的稻縱卷葉螟僵蟲(chóng)用70%酒精表面消毒，放入培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)3-5天，使其昆蟲(chóng)表面生長(zhǎng)出新鮮孢子；在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取微量新鮮孢子在含有100微克/毫升氨芐青霉素的1/4SDA培養(yǎng)基平板上劃線；將劃線好的培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于恒溫箱中培養(yǎng)；3—4日后挑選長(zhǎng)出的典型而無(wú)雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中央，28°C恒溫培養(yǎng)10-15天。實(shí)施例2菌株的鑒定 (1)、形態(tài)鑒定
將分離到的CQMa421菌株接種在1/4SDA平板上，28°C培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)特征，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形狀與大小。結(jié)果顯示在1/4SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期菌落呈白色棉絮狀，產(chǎn)孢時(shí)橄欖綠色。菌絲具分隔和分支，透明，直徑為1.5-2. OMffl。分生孢子孢子梗單生或聚集或緊密排列，呈帚狀分支，直徑約為2. OMffl，其末端產(chǎn)生瓶形小梗，8-16 X1.5-2Mffl。從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成串鏈的分生孢子(參見(jiàn)圖1中的左圖)。分生孢子單細(xì)胞，長(zhǎng)橢圓形，大小 4.8-7 X2-3 Mm (參見(jiàn)圖1中的右圖)。從以上特征看，菌株CQMa421應(yīng)該為金龜子綠僵菌 ^""ife^ft Metarhizium anisopliae var. anisopliaeο(2)、CQMa421菌株的ITS序列擴(kuò)增、序列測(cè)定及分子分類(lèi)
將CQMa421在1/4SDAY液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3天(180rpmJ8°C)，離心(10000 g， 20min)收集菌絲，液氮研磨破碎后采用DNA提取試劑盒提取菌株CQMa421的總DNA。以總的DNA為模板，參照Curran擴(kuò)增綠僵菌ITS1-5. 8S-ITS2 rDNA區(qū)域。所用引物為T(mén)W81 5‘ -gtttccgtaggtgaacctgc _3，和 AB28 5‘ -atatgcttaagttcagcgggt _3，，產(chǎn)生 547bp 擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)在PCR儀上的反應(yīng)程序95°C 4min, 1個(gè)循環(huán)；94°C 0. 5min, 53°C 0. 5min， 72°C 0.5min，30循環(huán)；最后72°C IOmin0將擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收純化，由上海生工進(jìn)行雙向脫氧法測(cè)序。CQMa421 ITS1-5. 8S-ITS2測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ ID No. 1。該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已之序列比對(duì)，符合預(yù)期長(zhǎng)度，無(wú)與其序列相同的菌株。該序列5，端包含18S rDNA部分基因序列(1-34)，3，端包含部分^S rDNA基因序列 (504-549)，其余的分別為ITSl區(qū)域(35-167)，5. 8S rDNA基因全序列(168-3 )以及ITS2
4區(qū)域(327-519)。利用 MEGA v4. 1 (www.megasoftware.net)軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)(1000 次重復(fù))證實(shí)CQMa421 W^kMetarhizium anisopliae·. anisopliae 金龜子綠僵菌小孢變種(圖2所示)。
實(shí)施例3 CQMa421對(duì)稻縱卷葉螟室內(nèi)殺蟲(chóng)活性的測(cè)定
收集在1/4SDA平板上培養(yǎng)的CQMa421成熟孢子，用0. 05% (W/V)吐溫-80分散，配置成終濃度為IX IO8個(gè)孢子/ml的懸浮液。采用點(diǎn)滴法稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)，每頭試蟲(chóng)用微量點(diǎn)樣器點(diǎn)滴藥劑2 μ 1，接種30頭，接種后在室溫^°C，濕度50-70%的條件下飼養(yǎng)，設(shè)5個(gè)重復(fù)，以清水為空白對(duì)照。記錄死蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算存活率，經(jīng)DPS2000軟件統(tǒng)計(jì)分析得到真菌LT5tl (致死中時(shí))和LT9tl (致死終時(shí))。從圖3可以看出，綠僵菌CQMa421菌株對(duì)稻縱卷葉螟有明顯的殺蟲(chóng)活性。接種后 5-7天死亡高峰期，稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)感病死亡后蟲(chóng)體僵硬，保濕培養(yǎng)3天后長(zhǎng)出白色菌絲， 5-7天蟲(chóng)體長(zhǎng)滿綠色孢子。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，其CQMa421菌株對(duì)稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)的LT5tl (致死中時(shí))和LT9tl (致死終時(shí))分別為5. 3天和9. 1天。實(shí)施例4 CQMa421菌株產(chǎn)孢特性
將濃度為IX IO8個(gè)孢子/ml的CQMa421孢子懸浮液接種在1/4SDA平板上(100 μ 1/ 皿)，在不同溫度(15°C，200C，240C ,26°C, 28°C，30°C，37°C )的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15天后測(cè)定單位面積上的產(chǎn)孢量，確定CQMa421菌株在條件下產(chǎn)孢最佳。分別配制pH為4. 5,5.0, 5. 5，6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0，8. 5的1/4SDA平板，按上述方法測(cè)定產(chǎn)孢量，確定CQMa421菌株在pH為6. 5條件下產(chǎn)孢最佳。實(shí)施例5 CQMa421菌株固體發(fā)酵物料的優(yōu)化
液體培養(yǎng)CQMa421菌絲作為發(fā)酵種子。固體發(fā)酵物料配置在培養(yǎng)固體物料大米或碎玉米或小麥中分別加入15%或20%或25%或30% (V/W)的營(yíng)養(yǎng)液(pH 6.5)或水；營(yíng)養(yǎng)液為1/4SDAY或1/8SDA或1/6SDA或1/32SDAY。拌勻后裝入兩端透氣的聚丙烯袋袋中，121°C高壓濕熱滅菌30 min ；自然冷卻后加入按培養(yǎng)物料與菌液=10 1的比例(W/V) 接種綠僵菌CQMa421菌液并拌勻均勻，置于^TC的發(fā)酵室中靜止發(fā)酵15天后升溫干燥 (30°C _34°C)，至物料含水量低于5%。隨機(jī)抽取物料發(fā)酵樣品，混勻后取5g左右的樣品，放入裝有20mL 0. 05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混勻后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)品的含孢量，按200 X IO8個(gè)/g換算出固體發(fā)酵的產(chǎn)孢率。以產(chǎn)孢率為優(yōu)化指標(biāo)，最后確定CQMa421 的固體發(fā)酵物料配方為大米加入25% (V/W)的1/16SDA營(yíng)養(yǎng)液(pH 6. 5)。實(shí)施例6 CQMa421菌株的室外防治效果
CQMa421接種在1/4SDAY平板上液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3天(180rpm，28 V )；將菌液接種在滅菌的大米上，拌勻后^TC下培養(yǎng)15天；收集孢子后用色拉油配制成終濃度為2 X 101° 個(gè)孢子/ml油懸浮劑。選擇稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)發(fā)生較重的稻田，隨機(jī)選擇4個(gè)IOmX IOm小區(qū)，間隔5米。 每個(gè)小區(qū)放置1個(gè)觀測(cè)網(wǎng)罩(lmXaii，間距1米以上)，采集幼蟲(chóng)接種于網(wǎng)罩內(nèi)(50-100頭 /網(wǎng)罩)，24小時(shí)后采用泰山-18型機(jī)動(dòng)噴霧器進(jìn)行超低容量噴施CQMa421孢子油懸浮劑 QX IO13個(gè)孢子/公頃)。以噴施清水為空白對(duì)照。施藥后每天調(diào)查網(wǎng)罩內(nèi)蟲(chóng)情。根據(jù)室外生測(cè)結(jié)果表明施藥后12天，綠僵菌CQMa421菌株對(duì)稻縱卷葉螟的防治效果達(dá)到90%以上(圖4)。綠僵菌CQMa421菌株處理組的成蟲(chóng)數(shù)(/百叢)約為1. 5只，而對(duì)照組的成蟲(chóng)數(shù)(/百叢)達(dá)到13. 6只。實(shí)施例7 CQMa421菌株固體發(fā)酵產(chǎn)孢率
配制PH初始值為6.5的1/16SDA營(yíng)養(yǎng)液，按25% (V/W)的比例加入大米中，拌勻后裝入兩端透氣的聚丙烯袋中，121°C高壓濕熱滅菌30 min;自然冷卻后按1:10 (菌液大米， V /W)比例接種綠僵菌CQMa421菌液并拌勻均勻，置于^TC的發(fā)酵室中靜止發(fā)酵15天后升溫干燥(30°C _34°C)，至物料含水量低于5%。隨機(jī)抽取10袋發(fā)酵料，混勻后每袋混勻后各取5g左右的樣品，放入裝有20mL 0. 05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混勻后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)品的含孢量，按200 X IO8個(gè)/g換算出固體發(fā)酵的產(chǎn)孢率。以清水代替1/16SDA 營(yíng)養(yǎng)液設(shè)為對(duì)照。表1 CQMa421菌株固體發(fā)酵產(chǎn)孢率
固體培養(yǎng)物料_產(chǎn)孢率(％)顯荖性檢驗(yàn)(P=OiOl)
權(quán)利要求
1.一ft^iBliiliitt {Metarhizium anisopIiae var. anisopIiae) CQMa421, 1 ! j^f 為 CGMCC NO. 4609。
2.如權(quán)利要求1所述的綠僵菌菌株，其特征在于該菌株的適宜產(chǎn)孢溫度為^TC,適宜產(chǎn)孢PH為6. 5。
3.如權(quán)利要求1所述菌株在對(duì)稻縱卷葉螟防治中的應(yīng)用。
全文摘要
一種綠僵菌菌株(Metarhiziumanisopliaevar.anisopliae)CQMa421，保藏編號(hào)為CGMCCNO.4609，其在對(duì)稻縱卷葉螟防治中的應(yīng)用。本發(fā)明菌株生產(chǎn)性狀好、生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)孢能力強(qiáng)、產(chǎn)孢率可達(dá)6.8%，具有高毒力；從而利用該菌株生產(chǎn)的殺蟲(chóng)真菌制劑，有效地控制了稻縱卷葉螟種群數(shù)量。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102212483SQ20111010546
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者夏玉先, 彭國(guó)雄 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)