專利名稱：從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法，屬基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一種功能未特定的細(xì)胞，具有兩個(gè)特性即具有無(wú)限的自我更新能力，能夠分化為一種以上的高度分化子細(xì)胞的能力，實(shí)際上包括了從胚胎發(fā)育到成人生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各種未分化成熟細(xì)胞。既包括生命起源細(xì)胞，組織器官發(fā)育的原始細(xì)胞，也包括成體組織更新?lián)Q代、損傷修復(fù)的種子細(xì)胞。因此，干細(xì)胞具有多種潛在的用途，包括細(xì)胞治療、用于制造可供移植的組織和器官、基因治療以及藥物篩選等。成體干細(xì)胞是一類功能未特定分化的或未分化的細(xì)胞，其存在于多種成體組織中。成體干細(xì)胞能夠分化成為所屬組織中的幾乎所有細(xì)胞類型，而且可以跨胚層分化，具有多向分化能力。成體干細(xì)胞常見(jiàn)于骨髓、血液、腦、角膜、牙齒、肝臟、皮膚等。胎盤中具有大量造血干細(xì)胞，可以用來(lái)移植給患有嚴(yán)重白血病等血液系統(tǒng)疾病的病人來(lái)治療血液疾病，具有非常重要的臨床應(yīng)用。但具有兩個(gè)缺點(diǎn)，一是細(xì)胞量相對(duì)較少， 兒童用量可以，但對(duì)成人使用則量嚴(yán)重不足，不能用于成人移植；第二，最重要的是，胎盤造血干細(xì)胞具有自己的白細(xì)胞抗原(HLA)，雖然免疫原性較小，但也存在免疫抑制反應(yīng)。既然造血干細(xì)胞具有重要的用途，能不能構(gòu)建具有自己的HLA的患者的造血干細(xì)胞，解決免疫抑制危險(xiǎn)呢？因此存在制備自體造血干細(xì)胞的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于這樣的認(rèn)識(shí)，即已有的胚胎干細(xì)胞的胞質(zhì)能使分化的細(xì)胞發(fā)生重編程，成為多能干細(xì)胞，那么多能干細(xì)胞的胞質(zhì)是不是也具有這樣的功能呢？而且，如果發(fā)生重編程，得到的雜種細(xì)胞是否與供者細(xì)胞具有相同的HLA，即具有免疫相容性，新產(chǎn)生的多能干細(xì)胞能否分化形成與所供細(xì)胞來(lái)源相同的白細(xì)胞抗原，由此可以避免在患者體內(nèi)產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)。因此，本發(fā)明旨在解決上面提到的解決免疫排斥反應(yīng)和干細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題， 提供一種從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法，包括以下步驟
a、從胎盤中獲取造血干細(xì)胞；
b、將造血干細(xì)胞去核，獲取胞質(zhì)；
C、將所獲胞質(zhì)與分化細(xì)胞進(jìn)行融合，以產(chǎn)生胞質(zhì)雜種細(xì)胞； d、培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種細(xì)胞以產(chǎn)生造血干細(xì)胞。另外，在d步驟前，還可以添加將所述胞質(zhì)雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)層上擴(kuò)增的步驟， 所述的飼養(yǎng)層可以為胎盤貼壁細(xì)胞飼養(yǎng)層。上述分化細(xì)胞包括皮膚成纖維細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞等分化細(xì)胞。本發(fā)明利用胞質(zhì)互作原理，將臍血造血干細(xì)胞分離純化，密度梯度離心去核，造血干細(xì)胞胞質(zhì)可以和成纖維細(xì)胞核相互作用，對(duì)細(xì)胞核重編程，產(chǎn)生融合造血干細(xì)胞，可以構(gòu)建與患者HLA配型一致的融合雜合造血干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選擴(kuò)增，可以作為臨床移植造血干細(xì)胞的一個(gè)新的來(lái)源，其來(lái)源廣泛，并且沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)方便，為白血病等疾病的治療提供了新的基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，更為臨床產(chǎn)生患者自體造血干細(xì)胞提供了一個(gè)新的方式。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明，雖然本發(fā)明允許有多種不同形式的實(shí)施方式，但本發(fā)明將詳細(xì)說(shuō)明至少一種實(shí)施方式和其他可能的替代方法，同時(shí)，本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容應(yīng)該被認(rèn)為是在舉例說(shuō)明本發(fā)明的方法和原則，而不是將本發(fā)明限制在所描述的具體實(shí)施方式
中。


圖1是融合后造血干細(xì)胞⑶34+細(xì)胞體外培養(yǎng)的各階段形態(tài)學(xué)特征。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明產(chǎn)生自體造血干細(xì)胞的主要思想是將來(lái)自胎盤的造血干細(xì)胞與分化細(xì)胞融合而產(chǎn)生胞質(zhì)雜種細(xì)胞，其是多能干細(xì)胞，所產(chǎn)生的胞質(zhì)雜種細(xì)胞表達(dá)供體細(xì)胞來(lái)源的主要組織相容性抗原(MHC)，特別是表達(dá)與所述細(xì)胞相同的白細(xì)胞抗原(HLA)。本發(fā)明使用的分化細(xì)胞可以是皮膚成纖維細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞等，而不使用淋巴細(xì)胞。這是由于皮膚成纖維細(xì)胞相對(duì)其他細(xì)胞來(lái)源來(lái)說(shuō)比較簡(jiǎn)單，傷害性較小。而且胞質(zhì)較少，因此使用皮膚成纖維細(xì)胞與造血干細(xì)胞的胞質(zhì)進(jìn)行融合是比較合適的。一、從臍帶血和胎盤中獲取造血干細(xì)胞 1、臍帶血(UCB)的采集
用60ml的注射器吸入2ml肝素，裝上16 口徑的針頭，從臍帶靜脈中收集UCB，立即顛倒幾次進(jìn)行混勻，防止血液凝固。2、MNC的制備和培養(yǎng)
(1)向每個(gè)50ml離心管中加入15mlUCB，用20mlPBS進(jìn)行稀釋。(2)加入15mlFicoll，用導(dǎo)管將Ficoll置于UCB的底部，使之形成一個(gè)清晰的界(3)離心 740g，室溫 30min。(4)離心后，MNC在上部的黃色血清層和底部的FIcoll之間形成一層淡黃色的霧狀懸浮層，用吸頭放在淡黃色的懸浮層上，輕輕吸出MNC，然后將MNC轉(zhuǎn)入裝有培養(yǎng)基的離心管中。(5)將MNC在室溫以515g離心lOmin，棄去上清。將沉淀的細(xì)胞團(tuán)輕輕吹散，重懸細(xì)胞。(6)重復(fù)步驟5—次。 (7)將MNC懸液混勻，取30ul細(xì)胞，胎盤蘭染色，計(jì)數(shù)。
3、磁性分選造血干細(xì)胞(⑶34+細(xì)胞)
(1)用PBS調(diào)整MNCs濃度為2X 108/ml，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至5ml的聚丙烯i^alcon管內(nèi)；
(2)加入Easykp Human CD34 Positive Selection Cocktail 10μ1，輕輕混勻后室溫下作用15min ；
(3)加入EasyS印MagneticNanoparticles 5 μ 1，輕輕混勻后室溫下作用IOmin ；加 PBS補(bǔ)足至2. 5ml，混勻；
(4)將!^alcon管置于fesykpMagnet磁場(chǎng)中，室溫靜置5min，傾去液體；PBS反復(fù)洗滌4次，適量PBS混勻細(xì)胞，計(jì)數(shù)。二、將造血干細(xì)胞去核，獲取胞質(zhì)
1、將造血干細(xì)胞(⑶34+細(xì)胞)先在無(wú)鈣鎂PBS( —)溶液中孵育5min之后，再經(jīng)0. 25% 胰蛋白酶+0. 04% EDTA溶液消化成單個(gè)細(xì)胞。2、加入DMEM中和消化作用，1500r/min離心5min，棄掉上清液，再向離心管中加入 Iml含細(xì)胞松弛素B和0. 5% DMSO的DMEM培養(yǎng)液，重新制成細(xì)胞懸液，密度調(diào)節(jié)至1 X 10 個(gè)/ ml，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)lh，后再移至已準(zhǔn)備好的梯度管上部。3、將含有⑶34+細(xì)胞懸液的Ficoll密度梯度離心管置提前溫育至30°C的高速離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為25000r/min，離心50min。4、離心結(jié)束后，將離心管中的溶液全部?jī)A入小燒杯，再加入20ml DMEM培養(yǎng)液，離心1500r/min，5min，棄上清液后加入Iml DMEM培養(yǎng)液，將此細(xì)胞片段懸液移入四孔板，置
培養(yǎng)才苜培養(yǎng)。三、將所獲細(xì)胞胞質(zhì)與分化細(xì)胞進(jìn)行融合，產(chǎn)生胞質(zhì)雜種細(xì)胞 1、分化細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)的獲取
(1)手術(shù)切取患者腹部或下肢的皮膚2-3cm2，置于含有100IU/ml氨芐青霉素和IOOmg/ ml硫酸鏈霉素的PBS中，反復(fù)幾次PBS漂洗后，剪棄脂肪和結(jié)締組織。將皮膚剪成Imm3左右大小的小塊，加入含有膠原酶、透明質(zhì)酸酶的DMEM中，放置4度冰箱過(guò)夜。(2)加入含有0. 25%胰酶和0. 02%EDTA的消化液，37°C消化20min，加入含血清培養(yǎng)液終止。1200rpm離心IOmin收集細(xì)胞。用含有15%胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度2 X 105，細(xì)胞接種，37°C，5%C02，CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。(3)皮膚成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用無(wú)鈣鎂離子的PBS漂洗幾次，加入含有0. 25%胰酶和0. 02%EDTA的消化液消化，2-5min。 加入含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打終止消化，以1 3的比例傳代，置于37°C，5%C02, CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。2、胞質(zhì)與分化細(xì)胞融合
(1)取出分離好的胞質(zhì)，與培養(yǎng)好的成纖維細(xì)胞，再用無(wú)血清的DMEM洗兩次，分別離心并計(jì)數(shù)。在室溫條件下，按10 1在離心管中混合兩種細(xì)胞，然后離心lOmin，1000轉(zhuǎn) /min ο(2)去上清液，輕輕扣振離心管，使細(xì)胞沉渣散開(kāi)，用吸管滴入融合劑(50%聚乙二醇PEG溶液)，0. 5ml，旋轉(zhuǎn)離心管或用吸管尖輕輕攪拌，盡可能增加細(xì)胞暴露、接觸PEG的機(jī)石。(3)連續(xù)滴加10次無(wú)血清培養(yǎng)液后(融合過(guò)程不超過(guò)6 7 min)，離心去上清，再加 IOml含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液懸浮，離心lOmin。(4)去上清的細(xì)胞沉渣，用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液洗兩次后，再懸浮。并在37°C、 5%C02、飽和濕度的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)概況。并記錄拍照。四、培養(yǎng)所獲上述雜質(zhì)細(xì)胞以產(chǎn)生造血干細(xì)胞。在上述(四)步驟前，還可以采用如下步驟將所述胞質(zhì)雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)層上擴(kuò)增，飼養(yǎng)層可以為胎盤貼壁細(xì)胞飼養(yǎng)層。一、胎盤貼壁細(xì)胞飼養(yǎng)層的制作
1、無(wú)菌條件下分離健康足月產(chǎn)新生兒新鮮胎兒胎盤絨毛膜小葉組織，用D-Hank’s液反復(fù)沖洗，將絨毛膜組織剪碎，胰酶-EDTA 4°C消化過(guò)夜；
2、將組織塊置于含有15%血清、2mM/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素，10(^g/ml鏈霉素的α -MEM培養(yǎng)基中，在5% CO2、飽和濕度、37 °C條件下培養(yǎng)。3、每隔3 4 d換液一次，待細(xì)胞融合達(dá)70 80%時(shí)，常規(guī)消化后按1 2傳代，培養(yǎng)皿底部放置玻片并用明膠包被，取傳代3次以上的細(xì)胞進(jìn)行免疫檢測(cè)及誘導(dǎo)分化鑒定，絲裂霉素處理待用。二、雜質(zhì)細(xì)胞在胎盤貼壁細(xì)胞飼養(yǎng)層上的擴(kuò)增
將雜質(zhì)細(xì)胞置于上述飼養(yǎng)層上，接種于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)液內(nèi)含IOml IMDM，在37°C， 5%C02，飽和濕度下培養(yǎng)擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖1所示。圖1是融合后造血干細(xì)胞⑶34+細(xì)胞體外培養(yǎng)的各階段形態(tài)學(xué)特征，其中 A 造血干細(xì)胞⑶34+細(xì)胞體外培養(yǎng)2d，可見(jiàn)細(xì)胞分裂GOO X)；
B 造血干細(xì)胞⑶34+細(xì)胞體外培養(yǎng)3d，可見(jiàn)細(xì)胞簇形成GOO X)；
C、D 造血干細(xì)胞⑶34+細(xì)胞體外培養(yǎng)6d，可見(jiàn)致密細(xì)胞集落形成QOO X)；
E、F 造血干細(xì)胞⑶；34+細(xì)胞體外培養(yǎng)10d，可見(jiàn)CFU-GEMM形成(100X)。
權(quán)利要求
1.一種從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法，包括以下步驟a、從胎盤中獲取造血干細(xì)胞；b、將造血干細(xì)胞去核，獲取胞質(zhì)；C、將所獲胞質(zhì)與分化細(xì)胞進(jìn)行融合，以產(chǎn)生胞質(zhì)雜種細(xì)胞； d、培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種細(xì)胞以產(chǎn)生造血干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法，其特征是，包括在d 步驟前將所述胞質(zhì)雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)層上擴(kuò)增的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法，其特征是，所述飼養(yǎng)層為胎盤貼壁細(xì)胞飼養(yǎng)層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法，其特征是，所述分化細(xì)胞包括皮膚成纖維細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從分化細(xì)胞制備自體造血干細(xì)胞的方法，包括a、從胎盤中獲取造血干細(xì)胞，b、將造血干細(xì)胞去核獲取胞質(zhì)，c、將所獲胞質(zhì)與分化細(xì)胞進(jìn)行融合，以產(chǎn)生胞質(zhì)雜種細(xì)胞，d、培養(yǎng)所述胞質(zhì)雜種細(xì)胞以產(chǎn)生造血干細(xì)胞等步驟，本發(fā)明利用了胞質(zhì)互作原理，將造血干細(xì)胞分離心去核后和成纖維細(xì)胞核相互作用，對(duì)細(xì)胞核重編程，產(chǎn)生融合造血干細(xì)胞，可以構(gòu)建與患者HLA配型一致的融合雜合造血干細(xì)胞，可以作為臨床移植造血干細(xì)胞的一個(gè)新的來(lái)源，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)方便，為白血病等疾病的治療提供了新的基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，更為臨床產(chǎn)生患者自體造血干細(xì)胞提供了一個(gè)新的方式。
文檔編號(hào)C12N15/07GK102321571SQ20111028111
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者王躍嗣 申請(qǐng)人:王躍嗣