專利名稱：：造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及利用STR檢測造血干細(xì)胞移植后的嵌合狀態(tài)的診斷試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：造血干細(xì)胞是血液成分之一，是生成各種血細(xì)胞的最起始細(xì)胞，又稱造血多能干細(xì)胞，存在于骨髓、胚胎肝、外周血及臍帶血中。它既具有高度自我更新能力，又具有進(jìn)一步分化各系統(tǒng)祖細(xì)胞的能力。近代輸血就利用這兩種能力，對受血者用放射或大劑量化學(xué)藥物使其免疫系統(tǒng)受抑后輸入獻(xiàn)血者的造血干細(xì)胞，讓它在受血者骨髓內(nèi)留存并分化增殖，這即是造血干細(xì)胞移植。造血干細(xì)胞移植現(xiàn)正日益廣泛地用于白血病、許多惡性腫瘤及某些遺傳性疾病的治療，由于造血干細(xì)胞可從骨髓、外周血、臍血、胎肝獲得，因此臨床上出現(xiàn)了骨髓移植、外周血干細(xì)胞移植、臍血細(xì)胞及胎肝移植，而根據(jù)造血干細(xì)胞的來源又可以分為自體、異體同基因(如雙胞胎)、以及異基因(如父母、同胞或無血緣關(guān)系的供者)移植。隨著移植理論和技術(shù)的發(fā)展及骨髓庫的完善，異基因造血干細(xì)胞移植在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。為判斷移植是否成功、監(jiān)控病人的復(fù)發(fā)情況并及時(shí)地實(shí)施免疫抑制治療、預(yù)后等，需要對移植后供者細(xì)胞在受者體內(nèi)的情況進(jìn)行檢測并觀察其變化趨勢，因此移植后動態(tài)檢測血細(xì)胞的嵌合狀態(tài)對判斷移植效果、實(shí)施臨床早期干預(yù)治療具有重要的意義。從遺傳學(xué)上說，異基因的供受者血細(xì)胞嵌合體本質(zhì)上是兩個(gè)不同基因型個(gè)體細(xì)胞的混合。因此，利用染色體上的遺傳標(biāo)記可以區(qū)分供受者細(xì)胞并對供受者細(xì)胞比例進(jìn)行定量分析。傳統(tǒng)的嵌合體分析手段包括基于第一代和第二代遺傳標(biāo)記檢測的RFLP-PCR和VNTR/STR-PCR技術(shù)，以及基于染色體片段分析的FISH技術(shù)，由于FISH僅能用于性別不合的供受者，因此其應(yīng)用局限性較大。短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemr印eat，STR)是基因組染色體上的一些簡單重復(fù)序列，STR具有高度多態(tài)性和體細(xì)胞穩(wěn)定性，在家系中可以穩(wěn)定地遺傳,STR-PCR現(xiàn)己成為鑒別不同個(gè)體DNA的強(qiáng)有力的工具，最早在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于親子鑒定。由于該方法重復(fù)性好，敏感高效，因此已成為目前國際骨髓移植登記處推薦的檢4測供受嵌合狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)。由于尚未有專門的嵌合體分析試劑盒，目前通常采用親子鑒定試劑盒來實(shí)現(xiàn)STR-PCR技術(shù)在嵌合體分析中的應(yīng)用。以下為國際上最著名的親子鑒定試劑盒生產(chǎn)商-PE應(yīng)用生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品的試劑盒名稱和同時(shí)擴(kuò)增的位點(diǎn)AmpFlSTRCOfilerPCRAmplificationKit:D3S1358,D16S539，THOl，TP0X，CSF1P0，D7S820，Amelogenin;AmpFlSTRIdentifilerPCRAmplificationKit:CSF1P0,D2S1338,D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,D13S317,D16S539,D18S51,D19S433,D21S11,FGA，THOl，TP0X，vWA，Amelogenin;AmpFCSTRMiniFilerPCRAmplificationKit:D8S1179,D3S1358,THOl,D19S433,vWA,D5S818,TPOX;AmpFlSTRProfilerPlusIDPCRAmplificationKit:D3S1358,vWA，F(xiàn)GA,D8S1179,D21S11,D18S51,D5S818,D13S317,D7S820,Amelogenin.AmpFfSTRProfilerPlusPCRAmplificationKit:D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,D13S317,D18S51,D21S11,FGA，andvM.;A即FfSTR⑧ProfilerPCRAmplificationKit:CSFIPO，D3S1358,D5S818,D7S820,D13S317,FGA,THOl,TPOX,andvWAAmpFlSTRSEfilerPCRAmplificationKit:D2S1338'D3S1358,D8S1179,D16S539,D18S51,D19S433,D21S11,SE—33，F(xiàn)GA,vWAAmpFlSTRSGMPlusPCRAmplificationKit:D2S1338,D3S1358,D8S1179,D16S539,D18S51,D19S433，D21S11，TH01，F(xiàn)GA'vWAAmpF￡STRSinofilerPCRAmplificationKit:D8S1179,D21S11,D7S820,CSFIPO,D3S1358,D5S818,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA，D12S391,D18S51,Amelogenin,D6S1043,FGA這些試劑盒中會含有一些與嵌合率檢測無關(guān)的檢測位點(diǎn)如性別位點(diǎn)，而且，由于親子判斷是對多個(gè)位點(diǎn)的定性分析，與嵌合率分析要求定量不同，因此在STR位點(diǎn)選取時(shí)，其對信息性的要求也是有差異的，'而所謂的信息性是指在供受者對間一方具有另一方?jīng)]有的獨(dú)特條帶或稱為等位基因片段的案例占所有案例的百分比，獨(dú)特條帶需與其它條帶至少相差2個(gè)重復(fù)序列。信息性高表示說明能夠清楚地定量辨別出不同個(gè)體的能力，信息性低則表示清楚地定量辨別出不同個(gè)體的能力較弱。理想信息位點(diǎn)就是該位點(diǎn)上供受者間具有可明確分辨的條帶或片段，而且供受者間具有的所有條帶不會彼此影響，從而對計(jì)算嵌合率所需要的原始數(shù)值-電泳后產(chǎn)生與熒光信號對應(yīng)的峰高或峰面積產(chǎn)生影響。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)結(jié)合國際上已有的觀點(diǎn)，我們認(rèn)為一般理想信息位點(diǎn)需符合4個(gè)要求1、該位點(diǎn)為4個(gè)核苷酸的重復(fù)，2、供受者間至少有一個(gè)獨(dú)特的等位基因片段，3、獨(dú)特的等位基因滿足與雙方的其它任何等位基因的序列長度至少相差2個(gè)重復(fù)序列的條件，4、一方的任何等位基因序列長度都必須和另一方的等位基因序列長度不能只相差一個(gè)重復(fù)序列。親子檢測試劑盒中會包含一些信息性不夠高的位點(diǎn)和性別位點(diǎn)等，而且電泳遷移后位置類似的不同熒光標(biāo)記的等位基因片段的峰高或峰面積會彼此影響，這些位點(diǎn)的定量結(jié)果易受干擾。如果要采用親子鑒定試劑盒獲得嵌合率信息，需要同時(shí)擴(kuò)增多對引物，而不能只對某一個(gè)信息位點(diǎn)進(jìn)行追蹤檢測，而且由于信息性不夠高的位點(diǎn)也同時(shí)參與實(shí)驗(yàn)，浪費(fèi)了人力和財(cái)力，且其定量的精確性不夠高。當(dāng)不能得到信息位點(diǎn)時(shí)，也無法靈活增加其它可提供理想信息的位點(diǎn)。近年來，隨著嵌合體分析在白血病復(fù)發(fā)及白血病微殘余灶監(jiān)測上的廣泛應(yīng)用，臨床實(shí)踐對嵌合體分析技術(shù)的檢測靈敏度和定量的精確性也提出了更高的要求。以便于醫(yī)生更早地采取醫(yī)療干預(yù)措施以得到更良好的治療效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供造血干細(xì)胞移植后的嵌合狀態(tài)的診斷試劑盒及其檢測方法，解決現(xiàn)有試劑盒只能同時(shí)擴(kuò)增多對引物，不能在移植后只對信息位點(diǎn)進(jìn)行追蹤檢測；而且采用目前商品化試劑所沒有的引物對，這些引物對在供受者間提供信息性較高的試劑，因而適合拼裝單信息位點(diǎn)的檢測；可用于嵌合狀態(tài)的定量追蹤。本發(fā)明公開了一種造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒，試劑盒中含有下列STR位點(diǎn)的特異性引物D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481和D22S689，這些位點(diǎn)均為4bp的片段重復(fù)。本發(fā)明對已知的STR位點(diǎn)進(jìn)行了研究篩選，選擇出具有較高信息性且大部分為其它親子鑒定試劑盒所沒有的STR位點(diǎn)，這些STR位點(diǎn)均滿足重復(fù)片段為4bp。研究表明，符合這些條件的STR位點(diǎn)，用作嵌合率的定量分析時(shí)，干擾小，數(shù)據(jù)精準(zhǔn)度高，并適合亞洲人群。所述STR位點(diǎn)的特異性引物為經(jīng)熒光標(biāo)記的特異性引物。優(yōu)選的，上述STR位點(diǎn)對應(yīng)的特異性引物為SEQIDNO.1-SEQIDNO.16。各特異性引物與STR位點(diǎn)的對應(yīng)關(guān)系如下表所列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>為了方便在確定供受者之間的信息位點(diǎn)后，只對信息位點(diǎn)進(jìn)行跟蹤，本發(fā)明的試劑盒中，各STR位點(diǎn)對應(yīng)的特異性引物分別獨(dú)立包裝(如分裝在不同的小包裝中)。除引物外，試劑盒中還可包括dNTP、Mg"或Taq-Gold酶等PCR常用試劑，試劑盒也可僅包含引物，在使用時(shí)與另購的其他PCR常用試劑配合使用。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了上述造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒的使用方法，包括下列步驟1.分別以骨髓移植術(shù)前供者及受者的造血干細(xì)胞DNA為模板，用試劑盒中的所有引物分別PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后上遺傳分析儀的毛細(xì)管電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確定等位基因；根據(jù)得到的供受者的等位基因，確定理想信息位點(diǎn)。2.以移植后受者的造血干細(xì)胞DNA為模板，用步驟1確定的理想信息位點(diǎn)對應(yīng)的引物PCR擴(kuò)增；3.將步驟2獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后，上遺傳分析儀的毛細(xì)管電泳，取得擴(kuò)增產(chǎn)物對應(yīng)的峰高或峰面積數(shù)據(jù)，并據(jù)此計(jì)算嵌合率。上述步驟l中的理想信息位點(diǎn)是指符合l、供受者間至少有一個(gè)獨(dú)特的等位基因片段，2、獨(dú)特的等位基因滿足與雙方的其它任何等位基因的序列長度至少相差2個(gè)重復(fù)序列的條件，3、除獨(dú)特等位基因片段外，一方的任何等位基因的序列長度和另一方的任何等位基因序列長度至少相差2個(gè)重復(fù)序列或相同。在將試劑盒中的所有引物分別PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后上遺傳分析儀的毛細(xì)管電泳后，對應(yīng)同一信息位點(diǎn)擴(kuò)增的產(chǎn)物片段，供者和受者會出現(xiàn)不同的出峰情況，毛細(xì)管電泳時(shí)顯示出峰的位置不同且對應(yīng)至少相差l個(gè)重復(fù)單元的分子量的峰為不同的峰，反之則為相同的峰。如果對應(yīng)同一信息位點(diǎn)擴(kuò)增的產(chǎn)物片段，不同的峰對應(yīng)至少相差2個(gè)重復(fù)單元的分子量，則產(chǎn)生這些峰的位點(diǎn)滿足之前的條件1和2，可視為信息位點(diǎn)，如果除了這些峰以外，供者或受者在該位點(diǎn)產(chǎn)生的其它峰，都沒有與另一方的任何峰只相差一個(gè)重復(fù)單元，則該信息位點(diǎn)還滿足條件3，可進(jìn)一步被視為理想信息位點(diǎn)，可單獨(dú)用于移植后嵌合率的追蹤檢測。如某位點(diǎn)上供者為16，18兩個(gè)等位基因，受者為13，19兩個(gè)等位基因，則滿足條件1和2，有兩個(gè)獨(dú)特的等位基因13，16，但是由于18，19只相差一個(gè)重復(fù)片段大小，且分屬于不同個(gè)體，就不符合要求3，該位點(diǎn)就不符合理想信息位點(diǎn)的要求。但是需要注意的是，對于條件3的判斷，至少相差2個(gè)重復(fù)序列的要求是針對不同方提出的，只相差一個(gè)重復(fù)片段大小的2個(gè)等位基因均屬于同一方，且與另一方的片段都至少相差2個(gè)片段，則仍符合理想信息位點(diǎn)要求。如某位點(diǎn)上供者為16、17兩個(gè)等位基因，受者為13、19兩個(gè)等位基因，則滿足條件1和2，13、19為獨(dú)特等位基因，16、17兩個(gè)等位基因不能算作獨(dú)特等位基因，但與另一方的片段都至少相差2個(gè)片段，所以也滿足條件3的要求，所以該位點(diǎn)符合理想信息位點(diǎn)要求。上述步驟1和步驟2中PCR擴(kuò)增的條件為95°C，8min;94°C,lmin，65°Clmin，72°C，lmin，2個(gè)循環(huán)；94°C,lmin,61°Clmin，72。C，'lmin，2個(gè)循環(huán)；894。C'lmin,58°Clmin，72。C,lmin,25循環(huán)；94°C,lmin'55°Clmin，72°C,lmin'5循環(huán)；60°C，10min。上述步驟2中，移植后標(biāo)本只需擴(kuò)增理想信息位點(diǎn)，只需加入理想信息位點(diǎn)的引物。上述嵌合率即指移植后的受者外周血細(xì)胞中來源于供者造血干細(xì)胞所占的比例。受者源性細(xì)胞所占比例稱為殘留率，嵌合率+殘留率=1。由于人的染色體是成對的，對應(yīng)一個(gè)STR位點(diǎn)，同一對染色體上，兩條染色體的序列可能相同，也可能不同，因此，對應(yīng)一個(gè)STR位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，毛細(xì)管電泳時(shí)可能出現(xiàn)一個(gè)或兩個(gè)峰，根據(jù)與毛細(xì)管電泳時(shí)同時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)物比對，可以獲知被檢測個(gè)體的等位基因是對應(yīng)多少重復(fù)序列的分子量大小的片段，并根據(jù)熒光的強(qiáng)弱，獲得出現(xiàn)片段處的峰的面積和峰高。對應(yīng)不同的情況，嵌合率的計(jì)算公式分別如下當(dāng)供者與受者對應(yīng)一個(gè)信息位點(diǎn)各有兩個(gè)峰，且供受者間只有一個(gè)峰不同，另一個(gè)峰相同時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為(dA)/(rA+dA);相同的峰在計(jì)算時(shí)不計(jì)入內(nèi)當(dāng)供者有兩個(gè)峰dAl,dA2，受者有兩個(gè)峰rAl，rA2，各峰均不同時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為(dAl+dA2)/(rAl+rA2+dAl+dA2);當(dāng)供者有兩個(gè)峰dAl,dA2，受者只有一個(gè)峰rAl,各峰均不同時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為卜((2XrAl)/(2XrAl+dAl+dA2))或(dAl+dA2)/(2XrAl+dAl+dA2);當(dāng)受者有兩個(gè)峰rAl，rA2，供者有一個(gè)峰dAl，各峰均不同時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為(2XdAl)/(2XdAl+rAl+rA2);當(dāng)供者與受者對應(yīng)一個(gè)信息位點(diǎn)均只有一個(gè)峰時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為dAl/(rAl+dAl)。上述公式中，r代表受者，d代表供者，A:表示峰高或峰面積。不同的峰指供者和受者對應(yīng)同一信息位點(diǎn)擴(kuò)增的產(chǎn)物片段，其毛細(xì)管電泳時(shí)顯示出峰的位置不同，且對應(yīng)至少相差1個(gè)重復(fù)序列的分子量的峰。反之則為相同的峰。本專利所用的大部分位點(diǎn)都是現(xiàn)有親子鑒定的產(chǎn)品中所欠缺的，這些位點(diǎn)可拼裝也可單獨(dú)檢測，而且信息性也比較高，可以靈活用于信息位點(diǎn)的追蹤以及作為其它產(chǎn)品的補(bǔ)充，9解決了目前產(chǎn)品只能擴(kuò)增全部位點(diǎn)的弊病，可以只需擴(kuò)增理想信息位點(diǎn)，用于追蹤嵌合率的變化，因而更經(jīng)濟(jì)，結(jié)果檢測更簡單明了，避免了不同熒光的彼此干擾，所以更適合于嵌合物的定量分析。并且可以作為疑難親子鑒定的補(bǔ)充試劑，或司法鑒定時(shí)的補(bǔ)充試劑盒。圖1:供受者間不同濃度混合樣品用D22S689STR檢測到的混合比例標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)表示的是檢測樣品中混入的受者供者DNA比例，縱坐標(biāo)是本試劑盒檢測出的混入的受者供者DN八比例數(shù)據(jù)，Rawdata表示沒有經(jīng)過校正得到的原始受者供者DNA比例(殘留率)，因?yàn)閮x器測量DNA含量可能有偏差，需要根據(jù)50%混入時(shí)的原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)學(xué)模型校正，Calibrated表示本試劑盒檢測出的經(jīng)數(shù)學(xué)模型校正的受者供者的DNA比例，Expected表示理論上預(yù)期應(yīng)該得到的受者供者的DNA比例?？梢园l(fā)現(xiàn)Calibrated與Expected基本重合，說明測出的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果基本一致。圖2:D4S2366位點(diǎn)提示一例病人的嵌合率變化提示復(fù)發(fā)A:供者格局，B:病人移植后30天的格局C:病人移植后170天的格局由圖可以看出30天時(shí)病人的格局已經(jīng)與供者的格局一致(124，132)，說明已經(jīng)植入91.54%，但到170天時(shí)病人自身的格局回復(fù)為自身格局為主體(116)，嵌合率跌至為20.11%，提示復(fù)發(fā)。圖3:D22S689格局變化提示病人的異基因造血干細(xì)胞已經(jīng)植入A:7天，嵌合率0%B:14天，嵌合率9.21%C:21天，嵌合率95.1%D:27天，嵌合率95.7%結(jié)果表明，7天時(shí)病人只有自己的格局(206，210)，14天時(shí)供者的格局(194，222)逐漸呈現(xiàn)，而21天起病人體內(nèi)細(xì)胞大部分為供者源性的細(xì)胞，27天時(shí)供者源性的細(xì)胞依然為主，未復(fù)發(fā)。黑色三角為分子量定位標(biāo)志。具體實(shí)施例方式以下列舉具體實(shí)施例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解實(shí)施例并非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1STR位點(diǎn)的篩選對亞洲人的造血干細(xì)胞DNA進(jìn)行STR位點(diǎn)信息性的分析，試驗(yàn)方法1、在獲得病人知情同意后，抽取16例骨髓造血干細(xì)胞移植的病人及其供者的外周血2ML，其中5例為非血緣關(guān)系的供受者對，ll例為同胞之間的供受者對。根據(jù)天根全血DNA抽提試劑盒(天根公司，中國北京)說明書，抽取基因組DNA。測定DNA濃度(核酸蛋白檢測儀，Eppendorf,德國)后，稀釋成10ug/mL，分裝保存。2、分別用TAMRA、FAM、HEX分別標(biāo)記合成不同引物(委托上海生工)，用于擴(kuò)增。擴(kuò)增位點(diǎn)見表l。3、PCR擴(kuò)增擴(kuò)增體系為20uL，包含0.2mMdNTP，2mMMg2+，4uM引物，Taq-Gold(應(yīng)用生物科技公司-PE公司，美國)l個(gè)單位，10ug/mLDNAl-2uL，于PE9600擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。每個(gè)供者或受者各擴(kuò)增8管，每管內(nèi)只有一對引物。擴(kuò)增參數(shù)為95'C，8min;94。C,1min,65°C1min，72。C,1min;2個(gè)循環(huán)；94。C,1min,61°C1min,72°C,1min,2個(gè)循環(huán)；94。C,lmin，58。Clmin,72。C，lmin，25循環(huán)；94。C，lmin,55。Clmin，72。C,lmin，5循環(huán)；60°C，10min。4、擴(kuò)增結(jié)束后于1.5%瓊脂糖電壓100V,30分鐘電泳,確認(rèn)擴(kuò)增成功后，進(jìn)入下一步分析。5、上述各位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物等量合并成l管后,取luL,加入luL甲酰胺變性劑和R0X-500內(nèi)標(biāo)(由16條帶有R0X熒光素標(biāo)記的雙鏈DNA片段組成，分子量分別是70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500bp，可用作分子量標(biāo)準(zhǔn)物)后，95。C2分鐘后于4。C5分鐘，于ABI3100遺傳分析儀(ABI，美國)上電泳。6、根據(jù)熒光信號確定擴(kuò)增片段位置，與分子量標(biāo)記物比對，確定片段分子量大小，從而確認(rèn)該位點(diǎn)的等位基因。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Genescangenotype軟件收集分析。7、總結(jié)每對供受者間不同位點(diǎn)的等位基因，計(jì)算信息性、供者信息性、受者信息性、理想位點(diǎn)信息性。信息性計(jì)算為供受者對間某一方在某個(gè)位點(diǎn)中至少具有一條另一方?jīng)]有的等位基因，而且這個(gè)等位基因與其它等位基因之間至少相差2個(gè)重復(fù)片段，即具有獨(dú)特的等位基因案例占所有檢測案例的比例；、供者信息性為供受者對間供者至少具有一條另一方?jīng)]有的等位基因，該等位基因與其它等位基因之間至少相差2個(gè)重復(fù)片段的案例占所有檢測案例的比例；受者信息性則計(jì)算供受者對間受者至少具有一條獨(dú)特等位基因案例占所有檢測案例的比例。11理想位點(diǎn)的信息性計(jì)算符合理想信息位點(diǎn)的案例占所有案例的百分比，理想信息位點(diǎn)即在符合信息性計(jì)算的基礎(chǔ)上，除了具有獨(dú)特的等位基因外，其它的任何等位基因片段與另一個(gè)體的片段在序列長度上不能只相差l個(gè)重復(fù)片段，但同一個(gè)體的2個(gè)片段可以只相差1個(gè)重復(fù)片段。8、根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟7，統(tǒng)計(jì)計(jì)算歷年來由上海司法鑒定研究所用PE公司親子鑒定試劑盒得到的16例移植供受者的各位點(diǎn)的信息性，并列于表2。其中2對為同胞，14對為非血緣關(guān)系的供受者對。試驗(yàn)結(jié)果1、本研究配置的STR位點(diǎn)信息性總結(jié)如表1。表1本研究試制的試劑盒STR位點(diǎn)信息性的分析結(jié)果位點(diǎn)電泳條帶引物序列信息性供者信息性受者信息性理想位點(diǎn)信息性D3S3045172-2005，TAMRA-ACCAAATGAGACAGTGGCAT.0.750.630.50.383，ATGAGGACGGTTGACATCTGD4S2366112-1405，HEX-TCCTGACATTCCTAGGGTGA0.870.730.870.193，AAAACAAATATGGCTCTATCTATCGD4S2639160-2005，F(xiàn)AM-AAGGTTCCAGGACACATTCA0.620.540.460.393，CTTGAAAGCTCCATAATCATACGD5S818126-1665，TAMRA-GGGTGATTTTCCTCTTTGGT0.530.530.470.063':TGATTCCAATCATAGCCACAD13S317171-2035，HEX-ACAGAAGTCTGGGATGTGGA0.870,730.730.383，GCCCAAAAAGACAGACAGAA12D18S1002282-3145，TAMRA-CAAAGAGTGAATGCTGTACAAACAGC0.850,850.850.233':CAAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAGD20S481213-2735，TAMRA-TGGGTTATGAGTGCACACAG0.770,620.540.313，AACAGCAAAAAGACACACAGCD22S689198-2305，F(xiàn)AM-TATGTACAGACCTGCAACTTGC0.850.690.770.313,:CCTGCCTGCCTATCTATCTG2、總結(jié)以往的用現(xiàn)有的PE公司試劑盒得到的信息性于表2。表2、PE公司試劑盒分析移植病人得到的位點(diǎn)信息性位點(diǎn)信息性供者信息性受者信息性理想位點(diǎn)信息性D8S11790.470.470.470.20D21S110.130.130.130D7S8200.630.380.630.5CSF1P00.190.190.130.13D3S13580.310.250.190.19■10.500.250.420.42D16S5390.440.380.380.25D2S13380.630.500.630.38D19S4330.130.130.130vWA0.470.330.470.33TPOX0.460.230.310.38D18S510.560.500.560.38FGA0.560.560.500.3813表2中所列的位點(diǎn)大部分為目前最權(quán)威法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別檢測試劑盒AmpFlSTRIdentifilerPCRAmplificationKit所具有的.由于Amelogenin為性別位點(diǎn)，不能提供信息性，所以未列入表2中3、比較表1、表2，表1中的信息性普遍高于表2，而表1、表2平均理想位點(diǎn)信息性分別為0.28、0.27,無明顯差距.可能是由于本試劑盒的對象具有較多的遺傳特征類似的同胞移植供受者對，而PE試劑盒的研究對象多數(shù)為無血緣關(guān)系的供受者對,導(dǎo)致了本試劑盒信息性高,但理想信息性與本試劑盒的信息信相比要低很多。但至少說明本研究選用的位點(diǎn)信息性不低于現(xiàn)有的最權(quán)威的商品化親子鑒定試劑盒所選用的位點(diǎn)。實(shí)施例2試劑盒的裝配分別合成SEQIDNO.1-SEQIDNO.16的引物。對所有編號為奇數(shù)的正向引物均采用5，熒光標(biāo)記TAMRA或FAM或HEX,具體見表1，。將標(biāo)記好的不同引物分別裝厶不同的0.5mL塑料管中，密封避光后裝入試劑盒，完成試劑盒的裝配。實(shí)施例3試劑盒檢測嵌合率的準(zhǔn)確率評估試驗(yàn)方法1.在例1的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上隨機(jī)選用一例供受對的樣品，確定理想信息位點(diǎn)為D22S689STR位點(diǎn)，受者具有16，17等位基因，供者具有13，20等位基因。2.受者移植前的DNA、供者DNA均放置于37°C30分鐘，DNA濃度預(yù)先調(diào)整為10ug/mL。3.梯度樣品制備等體積混合上述的DNA，配制50%供者受者DNA，并作為梯度樣品的起始品，分別依次與供者的DNA混合，形成75%、87.5%、93.75%、96.8%、98.4%、99.2%的嵌合率的梯度樣品；50%供者受者DNA混合樣品作為起始樣品，分別依次與受者移植前DNA混合，形成25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%、0.8%的嵌合率的梯度樣品。75M的嵌合樣品制備是等體積混合5(^樣品和供者DNA，62.5%樣品是用75%樣品等體積混合受者移植前DNA，37.5%的樣品是等體積混合50%樣品和受者移植前0船。整個(gè)梯度樣品R/DDNA包括0呢(即移植前受者DNA)、0.8%、1.56%、3.13%、6.25%、12.5%、25%、37.5%、50%、62.5%、75%、87.5%、93.75%、96.8%、98.4%、99.2%、100%(即供者DNA)。144、PCR擴(kuò)增擴(kuò)增體系為20uL，包含0.2mMdNTP，2mMMg2+,4uMSEQIDNO.15和SEQIDNO.16，Taq-Gold(應(yīng)用生物科技公司,美國)l個(gè)單位，DNA1-2uL，于PE9600擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。5、擴(kuò)增參數(shù)為95'C,8min;94。C,lmin,65。Clmin,72。C,lmin，2個(gè)循環(huán)；94。C，1min,61°C1min,72。C,1min,2個(gè)循環(huán)；94。C,1min,58°C1min，72。C,1min,25循環(huán)；94。C,1min,55°C1min,72。C,1min,5循環(huán)；60°C，10min。6、取上述擴(kuò)增產(chǎn)物luL,加入luL甲酰胺變性劑和R0X-500內(nèi)標(biāo)(分子量標(biāo)記物)后95。C2分鐘后于4'C5分鐘，于ABI3100遺傳分析儀(ABI，美國)上電泳。7、根據(jù)熒光信號確定擴(kuò)增片段位置，與分子量標(biāo)記物比對，確定片段分子量大小，從而確認(rèn)該位點(diǎn)的等位基因，并與例1中該供受者的D22S689的結(jié)果進(jìn)行對照，確認(rèn)梯度樣品在13，16，17，20等位基因?qū)?yīng)的片段大小處出現(xiàn)條帶，說明樣品無誤，繼續(xù)以下實(shí)驗(yàn)。8、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Genescangeotype軟件收集，得到峰高和峰面積。9、計(jì)算嵌合率選用當(dāng)供者有兩個(gè)峰dAl,dA2，受者有兩個(gè)峰rAl，rA2，各峰均不同時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為(dAl+dA2)/(rAl+rA2+dAl+dA2);分別用峰面積和峰高計(jì)算，此時(shí)dAl,dA2對應(yīng)13、20等位基因的峰，rAl，rA2對應(yīng)16、17等位基因的峰。得到不同梯度樣品對應(yīng)的嵌合率。10、嵌合率的校正由于DNA濃度測定在不同儀器上會有些差異，這些差異可能會使檢測到的濃度與實(shí)際濃度有偏移,本研究嘗試用數(shù)學(xué)模型對這些偏移進(jìn)行校正。設(shè)DNA濃度校正系數(shù)為X，，r代表受者，d代表供者，A:表示峰高或峰面積(dAl+dA2)XX/(rAl+rA2+(dAl+dA2)XX)=0.5,即X=(rAl+rA2)/(dAl+dA2)，此時(shí)rA和dA對應(yīng)的是理論上50%混合的梯度樣品時(shí)各峰的峰高或峰面積，計(jì)算得到DNA濃度校正系數(shù)X;1-(dAl+dA2)XX/(rAl+rA2+(dAl+dA2)XX)即為校正后的殘留率，(dAl+dA2)XX/(rAl+rA2+(dAl+dA2)XX)為校正后的嵌合率；計(jì)算梯度樣品中其它各濃度時(shí)的供者或受者的峰高或峰面積，填入上述公式，即可得到梯度樣品中各濃度對應(yīng)的校正殘留率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、根據(jù)步驟10計(jì)算得到校正殘留率，繪制梯度樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1。2、根據(jù)峰高與蜂面積分別計(jì)算得到嵌合結(jié)果，列于表3。從表3中可觀察到峰高與蜂面積分別得到的嵌合率非常接近，用得到的原始數(shù)據(jù)計(jì)算兩者的相關(guān)系數(shù)ri.999979，在其它標(biāo)本中也得到類似結(jié)果，說明用峰高或峰面積都可以計(jì)算，不影響結(jié)果的判讀，有些研究者傾向于用峰面積來計(jì)算，但在我們的數(shù)據(jù)中沒有觀察到兩者有明顯差異，經(jīng)過校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的值與期望值差距基本小于0.015，提示檢測誤差率小于1.5%。每組的變異系數(shù)(CV)也均小于5%，校正的峰高組和峰面積組分別為0.77%和1.704%。說明本試劑盒檢測嵌合率具有較高的準(zhǔn)確性和精確性。表3根據(jù)峰高和峰面積計(jì)算得到的結(jié)果比較_經(jīng)校正的計(jì)算峰經(jīng)校正的計(jì)算峰~非校正的計(jì)算峰已知比例高得到的的殘留非校正的計(jì)算峰面積得到的的殘面積得到的殘留R/DDNA率高得到的殘留率留率率0細(xì)％0.000%'0.000%0.000%0.000%0.780%0.855%1.177%0.711%0.980%1.560%1.367%1.879%1.208%1.661%3.125%3.306%4,510%2.821%3.855%6.250%6.770%9.115%6.417%8.651%12.500%13.174%17.326%12.959%17.056%25細(xì)％26.427%33.161%26.172%32.8700/o37.500%37.433%,45.246%37.723%45.553%50扁％50細(xì)％57.997%50.520%58.510%62,500%62.299%69.534%62.343%69.574%75.000%74.612%80.234%74.626%80.246%87.500%87.954%90.979%88駕0/091.746%93.750%92.588%94.522%93.291%95.051%96"00%97.582%98.238%98.238%98.718%98.400%99.117%99.359%99.325%99.510%99.220%謂細(xì)％100細(xì)％100扁％100.000%CV0.7700/03.911%1.704%4.007%已知比例R/DDNA:按照試驗(yàn)方法步驟2制備的人為混合供受者的DNA梯度樣品實(shí)施例4試劑盒的實(shí)際應(yīng)用1本試劑盒可有效檢出移植病人的移植后的嵌合變化，從而提示移植物究竟為植入或排1.供者與受者外周血DNA的獲得在得到知情同意后，抽取移植病人l移植前、移植后7，14，21，27，30，170天以及供者外周血2mL，根據(jù)天根全血DNA抽提試劑盒(天根公司，中國北京)說明書，抽取基因組DNA。測定DNA濃度(核酸蛋白檢測儀，Eppendorf,德國)后，稀釋成10ug/mL，分裝保存。2.分別以移植前供者與受者的DNA為模板，取實(shí)施例2制得的試劑盒中的各對引物，分別PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系0.2mMdNTP，2mMMg2+，4uM引物，Taq-Gold酶1個(gè)單位以及10ugDNA，終體積為20uL。PCR反應(yīng)條件:95。C，8min;94°C,lmin，65°Clmin,72°C，lmin，2個(gè)循環(huán)；94°C，lmin，61°Clmin，72°C，lmin'2個(gè)循環(huán)；94°C，lmin，58°Clmin，72°C，lmin，25循環(huán)；94°C,lmin,55°Clmin,72°C，lmin，5循環(huán)；60°C，10min。3.將來自同一供者的所有PCR產(chǎn)物各取luL混合，取混合產(chǎn)物luL加入luL甲酰胺變性劑和ROX-500內(nèi)標(biāo)(由16條帶有ROX熒光素標(biāo)記的雙鏈DNA片段組成，分子量分別是70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500bp,可用作分子量標(biāo)準(zhǔn)物)后95。C2分鐘后于4'C5分鐘，于ABI3100遺傳分析儀(ABI，美國)上電泳，獲得供者的擴(kuò)增格局，同樣方法獲得受者的擴(kuò)增格局，將供者與受者的擴(kuò)增格局進(jìn)行比對，擴(kuò)增格局提示D4S2366位點(diǎn)中，病人有一個(gè)峰116，供者有兩個(gè)峰124，132，符合理想信息位點(diǎn)的特征。4.移植后標(biāo)本只需擴(kuò)增信息位點(diǎn)，只需加入信息位點(diǎn)的引物。因此在移植后，僅對其移植后樣品追蹤D4S2366。以移植后受者的DNA為模板，用D4S2366對應(yīng)的引物擴(kuò)增，取luL上述PCR產(chǎn)物加入1uL甲酰胺變性劑和R0X-500內(nèi)標(biāo)后95。C2分鐘后于4°C5分鐘，于ABI3100遺傳分析儀上電泳，取得峰高和峰面積。擴(kuò)增格局如圖2所示5.嵌合率的計(jì)算，采用下列公式計(jì)算嵌合率(124峰面積+132峰面積)/(2X116峰面積+124峰面積+132峰面積)。由圖2可以看出30天時(shí)病人的格局巳經(jīng)與供者的格局一致(124，132)，己經(jīng)植入91.54%，但到170天時(shí)病人自身的格局回復(fù)為自身格局為主體(116)，嵌合率跌至為20.11%，提示復(fù)發(fā)。實(shí)施例5試劑盒的實(shí)際應(yīng)用217采用實(shí)施例2的試劑盒，采用與實(shí)施例4相同的方法，檢測另一對供者與受者。將供者與受者的擴(kuò)增格局進(jìn)行比對，擴(kuò)增格局提示D22S689位點(diǎn)中，病人有2個(gè)峰206、210，供者有2個(gè)峰194，222，符合信息位點(diǎn)的特征。在移植后，對其移植后樣品追蹤D22S689。以移植后受者的外周血細(xì)胞DNA為模板，用D22S689對應(yīng)的引物擴(kuò)增，取luL上述PCR產(chǎn)物加入1uL甲酰胺變性劑和ROX-500內(nèi)標(biāo)后95°C2分鐘后于4'C5分鐘，于ABI3100遺傳分析儀上電泳，取得峰高和峰面積。擴(kuò)增格局如圖3所示。嵌合率的計(jì)算，采用下列公式計(jì)算嵌合率(194峰面積+222峰面積)/(206峰面積+210峰面積+194峰面積+222峰面積)。圖3結(jié)果表明，7天時(shí)病人只有自己的格局(206，210)，14天時(shí)供者的格局(194，222)逐漸呈現(xiàn)，此時(shí)嵌合率為9.2%;而21天起病人體內(nèi)細(xì)胞大部分為供者源性的細(xì)胞，此時(shí)嵌合率為95.1%;27天時(shí)供者源性的細(xì)胞依然為主，嵌合率為95.8%，說明來自供者的造血干細(xì)胞的外周血細(xì)胞在受者體內(nèi)逐漸增加，植入成功，目前無復(fù)發(fā)。實(shí)施例5-19采用實(shí)施例2的試劑盒，采用與實(shí)施例4相同的方法，對15例病人移植后的追蹤檢測嵌合物，結(jié)果如下病例名移植后曰期嵌合物比例病例名移植后日期嵌合物比例RXR70%RWR70%149.21%14100%2195.06%2194.17%2795.78%9096.93%3097.50%18096.27%RWLR70%RCR1493.62%1598.64%2190.75%2296.14%2693.07%2690.04%3183.71%3091.54%18090.24%17020.11%36591.03%18RGR78.65%RGHR1488.73%1447.28%2191.44%2196.02%2793.96%2695.91%3390.47%3096.04%5192.52%RHR71.92%9291.19%21100%18094.24%26100%RYR70%30100%1464.63%180100%2199.09%RCZR1391.53%3098.36%25100%RSYR726.86%32100%1492.28%RMR770.12%2175.85%14100%2691.99%2197.37%腿1457.14%26100%21100%31100%2698.29%41100%30100%RYXR70%45100%21100%10094.47%26100%RWZR70%30100%1487.99%RSR2198.58%2188.63%27100%2690.04%33100%3091.65%48100%4093.12%90100%5592.68%180100%18094.36%上述結(jié)果說明的本發(fā)明試劑盒的成功運(yùn)用。序列表<110>上海市血液中心<120>造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒及其應(yīng)用〈130>PCNXY090121〈160〉16<170>Patentlnversion3.1〈210>1〈211>20〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223>引物〈400>1accaaatgagacagtggcat20〈210〉2〈211〉20〈212>廳<213〉artificialsequence〈220>〈223〉引物〈400〉2atgaggacggttgacatctg20<210>3〈211〉20〈212>■〈213〉artificialsequence<220〉〈223>引物〈400〉3tcctgacattcctagggtga20〈210>4<211〉25〈212〉DNA〈213>artificialsequence〈220>〈223〉引物〈400〉4aaaacaaatatggctctatctatcg25〈210〉5〈211〉20〈212〉腿〈213>artificialsequence〈220>〈223〉引物<400〉5aaggttccaggacacattca20〈210>6〈211>23〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220〉<223>引物〈400〉621cttgaaagctccataatcatacg23〈210〉7〈211>20〈212〉腿〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400>7gggtgattttcctctttggt20<210>8〈211〉20〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220>〈223〉引物<400>8tgattccaatcatagccaca20〈210〉9〈211>20〈212〉■〈213〉artificialsequence<220><223〉引物〈400〉9ac卿agtctgggatgtgga20〈210〉10〈211〉20〈212〉腿〈213〉artificialsequence<220><223>引物〈400〉10gcccaaaaagacagacagaa20〈210〉11<211〉26〈212〉廳〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉11caaagagtgaatgctgtacaaacagc26〈210>12〈211〉26〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉12caagatgtgagtgtgcttttcaggag26<210>13<211〉20〈212〉腿〈213〉artificialsequence23〈220>〈223>引物〈400>13tgggttatgagtgcacacag20<210〉14<211>21〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉14aacagcaaaaagacacacagc21〈210〉15〈211〉22〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉15tatgtacagacctgcaacttgc22〈210〉16〈211〉20〈212〉DNA<213>artificialsequence〈220〉〈223>引物〈400〉16cctgcctgcctatctatctg20權(quán)利要求1.一種造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒，試劑盒中含有下列STR位點(diǎn)的特異性引物D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481和D22S689。2.如權(quán)利要求1所述造血千細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒，其特征在于，所述STR位點(diǎn)的特異性引物選自SEQIDNO.1-SEQIDNO,16。3.如權(quán)利要求1所述造血千細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒，其特征在于，所述STR位點(diǎn)的特異性引物經(jīng)熒光標(biāo)記。4.如權(quán)利要求1所述造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒，其特征在于，所述各STR位點(diǎn)對應(yīng)的特異性引物分別獨(dú)立包裝。5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括獨(dú)立包裝的dNTP、Mg"或Taq-Gold酶中的一種或多種試劑。6.如權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒的使用方法，包括下列步驟a.分別以骨髓移植術(shù)前供者及受者的外周血細(xì)胞DNA為模板，用試劑盒中的所有引物分別PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后上遺傳分析儀的毛細(xì)管電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確定等位基因；根據(jù)得到的供受者的等位基因，確定理想信息位點(diǎn)；b.以移植后受者的外周血細(xì)胞DNA為模板，用步驟a確定的理想信息位點(diǎn)對應(yīng)的引物PCR擴(kuò)增；c.將步驟b獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后，上遺傳分析儀的毛細(xì)管電泳，取得擴(kuò)增產(chǎn)物對應(yīng)的峰高或峰面積數(shù)據(jù)，并據(jù)此計(jì)算嵌合率。7.如權(quán)利要求6所述造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒的使用方法，其特征在于，所述理想信息位點(diǎn)符合下列條件供受者間至少有一個(gè)獨(dú)特的等位基因片段；獨(dú)特的等位基因滿足與雙方的其它任何;等位基因的序列長度至少相差2個(gè)重復(fù)序列的條件；一方的任何等位基因的序列長度和另一方的任何等位基因序列長度至少相差2個(gè)重復(fù)序列的STR位點(diǎn)。8.如權(quán)利要求6所述造血千細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟a和步驟b中PCR擴(kuò)增的條件為95。C,8min;94°C，lmin,65°Clmin，72°C，lmin,2個(gè)循環(huán)；94°C,lmin，61°Clmin，72°C,lmin,2個(gè)循環(huán)；94°C,lmin，58°Clmin，72°C，lmin,25循環(huán)；94°C，lmin，55°Clmin，72°C，lmin，5循環(huán)；60°C，10min。9.如權(quán)利要求6所述造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟c對應(yīng)不同的情況，嵌合率的計(jì)算公式分別如下當(dāng)供者與受者對應(yīng)一個(gè)信息位點(diǎn)各有兩個(gè)峰，且供受者間只有一個(gè)峰不同，另一個(gè)峰相同時(shí)，相同的峰不予考慮，嵌合率計(jì)算公式為(dA)/(rA+dA);當(dāng)供者有兩個(gè)峰dAl，dA2，受者有兩個(gè)峰rAl，rA2，各峰均不同時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為(dAl+dA2)/(rAl+rA2+dAl+dA2);當(dāng)供者有兩個(gè)峰dAl,dA2，受者只有一個(gè)峰rAl，各峰均不同時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為l-((2XrAl)/(2XrAl+dAl+dA2))或(dAl+dA2)/(2XrAl+dAl+dA2);當(dāng)受者有兩個(gè)峰rAl，rA2，供者有一個(gè)峰dAl，各峰均不同時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為(2XdAl)/(2XdAl+rAl+rA2);當(dāng)供者與受者對應(yīng)一個(gè)信息位點(diǎn)，均只有一個(gè)峰dAl和rAl時(shí)，嵌合率計(jì)算公式為dAl/(rAl+dAl);上述公式中，r代表受者，d代表供者，A:表示峰高或峰面積。全文摘要本發(fā)明涉及造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)分析試劑盒及其應(yīng)用，本發(fā)明的試劑盒中含有下列STR位點(diǎn)的特異性引物D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481和D22S689。本發(fā)明的試劑盒采用了目前商品化試劑所沒有的引物對，這些引物對在供受者間提供信息性較高的試劑，因而適合拼裝單信息位點(diǎn)的檢測；可用于嵌合狀態(tài)的定量追蹤。文檔編號C12Q1/68GK101509040SQ200910047838公開日2009年8月19日申請日期2009年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日發(fā)明者朱自嚴(yán),穎楊申請人:上海市血液中心