專利名稱：培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的生產(chǎn)方法，尤其是一種培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法。
背景技術(shù)：
四氫嘧啶是一種嗜鹽微生物為了抵御外界高鹽濃度的體內(nèi)合成的一種相容性溶質(zhì)，并且一些嗜鹽微生物能夠合成四氫嘧啶的衍生物-羥基四氫嘧啶。四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶與其他已知的相容性溶質(zhì)相比，其對(duì)細(xì)胞、核酸、酶、蛋白等在射線、干燥、冷凍、高溫、高鹽等極端條件下具有更好的保護(hù)作用。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，截至目前還不能夠人工合成四氫嘧啶或者羥基四氫嘧啶，只能通過(guò)微生物胞內(nèi)合成獲得。目前據(jù)公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道，四氫嘧啶的合成主要是采用細(xì)菌擠奶法進(jìn)行生產(chǎn)，以及進(jìn)行高密度發(fā)酵。普通發(fā)酵方法是對(duì)于四氫嘧啶的生產(chǎn)，種子培養(yǎng)同上述1，2步驟，然后150ml種子菌液接種到3L發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)，pH控制在7. 0-7. 2，。發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉濃度為3M，其它同上。培養(yǎng)42h離心收集菌體，酒精提取四氫嘧唆，濃縮，膜過(guò)濾，結(jié)晶得到產(chǎn)物。 對(duì)于羥基四氫嘧啶的生產(chǎn)，種子培養(yǎng)同上述1，2步驟，然后150ml種子菌液接種到3L發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)20h后42°C培養(yǎng)，pH控制在7. 0-7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉濃度控制在 3M，繼續(xù)培養(yǎng)31h后離心收集菌體，酒精提取四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶，濃縮，膜過(guò)濾，結(jié)晶得到產(chǎn)物。由于嗜鹽菌的最適生長(zhǎng)的鹽濃度和能夠達(dá)到高產(chǎn)四氫嘧啶的鹽濃度不一致，影響了四氫嘧啶的合成效率，例如中度嗜鹽菌Halomonas ventosae DL7，其最適生長(zhǎng)鹽濃度為 1M，但是最優(yōu)合成四氫嘧啶的鹽濃度為3M。羥基四氫嘧啶作為四氫嘧啶的衍生物其合成受到熱刺激的誘導(dǎo)，在嗜鹽菌的最優(yōu)生長(zhǎng)溫度下只有少量合成，通常要提高生長(zhǎng)溫度才能夠較多量的合成，例如Halomonas ventosae DL7在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基試管中搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度從 30°C提高到37°C或者42°C，但是提高生長(zhǎng)溫度嚴(yán)重抑制了其生長(zhǎng)，又導(dǎo)致了四氫嘧啶合成量的嚴(yán)重下降，也從而影響了羥基四氫嘧啶的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以合理成本提高四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的合成效率的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的之一的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，包括如下步驟(1)菌種活化，將嗜鹽菌種放入盛有營(yíng)養(yǎng)液的試管中，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)活化；(2)種子培養(yǎng)，將活化后的菌種放入盛有培養(yǎng)液和嗜鹽菌種的三角瓶中，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)；(3)發(fā)酵階段，發(fā)酵在嗜鹽菌的最優(yōu)生長(zhǎng)鹽分下培養(yǎng)，將細(xì)胞增殖到最高濃度；
(4)通過(guò)補(bǔ)料將培養(yǎng)基的鹽濃度迅速提高到3 3. 5M，然后繼續(xù)培養(yǎng)3 8h，使四氫嘧啶的合成量大大提高。所述步驟(1)中的菌種活化是在溫度30°C，搖床培養(yǎng)18 Mh。所述步驟O)中的種子培養(yǎng)是在溫度30°C，搖床培養(yǎng)18 Mh。所述步驟(3)中的最優(yōu)生長(zhǎng)鹽分是1 2M NaCl，培養(yǎng)18 Mh，達(dá)到最高濃度。所述步驟中的補(bǔ)料提高鹽濃度的時(shí)間為1 池。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的之二的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)羥基四氫嘧啶的方法，包括如下步驟(1)菌種活化，將嗜鹽菌種放入盛有營(yíng)養(yǎng)液的試管中，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)活化；(2)種子培養(yǎng)，將活化后的菌種放入盛有培養(yǎng)液和嗜鹽菌種的三角瓶中，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)；(3)發(fā)酵階段，發(fā)酵在嗜鹽菌的最優(yōu)生長(zhǎng)鹽分下培養(yǎng)，將細(xì)胞增殖到最高濃度；(4)通過(guò)補(bǔ)料將培養(yǎng)基的鹽濃度迅速提高到3 3. 5M，然后繼續(xù)培養(yǎng)3-他，使四氫嘧啶的合成量大大提高；(5)將培養(yǎng)溫度從最優(yōu)生長(zhǎng)溫度提高到較高溫度，繼續(xù)培養(yǎng)3 10h，獲得較高的羥基四氫嘧啶合成量。所述步驟(1)中的菌種活化是在溫度30°C，搖床培養(yǎng)18 24h ；所述步驟O)中的種子培養(yǎng)是在溫度30°C，搖床培養(yǎng)18 Mh。所述步驟(3)中的最優(yōu)生長(zhǎng)鹽分是1 2M NaCl，培養(yǎng)18 Mh，達(dá)到最高濃度。所述步驟(4)中的補(bǔ)料提高鹽濃度的時(shí)間為1 池。所述步驟(5)中的最優(yōu)生長(zhǎng)溫度是30 32°C;提高溫度的時(shí)間是1 池；所述較高溫度是37 42 °C。本發(fā)明的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法的有益效果如下本發(fā)明的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)滲透壓沖擊(即在較短時(shí)間內(nèi)通過(guò)迅速提高環(huán)境滲透壓，例如Ih內(nèi)將過(guò)化鈉濃度從IM 提高到3M，使菌細(xì)胞外部滲透壓迅速提高。)和熱沖擊方法(即在短時(shí)間內(nèi)迅速提高環(huán)境溫度，例如Ih內(nèi)將培養(yǎng)溫度從30°C提高到42°C，使菌細(xì)胞外部熱壓迅速提高。)培植發(fā)酵接種菌株，以合理成本大大提高了生產(chǎn)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、取一個(gè)接種環(huán)在超凈工作臺(tái)上將Halomonas ventosae DL7菌株接到含有6ml 液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的試管中在240rpm的搖床中30°C下培養(yǎng)20h活化。2、在裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，接入活化的上述菌液2. 5ml，在 MOrpm的搖床上30°C培養(yǎng)Mh，共平行培養(yǎng)3瓶。種子培養(yǎng)基(IL):葡萄糖10g，氯化鈉 58. 4g，氯化銨2g，硫酸鎂2g，磷酸氫二鉀0. 6g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨lg。3、在裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中接入150ml種子菌液，800轉(zhuǎn)/分，pH控制在7. 0-7. 2，通氣量為0. 2-0. 4v/v. min (每分鐘每體積培養(yǎng)基通無(wú)菌空氣的體積比)，發(fā)酵IOh后開(kāi)始補(bǔ)料，使葡萄糖濃度維持在20g/l左右，在30°C下培養(yǎng)18h，18h后Ih內(nèi)加入
4NaCl至3M，繼續(xù)培養(yǎng)他。如果生產(chǎn)四氫嘧啶為主，發(fā)酵到此結(jié)束，隨后離心回收菌體，釋放胞內(nèi)四氫嘧啶產(chǎn)物，然后濃縮，膜過(guò)濾，結(jié)晶得到四氫嘧啶產(chǎn)物。生產(chǎn)羥基四氫嘧啶轉(zhuǎn)入步驟4。發(fā)酵培養(yǎng)基(IL):葡萄糖20g，氯化鈉58.4g，氯化銨2g，硫酸鎂2g，磷酸氫二鉀0.6g， 硫酸亞鐵O.Olg，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨lg，谷氨酸鈉5g。補(bǔ)料培養(yǎng)基(IL):葡萄糖500g，氯化鈉按照需要波動(dòng)，氯化銨20g，硫酸鎂20g，磷酸氫二鉀6g，硫酸亞鐵0. 02g,酵母膏20g，蛋白胨 20g。4、將上述培養(yǎng)24h的發(fā)酵液Ih內(nèi)提高培養(yǎng)溫度到42°C，繼續(xù)培養(yǎng)8h，培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)充3M的NaOH保持pH在7. 0-7. 2的范圍內(nèi)。培養(yǎng)結(jié)束后通過(guò)離心回收菌體，酒精提取釋放胞內(nèi)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶產(chǎn)物，然后濃縮，膜過(guò)濾，結(jié)晶得到四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶。本實(shí)施例的發(fā)酵方法和常用發(fā)酵方法的產(chǎn)率比較如下
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，包括如下步驟(1)菌種活化，將嗜鹽菌種放入盛有營(yíng)養(yǎng)液的試管中，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)活化；(2)種子培養(yǎng)，將活化后的菌種放入盛有培養(yǎng)液和嗜鹽菌種的三角瓶中，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)；(3)發(fā)酵階段，發(fā)酵在嗜鹽菌的最優(yōu)生長(zhǎng)鹽分下培養(yǎng)，將細(xì)胞增殖到最高濃度；(4)通過(guò)補(bǔ)料將培養(yǎng)基的鹽濃度迅速提高到3 3.5M，然后繼續(xù)培養(yǎng)3 他。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，其特征在于所述步驟(1)中的菌種活化是在溫度30°C，搖床培養(yǎng)18 Mh。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，其特征在于所述步驟O)中的種子培養(yǎng)是在溫度30°C，搖床培養(yǎng)18 Mh。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，其特征在于所述步驟(3)中的最優(yōu)生長(zhǎng)鹽分是1 2M NaCl，培養(yǎng)18 24h，達(dá)到最高濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，其特征在于所述步驟中的補(bǔ)料提高鹽濃度的時(shí)間為1 池。
6.一種培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)羥基四氫嘧啶的方法，包括如下步驟(1)菌種活化，將嗜鹽菌種放入盛有營(yíng)養(yǎng)液的試管中，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)活化；(2)種子培養(yǎng)，將活化后的菌種放入盛有培養(yǎng)液和嗜鹽菌種的三角瓶中，在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)；(3)發(fā)酵階段，發(fā)酵在嗜鹽菌的最優(yōu)生長(zhǎng)鹽分下培養(yǎng)，將細(xì)胞增殖到最高濃度；(4)通過(guò)補(bǔ)料將培養(yǎng)基的鹽濃度迅速提高到3 3.5M，然后繼續(xù)培養(yǎng)3- ；(5)將培養(yǎng)溫度從最優(yōu)生長(zhǎng)溫度提高到較高溫度，繼續(xù)培養(yǎng)3 10h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)羥基四氫嘧啶的方法，其特征在于所述步驟(1)中的菌種活化是在溫度30°C，搖床培養(yǎng)18 Mh ；所述步驟O)中的種子培養(yǎng)是在溫度30°C，搖床培養(yǎng)18 Mh。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)羥基四氫嘧啶的方法，其特征在于所述步驟(3)中的最優(yōu)生長(zhǎng)鹽分是1 2M NaCl，培養(yǎng)18 Mh，達(dá)到最高濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)羥基四氫嘧啶的方法，其特征在于所述步驟中的補(bǔ)料提高鹽濃度的時(shí)間為1 》1。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)羥基四氫嘧啶的方法，其特征在于所述步驟(5)中的最優(yōu)生長(zhǎng)溫度是30 32°C ；提高溫度的時(shí)間是1 池；所述較高溫度是 37 42°C。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種以合理成本提高四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的合成效率的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的方法。本發(fā)明的培養(yǎng)嗜鹽微生物生產(chǎn)羥基四氫嘧啶的方法，包括如下步驟(1)菌種活化；(2)種子培養(yǎng)；(3)發(fā)酵階段；(4)通過(guò)補(bǔ)料將培養(yǎng)基的鹽濃度迅速提高到3～3.5M，然后繼續(xù)培養(yǎng)3～8h，使四氫嘧啶的合成量大大提高；(5)將培養(yǎng)溫度從最優(yōu)生長(zhǎng)溫度提高到較高溫度，繼續(xù)培養(yǎng)3～10h，獲得較高的羥基四氫嘧啶合成量。本發(fā)明在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)滲透壓沖擊和熱沖擊方法培植發(fā)酵接種菌株，以合理成本大大提高了生產(chǎn)四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成率。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102286564SQ20111025609
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者吳建, 朱道辰, 王成棟, 陳華友, 陳焱 申請(qǐng)人:朱道辰