專利名稱：可代謝二苯并呋喃的紅球菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株可代謝二苯并呋喃的紅球菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
二噁英類物質(zhì)主要為工業(yè)產(chǎn)品副產(chǎn)物及各類污染物(如生活垃圾)不完全燃燒產(chǎn)生的一類毒性極強(qiáng)的物質(zhì)，它包括75種多氯代二苯并二噁英和135種多氯代二苯并呋喃兩組化合物，另外還有200多種多氯聯(lián)苯是它的類似物。其中2，3，7，8-四氯代二苯并二噁英是迄今發(fā)現(xiàn)毒性最強(qiáng)的化合物，其毒性為氰化物的50-100倍，不僅具有強(qiáng)烈的“三致”性， 而且在其極低劑量暴露下還具有內(nèi)分泌干擾作用。它的安全暴露量為10_12g。世界衛(wèi)生組織將二噁英定為一類致癌物，人體每天的攝入量對不超過10_12g。此類物質(zhì)無色、無味、為脂溶性，易積累于生物體內(nèi)的脂肪層中且難以排出，但只有長期中毒才會造成危害。它在人體內(nèi)排除一半所需的時間(半衰期)平均為7年。二噁英具有極強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，去除難度較大。用于二噁英脫毒和降解的理化技術(shù)包括熱修復(fù)、光降解、超臨界水解、金屬催化劑脫氯等，以光降解為主要途徑(嚴(yán)建華等， 2005)。而微生物降解技術(shù)由于處理成本低、見效快，無論從生態(tài)上還是從經(jīng)濟(jì)上均具有優(yōu)勢，在國內(nèi)外倍受關(guān)注。二苯并呋喃為多氯代二苯并呋喃在無氯取代情況下的母環(huán)結(jié)構(gòu)，通常作為研究二噁英類化合物生物降解時模式化合物。近幾十年來，具有二苯并呋喃降解能力的菌株相繼報道，包括紅球菌屬(Rhodococcus)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，地桿菌屬(Terrabacter) 等，雖然以上菌株可以降解二苯并呋喃，但其降解速率較慢，可利用的二苯并呋喃濃度較低，對于氯代二苯并呋喃的降解能力則更低。目前直接使用降解微生物的處理方法所遇到的問題，一方面是缺乏具有良好降解能力的降解菌株，另一方面是提供的降解菌株對環(huán)境的適應(yīng)能力較差，與土著菌相比處于劣勢。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有的可代謝二苯并呋喃微生物的不足，本發(fā)明提供一株具有較強(qiáng)的二苯并呋喃代謝能力的紅球菌Miodococcus sp. P52。本發(fā)明還提供紅球菌P52細(xì)胞懸浮液的制備及應(yīng)用方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下可代謝二苯并呋喃的紅球菌菌株Iihodococcus sp. P52，保藏編號為CCTCC No M2011181，于2011年5月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏單位地址中國武漢武昌珞珈山，郵編430072。上述的紅球菌Rhodococcus sp P52CCTCC No :M2011181，其菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)特征為菌落扁平，圓形，邊緣整齊，直徑l_3mm，表面皺褶、無光澤，產(chǎn)黃色及橙黃色色素； 細(xì)胞為球形，革蘭氏染色陽性?？纱x葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖，不能利用乳糖、木糖、鼠李糖、纖維二糖。過氧化氫酶陽性，硝酸鹽還原酶陰性，脲酶陽性。
上述紅球菌Rhodococcus sp. P52的16S rDNA序列與其他紅球菌屬的16S rDNA 序列有100%同源性，但不同的是，其他同源性較高的菌株并非二苯并呋喃降解菌。表 1 Rhodococcus sp. P52 的 16S rDNA 序列比對結(jié)果
權(quán)利要求
1.可代謝二苯并呋喃的紅球菌菌株Iihodococcussp.P52，保藏編號為CCTCC No: M2011181，于2011年5月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.如權(quán)利要求1所述的紅球菌Iihodococcussp. P52,16S rDNA序列長度為Κ6^ρ，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的紅球菌，其特征在于，菌落扁平，圓形，邊緣整齊，直徑l_3mm， 表面皺褶、無光澤，產(chǎn)黃色及橙黃色色素；細(xì)胞為球形，革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶陽性； 能以二苯并呋喃、氯代二苯并呋喃為唯一碳源及能源生長，適宜生長溫度為25-37°C，適宜 pH6. O 8. O，可代謝二苯并呋喃和/或一氯代二苯并呋喃。
4.一種紅球菌Rhodococcus sp.P52的細(xì)胞，按以下步驟制備(1)選用紅球菌Rhodococcus sp.P52，保藏編號為 CCTCC No :M2011181 ；(2)斜面培養(yǎng)將菌種單菌落1環(huán)接種于含有500mg/L二苯并呋喃的無機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基中，30°C靜止培養(yǎng)48小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株在無菌條件下接種1 2環(huán)至20-100mL含有 500mg/L的二苯并呋喃無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30°C條件下振蕩培養(yǎng)M-48小時制得種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以5-10%(ν/ν)的接種量將種子液接入IOO-IOOOmL含有500mg/L的二苯并呋喃無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30°C條件下振蕩培養(yǎng)M-48小時；(5)收集細(xì)胞將步驟的培養(yǎng)液以4000 6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘， 收集擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞，得Miodococcus Sp.P52的菌體細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的紅球菌Iihodococcussp. P52的細(xì)胞，其特征在于所述無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的配方為=K2HPO4 12g，KH2P04 llg, Na2S042. Og, MgSO4 · 7H20 0. 2g，NH4NOJg,微量金屬鹽溶液0. ImL,蒸餾水1L，pH 7. 0，高壓蒸汽滅菌121°C，20min ；其中微量金屬鹽溶液的配方為FeCl2 · 4Η20 0. 3g, CoCl2 · 6H20 0. 038g, MgCl2 ‘ 4H20 0. 02g, ZnCl2 0. 014g, H3BO3O. 0124g, Na2MO4 · H2O 0. 04g, CaCl2 · 2H20 0. 0034g，蒸餾水 0. lmL。
6.如權(quán)利要求4所述的紅球菌Iihodococcussp.P52的細(xì)胞，其特征在于，所述無機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基配方是向所述無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入1. 5 2wt%的瓊脂。
7.一種紅球菌Iihodococcus sp.P52的細(xì)胞懸浮液，是按以下方法制備的將權(quán)利要求4的菌體細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，離心，收集細(xì)胞，再用磷酸鹽緩沖液重新懸浮洗滌后收集的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮液濃度使之在620nm下的吸光度值達(dá)到 4 ；得紅球菌Rhodococcus sp. P52的細(xì)胞懸浮液。
8.權(quán)利要求1所述的紅球菌IihodococcusSP.P52的應(yīng)用，用于受污染的土壤或污水中二苯并呋喃和/或氯代二苯并呋喃的降解。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于用紅球菌Iihodococcussp.P52的菌體細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液，按以下方法之一用于二苯并呋喃和/或氯代二苯并呋喃的降解a、在受氯代二苯并呋喃和/或二苯并呋喃污染的土壤的生物修復(fù)過程中，將紅球菌 Rhodococcus sp. P52的菌體細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液與受污染土壤充分?jǐn)嚢?，進(jìn)行生物降解修復(fù)；b、將紅球菌Iihodococcussp. P52的菌體細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液與馴化污泥混合后以間接掛膜方式接種于生物膜反應(yīng)器；采用生物膜反應(yīng)器去除污水中的二苯并呋喃和/或氯代二苯并呋喃化合物。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，方法b中所述馴化污泥是從城市污水處理廠的二沉池中取剩余污泥，加入含二苯并呋喃的廢水連續(xù)曝氣，溫度為15 35°C、DO控制在1 aiig/L、pH值為6. 5 7. 5，曝氣1周，保留污泥，換廢水重新曝氣，條件同上，重復(fù)操作2-4周，得到馴化污泥。
全文摘要
本發(fā)明涉及可代謝二苯并呋喃的紅球菌及其應(yīng)用，紅球菌菌株Rhodococcus sp.P52，保藏編號為CCTCC NoM2011181，于2011年5月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。該菌降解質(zhì)粒具有遷移性，可高效代謝降解二苯并呋喃、氯代二苯并呋喃，將紅球菌Rhodococcus sp.P52的菌體細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液用于在土壤生物修復(fù)、生物膜反應(yīng)器中處理二苯并呋喃、氯代二苯并呋喃，處理能力與適應(yīng)性強(qiáng)，利于實際應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述紅球菌菌體細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液的制備與應(yīng)用。
文檔編號C12N1/20GK102286399SQ201110190959
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者彭鵬, 李力 申請人:山東大學(xué)