專利名稱：一種穩(wěn)定型酶制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種穩(wěn)定型酶制劑及其制備方法，該方法通過制備油脂包裹型酶新劑型并在真空條件下進(jìn)行脫水獲得穩(wěn)定化的酶制劑，進(jìn)一步利用該穩(wěn)定型酶制劑生產(chǎn)加酶飼料，形成一種加酶飼料的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
酶的穩(wěn)定性關(guān)系到它在工業(yè)實(shí)踐中的成敗，穩(wěn)定性不足大大限制了酶的應(yīng)用范圍，因此改善酶分子的穩(wěn)定性具有重要價(jià)值。穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)是酶催化活性穩(wěn)定的基礎(chǔ)，從分子水平上看，一系列共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵都對(duì)穩(wěn)定性有影響，特別是各種非共價(jià)鍵間的微妙平衡尤為重要。對(duì)酶分子穩(wěn)定性貢獻(xiàn)較大的共價(jià)鍵主要有肽鍵和二硫鍵，它們的作用力比非共價(jià)鍵強(qiáng)，并且以影響酶分子一級(jí)結(jié)構(gòu)為主。酶分子空間結(jié)構(gòu)通常比一級(jí)結(jié)構(gòu)更為脆弱，因此作用較弱的非共價(jià)鍵對(duì)酶穩(wěn)定性的影響更引人關(guān)注。為提高酶的穩(wěn)定性，一是改造酶分子，通過破譯高穩(wěn)定性酶分子的特殊結(jié)構(gòu)規(guī)律，就可指導(dǎo)我們利用蛋白質(zhì)工程或化學(xué)修飾手段設(shè)計(jì)并獲得所需的高穩(wěn)定性酶；二是通過選用合適的穩(wěn)定劑來提高酶的穩(wěn)定性，常用的穩(wěn)定劑主要包括甘油、多羥基化合物、食用膠、蛋白酶抑制劑、鹽類、還原劑、氨基酸等物質(zhì)。飼料行業(yè)是酶制劑的重要應(yīng)用領(lǐng)域，飼料中的酶制劑，可借助動(dòng)物消化道內(nèi)環(huán)境， 將飼料中的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素、果膠等成分分解，形成易被動(dòng)物機(jī)體吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而提高飼料的消化利用率；減少腸道內(nèi)氨濃度過高對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的毒性，增加泌乳量和乳脂量，增進(jìn)消化道功能，減少消化道疾病，提高飼料效益，降低養(yǎng)殖成本。飼料分為通常含水量在12 13%，在此高濕環(huán)境下，酶制劑容易失活，影響其使用效果。如果飼料為顆粒飼料， 其生產(chǎn)過程還要經(jīng)受高溫、高濕的造粒過程，這一過程中溫度通常為60 120°C，濕度介于 10 20%，這一過程很容易導(dǎo)致酶制劑失活，這也造成很多飼料無法添加酶制劑。因此，研發(fā)一種具有熱穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性好的酶制劑至關(guān)重要。針對(duì)酶制劑的穩(wěn)定性問題，人們已經(jīng)進(jìn)行了廣泛研究，開發(fā)出了多種可以提高酶制劑穩(wěn)定性的方法。WO 03/059087描述了一種制備含酶顆粒的方法，首先將水性的液體酶添加載體加工成為顆粒、干燥，再用聚烯烴包衣。WO 03/059086描述了一種含酶顆粒的制備方法，首先將水性的液體酶添加載體后加工成顆粒、干燥，再用疏水物質(zhì)包衣，優(yōu)選聚烯烴。 CN96190833. 5描述了一種將無機(jī)鹽例如MgSO4溶于含酶溶液中，接著進(jìn)行干燥，不但鹽的加入提高了干燥后的酶活性，而且所得含酶及無機(jī)鹽的固體組合物的貯存和加工穩(wěn)定性也得到了改善。CN200580003612. 5描述了一種穩(wěn)定的固態(tài)或者液態(tài)酶制劑，其包含至少一種酶和至少一種選自阿拉伯膠、至少一種植物蛋白及其混合物的穩(wěn)定劑。該發(fā)明也涉及用于制備這些制劑，特別是固態(tài)制劑(例如顆粒)的方法及其在動(dòng)物和/或人類營(yíng)養(yǎng)品中的用途。 2005800(^895. 1描述了至少一種磷酸酶和至少一種穩(wěn)定劑的穩(wěn)定化固體或液體酶制劑，所述穩(wěn)定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(=角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動(dòng)物蛋白質(zhì)及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩(wěn)定劑，則其后需包被顆粒。該發(fā)明還涉及生產(chǎn)這些制劑(特別是固體制劑如顆粒)的方法以及它們?cè)趧?dòng)物和/ 或人營(yíng)養(yǎng)物中的用途。200810195183. 1描述了一種提高酶制劑熱穩(wěn)定性的方法，是將酶吸附于微孔淀粉的孔里，用明膠作壁材包衣；微孔吸附物為芯材，用噴霧干燥法制成微膠囊， 提高熱穩(wěn)定性。在以上的提高酶制劑穩(wěn)定性方案中，所應(yīng)用的方法主要是添加無機(jī)鹽、膠類、糖類等保護(hù)劑或者包衣的方式，可以達(dá)到提高酶制劑的保存穩(wěn)定性和一定的耐高溫性能的目的，這種保護(hù)效果也很容易為人所理解。盡管這種方法可以提高酶對(duì)多種不良環(huán)境的耐受性和提高保存穩(wěn)定性，但對(duì)于飼料制粒溫度和濕度，通常是難以達(dá)到理想效果。專利WO 97/16076描述了一種穩(wěn)定化的酶制劑顆粒，該酶制劑顆粒含有至少1 % 的疏水物質(zhì)和75%的水不溶性物質(zhì)。專利描述酶制劑的制備首先是將液體酶和水不溶性的物質(zhì)進(jìn)行混合造粒，經(jīng)流化床干燥，然后噴涂以疏水物質(zhì)。這種酶制劑在飼料制粒環(huán)節(jié)可以保持高的穩(wěn)定性，通常適合于80°C左右的制粒溫度，對(duì)于更高制粒溫度，其不足仍很突出。這種方法需要酶制劑供應(yīng)商預(yù)先制備好專用的疏水包埋的酶制劑顆粒，和普通酶制劑相比，增加了成本，而且這種酶制劑的活力分析前要除去疏水物質(zhì)，使得飼料企業(yè)的品控工作變得更加復(fù)雜。另外，飼料企業(yè)經(jīng)常要面對(duì)來自多個(gè)供應(yīng)商的酶制劑和不同品種的酶制劑，這些酶制劑的穩(wěn)定性差異很大，給生產(chǎn)管理帶來很大困難。飼料行業(yè)特別需要一種更加容易控制的、更高效地提高酶制劑穩(wěn)定性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種提高酶制劑的穩(wěn)定性的方法，該方法將油脂包埋和水分控制結(jié)合起來，使得酶制劑可以更好適用于飼料造粒高溫高濕環(huán)節(jié)。本發(fā)明另一目的是提供上述方法在生產(chǎn)加酶飼料中的應(yīng)用。酶是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)折疊一般是將疏水氨基酸分布在內(nèi)部，而親水氨基酸多分布在表面，通常認(rèn)為天然的蛋白質(zhì)處于熱力學(xué)能量最小狀態(tài)。理論上，酶蛋白處于水介質(zhì)中， 才可以保持蛋白質(zhì)處于能力最低狀態(tài)，也就是，蛋白質(zhì)可以保持更好的穩(wěn)定性。事實(shí)上，多數(shù)酶蛋白在非水相環(huán)境中并不會(huì)發(fā)生明顯的活性損失。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，水分的控制是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用常壓的熱空氣為干燥介質(zhì)的干燥方法無法使得酶制劑中的含水量降低至令人滿意的程度，限制了酶制劑性能的發(fā)揮。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，水分是影響酶制劑穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，在高含水量條件下可以耐受60°C溫度的酶制劑，通過降低其酶制劑含水量，可以使得其耐受溫度提高120°C以上，低含水量酶制劑經(jīng)過油脂包裹處理以后再經(jīng)真空脫水，其耐高溫性能可以進(jìn)一步提升達(dá)到150°C左右，甚至可以承受200°C以上的高溫處理而仍保留有一定活力。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種酶制劑穩(wěn)定化處理方法，其步驟包括1)將融化的油脂和酶制劑進(jìn)行混合形成油脂包裹型酶制劑，所述油脂和酶制劑的比例不低于2 lw/w ；2)攪拌均勻后，真空條件下對(duì)油脂包裹型酶制劑脫水至水分占酶制劑的3. 5% w/w以內(nèi)，即得到穩(wěn)定型酶制劑。油脂包裹型酶制劑可以從液態(tài)酶制劑出發(fā)制備，也可以從固態(tài)酶制劑出發(fā)制備。 采用液態(tài)酶制劑和油脂混合，然后經(jīng)真空脫水，可以制備一種懸浮形式的油脂包裹型酶制劑，這種酶制劑也具有很高的熱穩(wěn)定性，但是，這種制備過程對(duì)于很多酶分子存在一定程度上的活性損失，該活性損失的幅度通常大于沒有油脂參與的酶制劑干燥過程。分析原因，一方面液態(tài)酶制劑中酶分子處于更高的柔性，容易失活，另一方面，這種方法比較難以添加保護(hù)劑。在本發(fā)明中，優(yōu)選的油脂包裹型酶制劑的制備方法是以固態(tài)酶制劑為原料進(jìn)行制備。 固態(tài)酶制劑可以包含一種酶或多種酶，固態(tài)酶制劑通常是粗品酶制劑，包含了多種雜質(zhì)，也可能添加了保護(hù)劑或填充劑等，如糖、淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、膠類等，通常酶分子只占不足 20 %的比例。固態(tài)酶制劑的干燥方法可以采用噴霧干燥、流化床干燥等干燥方式，本發(fā)明對(duì)固態(tài)酶制劑的生產(chǎn)方法不做限定。固態(tài)酶制劑的含水量是個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，采用常規(guī)干燥方法獲得固態(tài)酶制劑，含水量一般處于5 15%之間，處于該含水量的酶制劑在抵御高溫方面存在不足。盡管采用真空干燥的方式可以獲得更低含水量的酶制劑，但這種酶制劑極易吸水，增加生產(chǎn)管理復(fù)雜性。本發(fā)明首先制備油脂分散型酶制劑，然后將該酶制劑進(jìn)行真空脫水。真空是一很重要的操作手段，真空不僅僅有利于脫水，而且真空可以促使油脂和酶制劑充分接觸，從而使得保護(hù)作用得以加強(qiáng)。為使得操作方便，油脂的加量不得過低，通常要求油脂和酶制劑的比例不低于2 1，優(yōu)選地，不低于5 1，更優(yōu)選地，不低于20 1。真空技術(shù)是常規(guī)技術(shù)，真空的提供可以采用通常的抽真空方式，如蒸汽噴射真空泵、羅茨機(jī)械泵抽真空等方式提供真空。通過真空脫水，使得水分降低至占原固態(tài)酶制劑的3. 5%以內(nèi)，優(yōu)選降低至占原固態(tài)酶制劑的2%以內(nèi)。油脂包括動(dòng)物油、植物油、微生物油脂等來源的油脂，這些油脂的主要成分為甘油三酯，也就是一個(gè)甘油分子和三個(gè)脂肪酸鏈結(jié)合的分子。油脂經(jīng)過加工以后可以獲得甘油二酯、單甘脂和游離脂肪酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)分布具有和甘油三酯不同的性質(zhì)，如熔點(diǎn)、親水性、消化特性、乳化性等，這些物質(zhì)在天然油脂也有少量存在。研究表明，這些物質(zhì)對(duì)酶制劑的保護(hù)作用和甘油三酯是類似的。在本發(fā)明中，油脂是指甘油三酯、甘油二酯、單甘酯、 脂肪酸中的一種或一種以上的混合物。本發(fā)明中，對(duì)油脂熔點(diǎn)不做特別限定，影響油脂熔點(diǎn)的主要因素是脂肪酸組成，通常，脂肪酸不飽和度高的油脂熔點(diǎn)低，不飽和度低的油脂熔點(diǎn)高。對(duì)于在飼料生產(chǎn)前對(duì)酶制劑進(jìn)行處理的情況，通常就采用飼料本來要添加的油脂。油脂是飼料中的常規(guī)成分，通常在飼料中的添加比例為2 5%，可以取部分油脂用于制備本發(fā)明穩(wěn)定性酶制劑。飼料油脂常用的品種有棕櫚油、大豆油、魚油、豬油、牛油等。本發(fā)明的酶制劑添加在飼料的生產(chǎn)中，用于制備加酶飼料。所述酶制劑包括蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、半纖維素酶、木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶中的一種或一種以上的混合物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)經(jīng)過本發(fā)明方法處理后的酶制劑具有明顯耐高溫和高濕損傷的效果；(2)采用添加酶制劑的加酶飼料，具有更好的酶活保留率和更好的保存穩(wěn)定性，從而提高了飼料質(zhì)量的可靠性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。實(shí)施例11.供測(cè)試酶制劑的制備酶制劑為酸性蛋白酶100g，活力126000U/g，含水量8. 3%，購(gòu)于江門金遠(yuǎn)洋生物科技公司。a)不做處理，記為樣品A。b)樣品A IOOg加入到200g大豆油中，攪拌均勻，不做任何處理，得到樣品B。c)樣品A IOOg加入到200g大豆油中，攪拌均勻，采用水環(huán)羅茨真空機(jī)組提供真空，脫水5分鐘后，得到樣品C，測(cè)樣品C含水量為1. 1% (w/w)，折算后水分占原固態(tài)酶制劑的比例為3. 3% (w/w)。d)樣品A IOOg加入到500g大豆油中，攪拌均勻，采用水環(huán)羅茨真空機(jī)組提供真空，脫水30分鐘后，得到樣品D，測(cè)樣品D的含水量為0. 31 % (w/w)，折算后水分占原固態(tài)酶制劑的比例為1.9% (w/w) 02.穩(wěn)定性測(cè)試取樣品A、B、C于不同溫度烘箱處理30min，活力保留率數(shù)據(jù)見表1?；盍ΡＡ袈适墙?jīng)過處理后的酶制劑活力和對(duì)應(yīng)的原初蛋白酶活力的比值，在本實(shí)施例中，由于添加油脂的不同，蛋白酶被稀釋的倍數(shù)不同，在計(jì)算時(shí)B和C需折換成原酶計(jì)算，即300g B可折換成IOOgA, 600g C可折換成IOOA0B和C樣品酶的提取采取以下方法，在B和C樣品加水多次萃取，取水相合并檢測(cè)。表 1
樣品60°C處理酶活保留率(％)80°C處理酶活保留率(％)100°C處理酶活保留率(％)樣品A95.532.68.6樣品B89.356.812.7樣品C87.083.575.8樣品D91.189.389.2由表1可見，油脂和酶制劑接觸對(duì)酶制劑活性有輕微的抑制或失活作用，但可以大大提高酶制劑的耐熱性，使得酶制劑在經(jīng)受高溫處理的最終保留率大幅度提高。水分是影響穩(wěn)定性的關(guān)鍵，含水量(以原固態(tài)酶制劑為基準(zhǔn)計(jì)算)為3. 3%的酶制劑穩(wěn)定性比含水量為8. 3%的酶制劑穩(wěn)定性有顯著提高，含水量為1. 9%的酶制劑更加穩(wěn)定。實(shí)施例21.供測(cè)試酶制劑的制備酶制劑為植酸酶，購(gòu)于江門金遠(yuǎn)洋生物科技公司，活力5600U/g，水分含量9. 6%。
A)原樣品，記為A。B)樣品A 1kg，經(jīng)油脂噴涂，油脂噴涂量為20%，記為B。C)樣品A Ikg加入到4kg大豆油中，攪拌均勻后，真空脫水，記為樣品C。測(cè)得樣品C含水量為0. 33%。2.穩(wěn)定性測(cè)試取樣品A、B和C，模擬飼料造粒條件，采用常壓蒸汽加熱20s，再至于80°C烘箱 30min，然后自然冷卻Ihr后待測(cè)，處理后對(duì)應(yīng)的樣品名稱為A’、B’和C’。B和C樣品用正己烷脫脂后供測(cè)試。植酸酶活力測(cè)定方法采用通用的方法，即植酸酶在一定溫度和PH條件下，水解底物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，與釩鉬酸銨生成黃色的 [(NH4)3PO4NH4VO3-IeMoO3]復(fù)合物，在波長(zhǎng)405nm下進(jìn)行比色測(cè)定。所有結(jié)果均處理成酶活保留率，酶活保留率是樣品中殘留酶活和該樣品對(duì)應(yīng)的原初酶制劑活力的比值。結(jié)果見表 2。表權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定型酶制劑的制備方法，其步驟包括1)將融化的油脂和酶制劑進(jìn)行混合形成油脂包裹型酶制劑，所述油脂和酶制劑的比例不低于2 lw/w ；2)攪拌均勻后，真空條件下對(duì)油脂包裹型酶制劑脫水至水分占酶制劑的3.5% w/w以內(nèi)，即制得穩(wěn)定型酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述酶制劑是固態(tài)分散狀酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述油脂和酶制劑的比例不低于 5 lw/w。
4.根據(jù)權(quán)利要求3任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，步驟幻所述油脂懸浮型酶制劑脫水后的水分占酶制劑的2% w/w以內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述油脂是甘油三酯、 甘油二酯、單甘酯、脂肪酸中的一種或兩種以上的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 4任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述酶制劑為蛋白酶、 淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、半纖維素酶、木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶中的一種或兩種以上的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述酶制劑為蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、半纖維素酶、木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶中的一種或兩種以上的混合物。
8.一種穩(wěn)定型酶制劑，其特征在于，是由權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法制備而成的。
9.一種穩(wěn)定型酶制劑的應(yīng)用，其特征在于，在飼料的生產(chǎn)中添加權(quán)利要求8的酶制劑以制備加酶飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種酶制劑的穩(wěn)定化處理方法，該方法將融化的油脂和酶制劑進(jìn)行混合制備成油脂包裹型酶制劑，其中，油脂和酶制劑的比例不低于2∶1(w/w)；攪拌均勻后，在真空條件下對(duì)油脂包裹型酶制劑脫水至水分占酶制劑的3.5％(w/w)以內(nèi)，采用以上方法可以獲得具有更好耐熱性能的酶制劑。本發(fā)明進(jìn)一步包括該穩(wěn)定化酶制劑的應(yīng)用，該應(yīng)用為利用該穩(wěn)定化酶制劑生產(chǎn)加酶飼料。采用以上方法對(duì)酶制劑進(jìn)行穩(wěn)定化處理和應(yīng)用，具有簡(jiǎn)便、低成本的特點(diǎn)，特別適合在飼料行業(yè)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/96GK102226173SQ20111011661
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者曹昱, 楊博, 汪運(yùn)明, 王小寧, 王永華 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)