鋅銅超氧化物歧化酶sod1表達(dá)量的分子檢測方法及引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種體外基因分子診斷方法，尤其是一種鋅銅超 氧化物歧化酶SODl表達(dá)量的分子檢測方法及所用的引物。 技術(shù)背景
[0002] 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase簡稱S0D)是一種新型酶制劑。它在生 物界的分布極廣，幾乎從動物到植物，甚至從人到單細(xì)胞生物，都有它的存在。SOD被視為生 命科技中最具神奇魔力的酶，是人體內(nèi)的垃圾清道夫，S0D是氧自由基的自然天敵，是機體 內(nèi)氧自由基的頭號殺手，是生命健康之本。
[0003] 由于現(xiàn)代生活壓力、環(huán)境污染、各種輻射以及超量運動等都會造成氧自由基大量 形成，現(xiàn)已證實，氧自由基可引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰 老與死亡的直觀指標(biāo)，它可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細(xì) 胞，修復(fù)基因自由基造成的對細(xì)胞傷害。因此，生物抗氧化機制中SOD的地位越來越重要。
[0004] SODl是SOD家族中的一種，基本上所有的真核細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)都含有帶有銅和鋅的 超氧化物歧化酶，是一種可溶性蛋白，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。目前體外的SOD的檢測方法主 要集中在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互作的elisa法和酶競爭法，此方法可以檢測酶的活性，但是由 于樣品蛋白質(zhì)人為操作因素導(dǎo)致誤差大，且蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，極易降解和變性，導(dǎo)致活性下降 和失活，結(jié)果的可信度大打折扣。
[0005] CN102095856A公開了一種超氧化物歧化酶快速檢測卡及其檢測方法，在長條扁平 薄殼狀的檢測卡外殼中設(shè)置測試條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔；測試條是由支 承背板上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊、膠體金膜、硝酸纖維素膜、和吸水膜所組成； 支承背板中部疊置粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端疊置粘貼吸水膜，另一端疊置粘貼樣 品墊，吸水膜內(nèi)端與樣品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在樣品墊與硝酸纖維素膜 的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段膠體金膜；膠體金膜為含抗超氧化物歧化酶抗體膠體金 標(biāo)記的玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜上有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，依次是：含超氧化物歧化 酶的檢測帶，含抗兔抗體或抗鼠抗體的質(zhì)控帶，測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣 孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
[0006] 目前市場還尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)SODl的分子水平檢測試劑盒，本發(fā)明對未來分子檢測 SOD提供了強有力的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種人體內(nèi)鋅銅超氧化物歧化 酶SODl表達(dá)量的體外分子檢測方法及所用的引物，本方法可以在體外檢測人體不同組織、 細(xì)胞受到的氧化損傷程度的相對大小，可應(yīng)用于體外基因分子診斷等方面。
[0008] 本法實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：
[0009] -種鋅銅超氧化物歧化酶SODl表達(dá)量的分子檢測用引物，
[0010] 正向引物序列：CAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGA ;
[0011] 反向引物序列：AGTCTCCAACATGCCTCTCTTCATC。
[0012] 與鋅銅超氧化物歧化酶SODl表達(dá)量的分子檢測用引物配合使用的內(nèi)參基因 GADPH引物，內(nèi)參基因的正向引物序列：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
[0013] 內(nèi)參基因的反向引物序列：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。
[0014] -種鋅銅超氧化物歧化酶SODl表達(dá)量的分子檢測方法，方法如下：
[0015] ⑴目標(biāo)組織或細(xì)胞中總RNA的提取：
[0016] ⑵采用步驟⑴提取出的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，獲得模板RNA ;
[0017] ⑶采用權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求1所述的內(nèi)參基因 GADPH，以及步驟⑵的 模板RNA進(jìn)行實時熒光定量PCR。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：
[0019] 本發(fā)明提供一種鋅銅超氧化物歧化酶SODl表達(dá)量的分子檢測方法，首次用qPCR 的方法，以基因水平的檢測來鑒定SODl的含量，同時提供一套有針對性引物序列和內(nèi)參序 列，即使在樣品提取的RNA中有DNA污染的情況下，也可以穩(wěn)定、特異、準(zhǔn)確的檢測出人的不 同組織、細(xì)胞中SODl基因的表達(dá)量差異，且有極高的重復(fù)性，克服了市場上常用酶活檢測 試劑盒的人為因素影響大、穩(wěn)定性差、重復(fù)性差等因素。
[0020] 本發(fā)明可以應(yīng)用在醫(yī)療檢測和化妝品抗衰老領(lǐng)域，配合大量臨床實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ) 上，可以早期判斷由于SODl酶表達(dá)量高低反映相關(guān)疾病的情況，對疾病的早期治療和預(yù)防 起到積極的作用，目前市場上還未出現(xiàn)關(guān)于SOD的分子檢測產(chǎn)品，有利于推動SOD分子檢測 市場的發(fā)展。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明引物特異性：5種不同濃度雙氧水處理人皮膚細(xì)胞后SODl與GADPH 熔解曲線圖；
[0022] 圖2為本發(fā)明qPCR反應(yīng)性靈敏性：5種不同濃度雙氧水處理人皮膚細(xì)胞后的SODl 的擴增曲線圖，雙氧水濃度為（μΜ) :0、200、400、800、1000;
[0023] 圖3為本發(fā)明GAPDH、SODl擴增基因瓊脂糖凝膠電泳圖，從左至右依次為： maker (從上至下依次為 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)、GADPH(185bp)、 sodl(187bp)；
[0024] 圖4為本發(fā)明結(jié)果分析5種不同濃度雙氧水處理人皮膚細(xì)胞后的SODl表達(dá)量差 異柱狀圖。
[0025] 圖5為標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為拷貝數(shù)Ig值，眾坐標(biāo)為Cq值。
[0026] 具體的實施方式
[0027] 為了理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：下述實施例是說明性 的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 本方法中熒光定量PCR引物的正反向引物均是跨基因組內(nèi)含子設(shè)計，避免了由于 樣品中殘留的基因組DNA的污染，而導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確度低和重復(fù)性差的缺點，提高了特異 性和結(jié)果的準(zhǔn)確度。使用NCBI blast比較，與使用PMMER5. 0設(shè)計軟件分析，優(yōu)化引物， 將發(fā)各項指征均控制在最優(yōu)范圍之內(nèi)，極大程度降低了引物二聚體的形成。將引物長度 達(dá)到較高的25bp，在一定程度上也提高了擴增的特異性。無需加入DNase處理，同時采用 sybergreen法，同探針法相比節(jié)省了一定的成本。RNA序列號NM_000454. 4 GI: 48762945
[0029] -種鋅銅超氧化物歧化酶SODl表達(dá)量的分子檢測方法及所用的引物，以下方法 以人皮膚細(xì)胞為例子，來說明具體的檢測方法。本發(fā)明以5種不同濃度雙氧水處理人皮膚 細(xì)胞后SODl檢測為例來說明所使用引物的特異性，具體操作過程如下：