一種從油菜葉中提取高純度sod的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，屬于食品深加工的領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase),簡(jiǎn)稱S0D,是一種新型酶制劑,屬金屬酶.它是一種源于生命體的活性物質(zhì)，SOD是機(jī)體內(nèi)危害最大的氧自由基專一清除劑，亦是其他自由基最有效的清除劑，它與體內(nèi)的谷胱甘肽過(guò)氧酶、過(guò)氧化氫酶聯(lián)手，把自由基轉(zhuǎn)化為水和氧分子。能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對(duì)人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。
[0003]從植物，特別是人們?nèi)粘＝?jīng)常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及糧食中提取S0D，使用安全性非常高，避免了可能發(fā)生的交叉感染。利用全新的生物技術(shù)從植物中提取S0D，具有明顯的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，市場(chǎng)前景廣闊。從植物中提取SOD的主要傳統(tǒng)工藝流程為:植物—打漿一超濾分離一有機(jī)溶劑去雜一柱層析精制一超濾濃縮一冷凍干燥一產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，該方法采用獨(dú)有的磷酸鉀緩沖液配方:50mmol/L的磷酸鉀緩沖液,除含有磷酸鉀外,還含有l(wèi)mmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9 ；5mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有l(wèi)mmol/L的巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9 ;并且優(yōu)化了離子交換柱和凝膠柱分離的條件；通過(guò)該法可以獲得純度更高、成本更低的S0D。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:
A、取新鮮的油菜葉I重量份，加入2-3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，攪打勻漿，用100-120目篩抽濾，將濾液以3000-5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心16-25分鐘獲得葉綠體；
B、將A步驟所得葉綠體用0.2-0.3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進(jìn)行粉碎處理，經(jīng)離心機(jī)4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20-30分鐘，獲得上清液即為粗酶液；
C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達(dá)到50-60%，靜置2-4小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30-40分鐘，取上清液；
D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為93-97%，靜置2-4小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心40-50分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ；
Ejf D步驟所得的粗制S0D，加入3-5倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過(guò)的溶液通過(guò)低溫真空濃縮至原體積的1/3-1/4 ；
F、將E步驟所得濃縮液經(jīng)SephadexG-75凝膠柱或DEAE- Sephadex A-50離子交換柱進(jìn)行提純；凝膠柱的洗脫液為5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶；離子交換柱的洗脫液為5-300mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進(jìn)行梯度洗脫；
G、將F步驟所得洗脫液經(jīng)低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 SOD。
[0006]其中，50mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有l(wèi)mmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9 ；5mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有l(wèi)mmol/L的巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9。
[0007]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題:
1、采用了新的工藝流程，比傳統(tǒng)工藝步驟少，設(shè)備簡(jiǎn)單，節(jié)約了成本，易于推廣。
[0008]2、采用了獨(dú)有的磷酸鉀緩沖液配方，在提高了分離效率的同時(shí)對(duì)SOD的活性進(jìn)行了很好的保護(hù)，保證了成品的質(zhì)量。
[0009]3、對(duì)不同類型的柱子采用新的洗脫條件，提高了產(chǎn)品的活性和純度，本發(fā)明可以將產(chǎn)品提純150倍，傳統(tǒng)工藝在100倍左右，而活性比傳統(tǒng)工藝提高了 10倍。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1:
A、取新鮮的油菜葉100公斤,加入200公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中,攪打勻衆(zhòng),用100目篩抽濾，將濾液以3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心25分鐘獲得葉綠體；
B、將A步驟所得葉綠體用20公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進(jìn)行粉碎處理，經(jīng)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，獲得上清液即為粗酶液；
C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達(dá)到50%，靜置2小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心40分鐘，取上清液；
D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為93%，靜置2小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心40分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ；
Ejf D步驟所得的粗制SODjaA 3倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過(guò)的溶液通過(guò)低溫真空濃縮至原體積的1/3 ；
F、將E步驟所得濃縮液經(jīng)SephadexG-75凝膠柱，洗脫液為5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進(jìn)行洗脫；
G、將F步驟所得洗脫液經(jīng)低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 S0D。
[0011]所得SOD的活性為:1156.3U/mg，提純倍數(shù)為:142.22倍。
[0012]實(shí)施例2:
A、取新鮮的油菜葉100公斤,加入300公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中,攪打勻衆(zhòng),用110目篩抽濾，將濾液以5000轉(zhuǎn)/分鐘,離心16分鐘獲得葉綠體；
B、將A步驟所得葉綠體用30公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進(jìn)行粉碎處理，經(jīng)離心機(jī)6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，獲得上清液即為粗酶液；
C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達(dá)到60%，靜置4小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心50分鐘，取上清液；
D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為97%，靜置4小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心50分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ； Ejf D步驟所得的粗制SODjaA 5倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過(guò)的溶液通過(guò)低溫真空濃縮至原體積的1/4 ；
F、將E步驟所得濃縮液經(jīng)SephadexG-75凝膠柱，洗脫液為5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進(jìn)行洗脫；
G、將F步驟所得洗脫液經(jīng)低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 S0D。
[0013]所得SOD的活性為:1048.3U/mg，提純倍數(shù)為:148.13倍。
[0014]實(shí)施例3:
A、取新鮮的油菜葉100公斤,加入250公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中,攪打勻衆(zhòng),用100目篩抽濾,將濾液以4500轉(zhuǎn)/分鐘,離心20分鐘獲得葉綠體；
B、將A步驟所得葉綠體用25公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進(jìn)行粉碎處理，經(jīng)離心機(jī)5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心25分鐘，獲得上清液即為粗酶液；
C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達(dá)到55%，靜置3小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心45分鐘，取上清液；
D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為95%，靜置3小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心45分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ；
Ejf D步驟所得的粗制SODjaA 4倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過(guò)的溶液通過(guò)低溫真空濃縮至原體積的1/4 ；
F、將E步驟所得濃縮液經(jīng)DEAE-Sephadex A-50離子交換柱進(jìn)行提純；離子交換柱的洗脫液為5-300mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進(jìn)行梯度洗脫；
G、將F步驟所得洗脫液經(jīng)低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 S0D。
[0015]所得SOD的活性為:1279.lU/mg，提純倍數(shù)為:156.23倍
實(shí)施例4:
A、取新鮮的油菜葉100公斤,加入240公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中,攪打勻衆(zhòng),用110目篩抽濾，將濾液以4000轉(zhuǎn)/分鐘,離心25分鐘獲得葉綠體；
B、將A步驟所得葉綠體用20公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進(jìn)行粉碎處理，經(jīng)離心機(jī)5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心25分鐘，獲得上清液即為粗酶液；
C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達(dá)到56%，靜置3小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心40分鐘，取上清液；
D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為96%，靜置2.5小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心45分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ；
Ejf D步驟所得的粗制S0D，W；V 3倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過(guò)的溶液通過(guò)低溫真空濃縮至原體積的1/4 ；
F、將E步驟所得濃縮液經(jīng)DEAE-Sephadex A-50離子交換柱進(jìn)行提純；離子交換柱的洗脫液為5-300mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進(jìn)行梯度洗脫；
G、將F步驟所得洗脫液經(jīng)低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 SOD。
[0016] 所得SOD的活性為:1215.6U/mg，提純倍數(shù)為:151.74倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，其特征在于，該方法通過(guò)以下工藝步驟: A、取新鮮的油菜葉I重量份，加入2-3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，攪打勻漿，用100-120目篩抽濾，將濾液以3000-5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心16-25分鐘獲得葉綠體； B、將A步驟所得葉綠體用0.2-0.3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進(jìn)行粉碎處理，經(jīng)離心機(jī)4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20-30分鐘，獲得上清液即為粗酶液； C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達(dá)到50-60%，靜置2-4小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30-40分鐘，取上清液； D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為93-97%，靜置2-4小時(shí)，經(jīng)離心機(jī)4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心40-50分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ； Ejf D步驟所得的粗制S0D，加入3-5倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過(guò)的溶液通過(guò)低溫真空濃縮至原體積的1/3-1/4 ； F、將E步驟所得濃縮液經(jīng)SephadexG-75凝膠柱或DEAE- Sephadex A-50離子交換柱進(jìn)行提純；凝膠柱的洗脫液為5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶；離子交換柱的洗脫液為5-300mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進(jìn)行梯度洗脫； G、將F步驟所得洗脫液經(jīng)低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 S0D。
2.如權(quán)利要求1所述的一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，其特征在于，所述50mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有l(wèi)mmol/L的EDTA、0.4mmol/L的鹿糖、0.01%巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9。
3.如權(quán)利要求1所述的一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，其特征在于，所述5mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有l(wèi)mmol/L的巰基乙醇，且緩沖液的pH值為 7.9。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從油菜葉中提取高純度SOD（超氧化物歧化酶）的方法。取新鮮的油菜葉1重量份，加入2-3重量份的磷酸鉀緩沖液中，勻漿、離心獲得葉綠體；再將葉綠體放入磷酸鉀緩沖液中，結(jié)合超聲波處理，離心獲得粗酶液；加硫酸銨沉淀獲得粗SOD，凈離子交換柱分離、濃縮、冷凍干燥獲得高純度的SOD制品。該方法生產(chǎn)SOD具有純度高、成本低、易推廣應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12N9-02
【公開(kāi)號(hào)】CN104711233
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310679110
【發(fā)明人】張濤
【申請(qǐng)人】張濤
【公開(kāi)日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2013年12月14日