專利名稱：肺癌相關(guān)表皮生長因子受體egfr外顯子突變定量檢測試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子病理診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用于準確定量檢測與肺癌相關(guān)的表皮 生長因子受體EGFR突變的方法。
背景技術(shù)：
肺癌危害性大且致死率高，目前是全世界癌癥死因的第一名，1995年全世界有 60萬人死于肺癌，而且每年人數(shù)都在上升，2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的死亡率是 110萬/年，發(fā)病率是120萬/年，肺癌中75% 80%為非小細胞肺癌。晚期肺癌病人采 用放、化療等治療手段不僅降低了生存質(zhì)量，且療效不佳。易瑞沙(Iressa，即吉非替尼 Gefitinib)是目前臨床使用最為成功的晚期肺癌靶向治療藥物，為EGFR酪氨酸激酶抑制 劑(Tyrosine Kinase inhibitors, TKI)，臨床試驗證實對東方人(亞洲人為主)、女性、非 吸煙者、肺泡細胞癌或腺癌患者的療效較好。進一步的研究表明，非小細胞肺癌患者EGFR 基因(NG-007726)上18，19，20，21外顯子上的突變狀態(tài)與易瑞沙治療效果顯著相關(guān)，其中 攜帶18，19，21外顯子的突變型的非小細胞肺癌患者對易瑞沙治療效果明顯好于非突變型 患者，而攜帶20外顯子上的突變型則對易瑞沙耐受。目前，測序方法仍然是檢測核酸序列突變的金標準，但是該方法對于所取樣本中 的腫瘤細胞的比例要求較高，一般大于50%，并且突變率低于20%的核苷酸突變，不能有 效檢測和判讀，因此會造成假陰性。相比于測序技術(shù)，其它分子生物學檢測方法，如熒光定 量PCR，高效液相色譜技術(shù)等，存在結(jié)果不能準確定量等問題，因此會導致假陽性或假陰性。Pyrosequencing (焦磷酸測序)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，被廣泛用于基 因型分析領(lǐng)域。該技術(shù)無須進行電泳，DNA片段也無須特殊的熒光標記，操作極為簡便。 Pyrosequencing技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應(yīng)，在每一輪 測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中 并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM 轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種 dNTP,繼續(xù)DNA鏈的合成。相比傳統(tǒng)測序技術(shù)和熒光定量PCR檢測方法，降低了樣本取材的 要求(只需較少的腫瘤組織，低腫瘤細胞含量仍可檢測)，具有更高的靈敏度，可定量檢測 低至1 %的突變，準確性高，更適合于高通量分析，結(jié)果直觀，判讀更加簡單、準確、快速，具 有無可比擬的優(yōu)勢。本發(fā)明通過對EGFR基因型序列分析，設(shè)計了特異的生物素標記引物，利用PCR和 焦磷酸測序技術(shù)，準確定量檢測與肺癌相關(guān)的表皮生長因子受體EGFR外顯子突變頻率。該 方法可快速準確的定量基因型頻率，其重要意義在于(1)指導肺癌患者有針對性用藥，避 免無效用藥；(2)改善預(yù)后；( 避免獲得耐藥；(4)降低對樣本組織的取材要求；(5)減少 醫(yī)療費用。對以EGFR為靶點的靶向藥物，如易瑞沙，僅對EGFR突變基因型(18，19，21外顯 子)有效，EGFR20外顯子突變基因型會導致耐藥，因此，啟動靶向治療前應(yīng)進行突變檢測。未經(jīng)靶點檢測或檢測結(jié)果假陰性或假陽性而盲目用藥不僅可能導致高額的經(jīng)濟損失，還可 能會貽誤寶貴的治療時機，甚至導致病情惡化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種準確定量檢測與肺癌相關(guān)的表皮生長因 子受體EGFR外顯子突變檢測試劑盒。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述試劑盒的檢測方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑盒，它包括(1)擴增EGFR基因18，19，20，21外顯子的引物其核苷酸序列如SEQ ID N0:1禾口 SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 2 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 4 和SEQ ID NO 8所示引物對；(2)測序引物其核苷酸序列如 SEQ ID NO 9SEQ ID NO 10SEQ ID NO =IlSEQ ID NO :12所示；(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQID NO :4SEQ ID NO :5SEQ ID NO :6SEQ ID NO :7在其5，端標記生物素；在一次檢驗中共同使用。上述肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑盒，具體包括如 下試劑(I)DNA提取試劑購自QIAGEN公司；(2)反應(yīng)液PCR Buffer，引物 SEQ ID N0:1 12，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具體為0. 1% (ν/ν)NP-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (w/v) g/ mL BSA，0. 1% (v/v)Tween-20,0. 06Μ ρΗ8· 9 Tricine0(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0. 2MNa0H, IOmM pH 7. 6Tris_Acetate溶 液，結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；其中，結(jié)合緩沖液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl，ImM EDTA，0. 1 % (ν/ν) Tween-20 ；退火緩沖液具體為20mM pH 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂。(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物 APS，熒光素和dNTP。上述肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑盒的檢測方法， 包括如下步驟(1)提取石蠟標本組織中的基因組DNA ；(2)以步驟(1)中所得DNA為模板，擴增EGFR基因18，19，20，21外顯子序列片段；(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產(chǎn)物與親和素標記的磁珠結(jié)合進行單鏈純化；(4)將步驟( 得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；(5)測序得到SNP突變頻率。步驟O)中所述的擴增EGFR基因18外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10 X PCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L, SEQ ID NO:50. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。步驟O)中所述的擴增EGFR基因19外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :20. 3 μ L，SEQ ID NO: 60. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。步驟O)中所述的擴增EGFR基因20外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :30. 3 μ L，SEQ ID NO: 70. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。步驟O)中所述的擴增EGFR基因21外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10 X PCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :40. 3 μ L，SEQ ID NO: 80. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。有益效果本發(fā)明的一種用于準確定量檢測與肺癌相關(guān)的表皮生長因子受體 EGFR外顯子突變的試劑盒，應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)可以準確定量突變位點的突變頻率，可用 于臨床啟動EGFR-TKI用于治療非小細胞肺癌前的靶標位點EGFR突變檢測。本發(fā)明方法操 作簡單，敏感性高，降低了樣本取材要求，結(jié)果易于判讀，大大降低了檢測結(jié)果的假陽性或 者假陰性率，為患者避免無效有害的治療，節(jié)省寶貴的治療時間。


圖1為1例病人石蠟活檢組織標本18外顯子G719S檢測結(jié)果圖，GGC,未發(fā)生突變。圖2為1例病人石蠟活檢組織標本19外顯子2235_2M9dell5檢測結(jié)果圖，未發(fā)
生缺失。圖3為1例病人石蠟活檢組織標本20外顯子T790M檢測結(jié)果圖，ACG,未發(fā)生突變。圖4為1例病人石蠟活檢組織標本21外顯子L858R檢測結(jié)果圖，CTG，突變率為
2· 1 % ο
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 試劑。(I)DNA 提取試劑購自QIAGEN 公司。(2)反應(yīng)液PCR Buffer 購自美國 Fermentas 公司；引物SEQ ID NO :1 12，由上海英俊生物科技有限公司合成；
MgCl2 購自美國 Fermentas 公司；0. 2mM dNTPs 購自美國 Fermentas 公司；2U/ μ L Taq DNA 聚合酶購自美國 Fermentas 公司。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液購于杭州長征化學試劑有限公司；0. 2Μ NaOH 購于上海試四赫維化工有限公司；IOmM Tris-Acetate (pH 7.6) :Tris_base 購于美國 Sigma 公司，無水乙酸購于杭 州化學試劑有限公司；結(jié)合緩沖液由IOmM Tris-HCl (Tris_base購于美國Sigma公司，鹽酸購于杭州化 學試劑有限公司)，2M NaCl (購于上海試四赫維化工有限公司)，ImM EDTA(購于杭州化學 試劑有限公司)，0. (v/v)Tween 20(購于美國Sigma公司)組成；退火緩沖液由20mM Tris-Acetate (pH 7. 6) (Tris-base 購于美國 Sigma 公司， 無水乙酸購于杭州化學試劑有限公司)，2mM醋酸鎂(購于上海試四赫維化工有限公司)組 成；親和素標記的磁珠(購于 GE healthcare Bioscience AB)。(4)測序試劑DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶購于QIAGEN公司；底物APS和熒光素購于QIAGEN公司；四種 dNTP (dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)購于 QIAGEN 公司。實施例2 檢測方法。儀器Bio-RadS1000 PCR儀，Beckman Microfuge 22R 臺式微量冷凍離心機，北京 六一瓊脂糖凝膠電泳儀、上海培清凝膠成像系統(tǒng)，QIAGEN PyroMark Q96ID測序儀。(1)提 取石蠟標本組織DNA，具體步驟如下將石蠟標本置于二甲苯中，去除石蠟；加入裂解緩沖 液和蛋白酶K，在變性條件下消化組織，裂解細胞；置于90°C孵育，逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)；將裂 解液通過硅膠膜使DNA吸附到硅膠膜上，加入漂洗液洗滌雜質(zhì)，最后將高純、濃縮的DNA從 硅膠膜上洗脫，得到基因組DNA收集液。(2)以步驟(1)所得DNA為模板，利用EGFR特異性引物進行PCR擴增；擴增EGFR基因18外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10 X PCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L, SEQ ID NO: 50. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs, 2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。擴增EGFR基因19外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :20. 3 μ L，SEQ ID NO: 60. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs, 2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。擴增EGFR基因20外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :30. 3 μ L，SEQ ID NO: 70. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs, 2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。
擴增EGFR基因21外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10 X PCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :40. 3 μ L，SEQ ID NO: 80. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ；PCR擴增條件為-MV 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。(3) 將步驟( 得到的PCR擴增產(chǎn)物與親和素標記的磁珠結(jié)合進行單鏈純化 在使用前，保證所有溶液都達到室溫； 在 PSQ 96 板中加入 45 μ 1 annealing buffer，然后每孔加入 SEQ ID NO :3 測 序引物(IOuM) IuL ； 使用Vertex混勻S印harose beads，將需要使用的s印haroe beads總量(每樣 本3yL)轉(zhuǎn)移至Ij 一個Eppendorf■管中，在s印harose bead中力口入binding buffer，使得平 均每個樣品約有50 μ L的體積，將混合物混勻； 將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50 μ L反應(yīng)體積)中，每樣本50 μ L，將PCR產(chǎn)物在 常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結(jié)合； 在Vacuum prep workstation中，四個樣品板中依次加入180mL高純水、70%乙 酉享、washing buffer 禾口 120ml Denaturation buffer ； 打開 vacuum prep workstation 的泵，將 vacuum prep tool 在高純水中清洗 30
vacuum prep tool PCR IS.Φ, MM sepharose beads, vacuum prep tool 放入70%乙醇中5秒，然后移到denatureation buffer中5秒，再移至Ij crashing buffer中 清洗10秒，把吸頭放在相應(yīng)含有測序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關(guān)掉泵，將vacuum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放s印harose beads ； 使用高純水清洗vacuum pap tool。將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫后 放入測序儀中。(4)將步驟( 得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；(5)測序結(jié)果讀取突變頻率。將本發(fā)明方法用于1例臨床活檢石蠟組織標本的鑒定，測序圖如圖1 4所示。結(jié) 果經(jīng)Saner測序驗證正確。
權(quán)利要求
1.一種肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑盒，其特征在于它 包括(1)擴增EGFR基因18，19，20，21外顯子的引物其核苷酸序列如SEQID NO :1和SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :4 禾口 SEQ ID NO :8所示引物對；(2)測序引物其核苷酸序列如SEQID NO 9 12所示；(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 在其 5，端標記生物素；在一次檢驗中共同使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑 盒，其特征在于它包括如下試劑(1)DNA提取試劑購自QIAGEN公司；(2)反應(yīng)液PCRBuffer,引物 SEQ ID NO :1 12，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ LTaqDNA聚合酶；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0. 2MNa0H，IOmM pH 7. 6Tris_Acetate 溶液， 結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒 光素和dNTP。
3.肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑盒的檢測方法，其特征 在于它包括如下步驟(1)提取石蠟活檢標本組織中的基因組DNA；(2)以步驟(1)中所得DNA為模板，擴增EGFR基因18，19，20，21外顯子序列片段;(3)將步驟( 得到的PCR擴增產(chǎn)物與親和素標記的磁珠結(jié)合進行單鏈純化；(4)將步驟( 得到的單鏈純化產(chǎn)物進行焦磷酸測序；(5)測序得到SNP突變頻率。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑 盒的檢測方法，其特征在于步驟O)中所述的擴增EGFR基因18外顯子序列片段的方法如 下PCR 擴增體系為10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ ID NO :50. 3 μ L， Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑 盒的檢測方法，其特征在于步驟O)中所述的擴增EGFR基因19外顯子序列片段的方法如 下PCR 擴增體系為10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :20. 3μ L, SEQ ID NO :60. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑 盒的檢測方法，其特征在于步驟O)中所述的擴增EGFR基因20外顯子序列片段的方法如下PCR 擴增體系為10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :30. 3 μ L，SEQ ID NO :70. 3 μ L， Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑 盒的檢測方法，其特征在于步驟O)中所述的擴增EGFR基因21外顯子序列片段的方法如 下PCR 擴增體系為10 X PCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :40. 3μ L, SEQ ID NO :80. 3μ L, Template DNA 3μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ；40 個循環(huán)，94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 40s ；72°C 3min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肺癌相關(guān)表皮生長因子受體EGFR外顯子突變定量檢測試劑盒，它包括擴增EGFR基因18，19，20，21外顯子的引物、測序引物和親和素標記的磁珠。本發(fā)明還公開了上述試劑盒的制備方法和使用方法。本發(fā)明檢測方法不僅靈敏度高，可檢測低至1％的突變，而且結(jié)果直觀，判讀更加簡單、準確、快速，大大降低檢測結(jié)果的假陰性率，避免臨床上患者無效的靶向藥物選擇，為患者節(jié)省寶貴的治療時間，提高患者生活質(zhì)量。
文檔編號C12Q1/68GK102140518SQ20111002098
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者任緒義, 張峰, 虞閏六 申請人:杭州迪安醫(yī)學檢驗中心有限公司