包含表皮生長因子的囊泡和含有所述囊泡的組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)、美容學(xué)和組織工程的領(lǐng)域,特別地屬于在其組成 中包含表皮生長因子(EGF)的囊泡類型的釋放系統(tǒng)的領(lǐng)域。本發(fā)明的囊泡具有相比于游離 的EGF而言經(jīng)改善的治療效力。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 基于由并入了在治療上有活性的物質(zhì)的兩親性分子構(gòu)成的囊泡系統(tǒng)(通常,脂質(zhì) 體)的藥物釋放系統(tǒng)是制藥業(yè)中最常使用的系統(tǒng)之一,因為它們可以提供活性成分的更大 的穩(wěn)定性,增加其穿過生物膜的滲透性,和允許活性物質(zhì)緩慢釋放而無需反復(fù)施用。
[0003] EGF是在組織再生期間刺激細胞增殖和運動性的主要生長因子之一。它還通過 調(diào)節(jié)上皮細胞的增殖和其迀移來幫助維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。此外,EGF誘導(dǎo)血管發(fā)生,其 為組織提供了營養(yǎng)支持(Hudson 和 McCawley, J. Microsc. Res. Tech. 1998, 43:444-455 ; Koivisto 等人,Exp. Cell Res. 2006,312:2791-2805 ;Liang 等人,Wound Repair Regen. 2008, 16:691-698)。該生長因子在制藥領(lǐng)域中(Wong 等人,Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001,18:51-71 ;Girdler等人,Am. J. Clin. Oncol. 1995, 18:403-406 ;Haedo等人,Rev. Esp. Enferm. Dig. 1996, 88:409-413 ;Majima, Ophthalmologica 1998,212:250-256), 在美容學(xué)中(Hasegawa 和 Yamamoto, Mech. Ageing Dev. 1992, 66:107-114 ;US 專 利號 5,618,544),和在組織工程中(Christopher 等人,Biomacromolecules 2011,12:3139-3146)具有多種應(yīng)用。
[0004] 已經(jīng)開發(fā)出了采用不同脂質(zhì)體系統(tǒng)的EGF制劑。作為例子可提及:將EGF包括 在包含磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰膽堿(PC)和膽固醇的單層脂質(zhì)體中(Brown等人,Ann. Surg. 1988, 208:788-794)。還報道了將EGF包括在包含PC、膽固醇和透明質(zhì)酸(Yerushalmi 等人,Arch. Biochem. Biophys. 1994, 313:267-273)或者包含膽固醇和二棕櫚?;字?膽堿(DPPC) ( Alemdaroglll等人,J. Biomed. Mater. Res. A 2008, 85A:271-283 ; Degim 等人,Int. Wound. J. 2011,8:343-354)的多層脂質(zhì)體中。已報道的另一類脂質(zhì)體為多囊泡 脂質(zhì)體,其包含二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)、二肉豆蔻?;字8视停―MPG)、膽固醇和 油酸甘油酯(Li 等人,Arch. Pharm. Res. 2005, 28:988-994)。
[0005] 另一方面,已報道了包含與EGF相綴合的陽離子型脂質(zhì)的脂質(zhì)體(Kikuchi等 人,Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227:666-671);包覆有聚乙二醇(PEG)的脂質(zhì) 體,其還包含與PC或與DPPC相組合的膽固醇和二油?;字R掖及罚―OPE) (Li等 人,Int. J. Pharm. 2003,258:11-19)。還已報道了包含DPPC和溶血磷脂酰膽堿(LPC)的 脂質(zhì)體(Saddi 等人,The Angle Orthodontist 2008,78:604-609 ;Alves 等人,Life Sci.2009, 85:693-699)。
[0006] 采用脂質(zhì)體系統(tǒng)的EGF制劑也已受到專利保護,例如這樣的專利,其公開了: "EGF/脂質(zhì)體"凝膠組合物,以及包括將EGF包載在包含中性和帶負電荷的磷脂的脂質(zhì)體中 的方法(US專利號4944948);脂質(zhì)體的凝膠組合物,以及使用帶負電荷的脂質(zhì)體和EGF并 且包括帶負電荷的脂質(zhì)例如PG、PC和膽固醇的方法(國際專利申請?zhí)朩O 9009782)。另一 個專利申請涉及局部使用在脂質(zhì)體中的EGF以防止糖尿病性足的切斷術(shù),并且使用包含PC 和脫氧膽酸鈉的脂質(zhì)體。該專利申請限制于EGF的任何類型的脂質(zhì)體/非離子型表面活性 劑脂質(zhì)體(niosomes)用于通過局部途徑來治療糖尿病性足的IV和V級慢性局部缺血性損 傷的用途(國際專利申請?zhí)朩O 2007/073704)。在現(xiàn)有技術(shù)中,還未發(fā)現(xiàn)將EGF整合入由膽 固醇和陽離子型表面活性劑構(gòu)成的囊泡系統(tǒng)中。
[0007] 用于獲得脂質(zhì)體的傳統(tǒng)方法例如薄膜蒸發(fā)(Agrawal等人,J. Liposome Res. 2005, 15:141-155)、脫水-再水化(Kirby 和 Gregoriadis, Nat. Biotechnol. 1984, 2:979-984)、冷凍-解凍(Ristori 等人,Biophys. J. 2005, 88:535-547) 和擠出(MacDonald 等人,Biochim. Biophys. Actal991, 1061:297-303)具有某些缺點。這 些缺點中的一些與大量的之后難以去除的溶劑的使用相關(guān),或者與由這些方法中的一些所 要求的高溫相關(guān),這些將其使用限制于熱穩(wěn)定的物質(zhì)。另一方面,材料的大小和納米構(gòu)造結(jié) 果難以控制,并且它們是在擴大期間(多階段工藝過程)具有低的可重復(fù)性的方法。脂質(zhì) 體制備物的另一個缺點是其差的穩(wěn)定性。
[0008] 用壓縮流體(CF)或高密度氣體(無論以液態(tài)還是以超臨界狀態(tài))作為溶媒來 進行的材料加工在學(xué)術(shù)和工業(yè)上都喚起了很大的期望,以用于制備微米結(jié)構(gòu)化或納米結(jié) 構(gòu)化的材料,例如具有比用常規(guī)方法而得到的那種更大的結(jié)構(gòu)均一性的顆粒材料、囊泡系 統(tǒng)、復(fù)合顆粒、結(jié)構(gòu)化表面等(Holmes 等人,Chem. Eur. J. 2003, 9:2144-2150 ;Cooper, Adv. Mater. 2001,13: im-1114;Cooper,Adv. Mater. 2003,15:1049-1059 ;Woods 等人,了· Mater. Chem. 2004, 14:1663-1678)。CF或高密度氣體是存在于其臨界溫度和壓力附近或 之上的并且在正常條件下為氣體的物質(zhì)。在超臨界的區(qū)域或接近超臨界條件的區(qū)域中,CF 以獨特的相存在,具有在氣體特性和液體特性之間的中間特性。最常使用的CF為二氧化 碳(CO2),其被歸類為綠色溶劑,因為它是無毒的,不易燃的,易于去除,在顆粒中沒有殘留, 便宜,并且易于回收。自90年代之初起,整個開發(fā)了一系列方法,其使用CF來制備具有 微米范圍、亞微米范圍和納米范圍的顆粒大小的微細材料(Jung和Perrut, J. Supercrit. Fluid,2001,20:179-219)。CF的溶劑化能力可以通過溫度和組成的變化而發(fā)生改變(如在 常規(guī)液體溶劑的情況下一樣),和還通過壓力的變化(其在溶液內(nèi)快得多地進行傳傳播)而 發(fā)生改變。因此,這些脫溶方法共同地具有在非常短的時間段內(nèi)達到非常高的過飽和程度 的能力,這有助于向著晶體生長方向發(fā)展的成核作用,并由此獲得具有非常窄的大小分布、 受控的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和超分子組織的微米顆?;蚣{米顆粒。
[0009] 用于用CF來獲得微米結(jié)構(gòu)化或納米結(jié)構(gòu)化的材料的方法之一是 稱為 DEL0S-SUSP (Depre ssurization of an Expanded Liquid Organic Solution-SUSPension (經(jīng)膨脹的液體有機溶液-懸浮液的減壓))的方法(國際 專利申請?zhí)?WO 2006/079889 ;專利號 EP 1843836 ;Can〇-Sarabia 等人,Langmuir 2008, 24:2433-2437),其基于事先用CF使之膨脹的有機溶液的減壓,通過所述減壓而產(chǎn)生 微米分散或納米分散系統(tǒng)。在該過程中,CF作為共溶劑起作用,所述共溶劑在確定的壓力 和溫度條件下與作為微米分散或納米分散系統(tǒng)的待穩(wěn)定化的溶質(zhì)的有機溶液是完全可混 溶的。所述穩(wěn)定化通過在介質(zhì)(通常為水性介質(zhì))中添加劑的存在來實現(xiàn),在所述介質(zhì)上 進行經(jīng)膨脹的溶液的減壓,其中所述添加劑可以為乳化劑、離子型和非離子型去污劑、表面 活化劑、膠體穩(wěn)定劑和保護劑。通過該方法,可以獲得微米分散和/或納米分散系統(tǒng),例如 脂質(zhì)體、乳狀液或懸浮液。脂質(zhì)體或囊泡由膽固醇和其他膜試劑(例如磷脂和表面活性劑) 構(gòu)成,并且對于其制備,需要將膽固醇和/或其他脂質(zhì)溶解在經(jīng)膨脹的有機溶液中,和使后 者在表面活性劑的水溶液中減壓。
[0010] 為了可能通過DELOS-SUSP將活性物質(zhì)摻入到囊泡或脂質(zhì)體中,和為了產(chǎn)生相應(yīng) 的囊泡,需要將活性物質(zhì)溶解在初始的經(jīng)膨脹的有機溶液中,或者溶解在其中進行所述經(jīng) 膨脹的溶液的減壓的水溶液中,并且在這兩種情況下,所述溶解應(yīng)當(dāng)在脂質(zhì)、去污劑或表面 活化劑存在下進行。
[0011] 在陽離子型表面活性劑之中,季銨類型的陽離子型表面活性劑(QUAT)已在制藥 領(lǐng)域中和在美容學(xué)中廣泛使用。在制藥領(lǐng)域中,已經(jīng)通過局部、眼、口服、頰和鼻途徑來使 用它們。以前,報道了使用DELOS-SUSP技術(shù)來制備膽固醇:溴化鯨蠟基三甲基銨(CTAB) 的納米囊泡。通過該技術(shù)來摻入水溶性化合物的例子為描述于參考文獻"Liposomes and other vesicular Systems: structural characteristics, methods of preparation, and use in nanomedicine