重組表皮生長因子egf及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了重組表皮生長因子EGF基因，它是人工體外合成的，以組氨酸標(biāo)簽（His6-Tag）-SUMO蛋白酶識別底物為蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的輔助片段，以EGF為目的片段的融合表達(dá)蛋白質(zhì)，并使EGF以無啟動子的正確閱讀框架與載體正序相連并轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌種，最終構(gòu)建與表達(dá)三種物質(zhì)串聯(lián)的融合蛋白。在咪唑存在下進(jìn)行金屬螯合介質(zhì)純化，一步獲得90%純度的融合蛋白質(zhì)，利用高特異性和高活性SUMO蛋白酶對所純化的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，使標(biāo)簽部分HS與EGF目的蛋白解離，并利用金屬螯合介質(zhì)將標(biāo)簽部分與EGF目的蛋白分離。獲得了純度達(dá)95%的無首位Met的天然結(jié)構(gòu)和活性2.2╳108IU/mg的目的蛋白的。每毫克費(fèi)用由1.05元降至0.32元。
【專利說明】重組表皮生長因子EGF及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及重組的表皮生長因子EGF基因、重組表皮生長因子EGF及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]早在60年代初Montalcini和Cohen教授在純化小鼠頜下腺神經(jīng)生長因子(NGF)時(shí)發(fā)現(xiàn)一組可促進(jìn)新生小鼠提早開眼、長牙且對熱穩(wěn)定的多肽類物質(zhì)。最早發(fā)現(xiàn)它具有抑制胃酸分泌作用，故又稱抑胃素。隨后將這一活性組份加入培養(yǎng)的皮膚表皮時(shí)發(fā)現(xiàn)，它可直接促進(jìn)表皮生長，為此定名為表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)。1974年從人尿中提純出人的表皮生長因子(hEGF)。
[0003]EGFCEpidermal Growth Factor),表皮生長因子,是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個(gè)氨基酸殘基組成的肽類活性物質(zhì)，分子量6201 Da，分子內(nèi)有6個(gè)半胱氨酸組成的三對二硫鍵，形成3個(gè)分子內(nèi)環(huán)型結(jié)構(gòu)，組成生物活性所必須的受體結(jié)合區(qū)域。EGF無糖基部位，非常穩(wěn)定，耐熱耐酸，廣泛存在于體液和多種腺體中，主要由頜下腺、十二指腸合成，在人體的絕大多數(shù)體液中均已發(fā)現(xiàn)，在乳汁、尿液、精液中的含量特異性地增高，但在血清中的濃度較低。
[0004]EGF能刺激表皮細(xì)胞生長因子受體之酪氨酸磷酸化，達(dá)到修補(bǔ)增生的效果。對受傷、受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效。其最大特點(diǎn)是能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，從而以新生的細(xì)胞代替衰老和死亡的細(xì)胞。
[0005]EGF還能止血，并具有加速皮膚和粘膜創(chuàng)傷愈合，消炎鎮(zhèn)痛，防止?jié)兊墓π?，EGF的穩(wěn)定性能極好，在常溫下不易失散流動，能與人體內(nèi)各種酶形成良好的協(xié)調(diào)效應(yīng)。最初的EGF主要被運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可刺激多種細(xì)胞的`增殖，主要是表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。用于角膜損傷、燒燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合取得了很好的療效，Montalcini和Cohen教授因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)表皮生長因子并分析其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，1986年諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獲獎(jiǎng)。
[0006]EGF能增強(qiáng)表皮細(xì)胞的活力；延緩表皮細(xì)胞的老化，使肌膚各組成成份保持最佳生理狀態(tài)。高活性的EGF才能促進(jìn)皮膚細(xì)胞的分裂和生長，此外它還能刺激細(xì)胞外一些大分子(如透明質(zhì)酸和膠原白等)的合成與分泌、滋潤皮膚，是決定肌膚活力和健康的源泉。
[0007]EGF主動與傷口附近細(xì)胞膜上的特異性受體相結(jié)合，從而激活蛋白酶，加快蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，促進(jìn)皮膚和粘膜創(chuàng)面愈合并養(yǎng)活疤痕收縮，快速高效修復(fù)創(chuàng)傷。應(yīng)用于皮膚組織的各種損傷，去除暗瘡、痤瘡、去痣后的小缺損，換膚后的脫皮、發(fā)紅以及果酸等使用后導(dǎo)致的皮膚灼傷、磨削后的表皮損傷修復(fù)等具有突出的效果。上海波恩(國際)斯諾美授權(quán)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)服務(wù)中心A80部EGF能促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖分化，使衰老死亡的細(xì)胞得以及時(shí)補(bǔ)充，使損傷的表皮得以即時(shí)修復(fù)，可用于對換膚、褪紅、毛細(xì)血管擴(kuò)張等各種不良膚質(zhì)的調(diào)整，改善肌膚薄、粗糙、疤痕等不良狀況，使肌膚恢復(fù)光潔和平滑。
[0008]促進(jìn)成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞代謝、增殖和生長，促進(jìn)彈性纖維細(xì)胞的發(fā)育及增強(qiáng)其功能，激活老化細(xì)胞的再生，加速細(xì)胞的新陳代謝和更新，快速代謝老化角質(zhì)，修復(fù)斷裂的淺表皮成纖維細(xì)胞，從而消除皺紋。通過上海波恩(國際)斯諾美授權(quán)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)服務(wù)中心A80部EGF等活性因子促進(jìn)真皮層內(nèi)纖維母細(xì)胞的增殖，修復(fù)老化的膠原纖維與彈性纖維；更多地合成和分泌膠原蛋白、透明質(zhì)酸等大分子；改善皮膚微循環(huán)，提供良好的營養(yǎng)環(huán)境，維持一定量的皮膚脂肪，還原肌膚彈性，使其均勻緊致，減少皺紋。
[0009]EGF能促進(jìn)表皮組織上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的生長、分裂，加快新陳代謝，增強(qiáng)其表皮細(xì)胞活性，從而使細(xì)胞保持質(zhì)與量的完善，使皮膚皺紋消失，顯示出緊實(shí)、柔嫩、光潔和富有彈性的健康美。促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝(抗衰老):EGF能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化。上海波恩(國際)斯諾美授權(quán)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)服務(wù)中心A80部EGF能夠使成熟細(xì)胞逆分化形成“干細(xì)胞島”，同時(shí)遏制衰老基因的表達(dá)。EGF從根本上改變皮膚細(xì)胞構(gòu)成，降低皮膚細(xì)胞平均年齡，令肌膚光潔靚麗。
[0010]對較黑膚色的皮膚和各類皮膚色素沉著，EGF可通過促進(jìn)新生細(xì)胞來替代衰老細(xì)胞，以降低皮膚中黑色素和有色細(xì)胞的含量；并且可增加皮膚血流量，改善皮膚微循環(huán)，為表皮細(xì)胞提供良好的營養(yǎng)環(huán)境，防止代謝產(chǎn)物淤積，有效改善皮膚色澤，使較黑膚色和各類色素沉著的皮膚白皙完美，均勻靚麗。對較黑皮膚和各類皮膚色素沉著，加快細(xì)胞增生，促進(jìn)皮下毛細(xì)血管網(wǎng)分布，促進(jìn)血液循環(huán)，使皮膚黑色素加快排出，有效減少黑色素的沉積，起到美白淡斑的作用。
[0011]改善皮膚微循環(huán)(光潔)，促進(jìn)透明質(zhì)酸合成和分泌(滋潤)=EGF能促進(jìn)細(xì)胞外透明質(zhì)酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增強(qiáng)皮膚的親水性，保持皮膚內(nèi)水分。EGF能改善皮膚微循環(huán)，令氣血通暢，防止代謝產(chǎn)物淤積，使皮膚富有營養(yǎng)。維持真皮內(nèi)的水分；肌膚恢復(fù)健康，表皮內(nèi)角質(zhì)層水分保持能力增強(qiáng)，讓肌膚滋潤散發(fā)活力。
[0012]EGF是極為安全的，因?yàn)樗且环N人體本身就能夠產(chǎn)生的生物因子，在年輕的時(shí)候，人體自身能夠產(chǎn)生足夠多的EGF，促使表皮細(xì)胞生長，但隨著年齡的減退，EGF的產(chǎn)生量逐步下降，因此表皮細(xì)胞的更新速度就越來越慢了。正是EGF為人體本身之組成部分，故沒有任何毒副作用，十分安全。使用EGF護(hù)`膚品，相比于一些其它的抗皺方法，安全更是卓越的優(yōu)點(diǎn)。
[0013]EGF在未來的市場上的應(yīng)用將會非常的廣泛，我們對EGF的基因進(jìn)行了改造，使其與sumo載體相連接，最大化的簡便了純化的工藝與提高蛋白的回收率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的是為了更加方便的進(jìn)行表皮生長因子EGF的純化，降低生產(chǎn)成本，以可溶性天然構(gòu)象形式融合表達(dá)，提高EGF的活性，而提供一種重組的表皮生長因子EGF基因、重組表皮生長因子EGF及其制備方法。
[0015]重組的表皮生長因子EGF基因，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0016]重組的表皮生長因子EGF，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0017]重組的表皮生長因子EGF的制備方法，它包括:
1)人工合成序列表SEQID N0.1所不的基因；
2)插入表達(dá)載體中；
3)轉(zhuǎn)染至大腸桿菌中表達(dá)；破碎細(xì)菌，取可溶性部分即為融合蛋白粗提物；
4)在咪唑存在下進(jìn)行金屬螯合介質(zhì)純化；5)用SUMO蛋白酶酶切，并利用金屬螯合介質(zhì)將標(biāo)簽部分與EGF目的蛋白分離、純化；所述的步驟5)為:粗提物通過用20mM Tris-HCl, pH 8.0,0.15M NaCl，20mM咪唑緩沖液平衡過的1.6X20cm IMAC柱，并用含有0.15M NaCl的緩沖液洗脫，所述的緩沖液為:20mM Tris-HCl, pH 8.0 200mM咪唑；收集目的蛋白峰部分并進(jìn)行10倍稀釋，緩沖液為20mMTris-HCl, pH 8.0，加入1%的特異性高活性SUMO蛋白酶，于30°C水浴中酶切目的蛋白4hr，樣品再次過IMAC液相色譜柱，收集流川部分再經(jīng)過緩沖液20mM Tris-HCl, pH8.0, ImMEDTA平衡的DEAE-S印harose 4 Fast Flow柱，結(jié)合在層析柱上的EGF用含有0.5M NaCl的TE緩沖液20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA進(jìn)行0-100%連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分；
所述的表達(dá)載體為攜帶T7強(qiáng)啟動子且含有多克隆位點(diǎn)的表達(dá)載體；
所述的表達(dá)載體為pET28a ；
所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0018]本發(fā)明詳述:本文中所使用術(shù)語“EGF”，是指能夠在體內(nèi)外發(fā)揮表皮生長功能的基因工程產(chǎn)品，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，為忠實(shí)于天然EGF氨基酸序列，合成基因時(shí)特意設(shè)計(jì)將天然EGF首位氨基酸Asn的密碼子AAT置于SUMO蛋白酶識別底物氨基酸序列Gly-Gly的密碼子GGTGGT之后，所說的EGF是以不含Met為首位氨基酸殘基的基因工程重組 EGF。
[0019]本文所使用的術(shù)語“EGF”是指經(jīng)基因工程融合表達(dá)、簡易工藝純化、酶切去除輔助分子伴侶而獲得的純天然結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品，其生物活性由于表達(dá)形式的轉(zhuǎn)變應(yīng)等同于或高于現(xiàn)有工藝制備的產(chǎn)品。
[0020]其中為了基因連接方便在基因合成時(shí)于融合蛋白基因的5'末端添加了 NdeI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，并利用NdeI限制性內(nèi)`切酶識別位點(diǎn)中的ATG作為首位啟動密碼子，翻譯表達(dá)融合蛋白首位氨基酸Met。同時(shí)在融合的蛋白基因的3'端加入限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別序列GAATTC，以便使基因片段和載體連接時(shí)均形成粘性末端，利于基因連接。為使表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到高效表達(dá)，將大腸桿菌偏性密碼子引入到其中，以使產(chǎn)物適合在大腸桿菌中表達(dá)。
[0021]利用本發(fā)明方法制備的EGF與原工藝產(chǎn)物進(jìn)行了活性對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明專利制備的樣品生物活性顯著優(yōu)于現(xiàn)有工藝產(chǎn)品。
[0022]本文中所使用術(shù)語“活性測定”是指利用中國生物制品規(guī)程所描述的EGF標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，即利用不同濃度的EGF促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞Balb/c-3T3的增殖作用(參考中國藥典附錄(2005版，第三部)，抗EGF生物活性測定法，其活性單位以IU/ml表示)。
[0023]用于構(gòu)建本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的HS-EGF分子是以N端Met為起始的蛋白質(zhì)分子，依次添加便于純化的HIS6的基因序列和SUMO酶切識別底物基因序列，其后是EGF基因序列，并以終止密碼子TAA結(jié)束。
[0024]本發(fā)明中使用通用的DNA合成儀在1000A固相載體上合成編碼這些融合蛋白的核苷酸序列。為了便于與特定重組載體進(jìn)行連接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶(如NdeI和EcoRI)酶切位點(diǎn)，并造成適于連接的粘性末端?？砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)，克隆編碼這些合成的閱讀框架通暢的基因(或以其cDNA或基因組DNA形式)，DNA重組操作中，一般使用標(biāo)準(zhǔn)的基因克隆和亞克隆技術(shù)進(jìn)行基因片段的轉(zhuǎn)移和連接。使用限制性酶切法鑒定序列連接方向的正確性和可能的突變，最后以DNA測序進(jìn)行序列確認(rèn)。
[0025]通過技術(shù)人員計(jì)算機(jī)分析和圓二色譜檢測證明EGF蛋白質(zhì)分子是以正確的二硫鍵形式進(jìn)行折疊的。
[0026]重組蛋白質(zhì)基因?qū)⒈豢刹倏v地連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列上，如連接到適于在大腸桿菌中使用的T7、trp或λ啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止信號上?？墒褂靡阎霓D(zhuǎn)化方法，如適于原核細(xì)胞的氯化鈣處理法將本發(fā)明的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到所選擇的宿主細(xì)胞中。可基于質(zhì)粒上所含抗生素抗性基因所賦予的抗生素抗性來選擇被轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞。一旦表達(dá)了所需的融合蛋白質(zhì)，即可按照本領(lǐng)域已知的方法分離并純化該融合蛋白質(zhì)。例如，可從發(fā)酵培養(yǎng)物中離心收集菌體細(xì)胞并用溶菌酶和超聲波裂解之，然后超速離心并在低濃度磷酸鹽(約20mM)溶液中加入飽和硫酸銨進(jìn)行分步沉淀。依次經(jīng)IMAC層析和離子交換層析(IEC)純化所需的EGF重組蛋白質(zhì)。
[0027]—般說來，使用聚丙烯酰胺凝膠以SDS-PAGE電泳法分析各柱層析洗脫部分，并以免疫印跡法監(jiān)測之。對重組融合蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)以檢測重組EGF的生物學(xué)活性(具體操作見中國藥典，2005版，第三部，附錄XH)。
[0028]本發(fā)明提供了人工體外合成的，重組的表皮生長因子EGF基因，它是以組氨酸標(biāo)簽(His6-Tag)-SUM0蛋白酶識別底物(以下簡稱為:HS片段)為蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的輔助片段，以EGF為目的片段的融合表達(dá)蛋白質(zhì)，并使EGF以無啟動子的正確閱讀框架與載體正序相連并轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌種，最終構(gòu)建與表達(dá)三種物質(zhì)串聯(lián)的融合蛋白。在咪唑存在下進(jìn)行金屬螯合介質(zhì)純化，一步獲得90%純度的融合蛋白質(zhì)，利用高特異性和高活性SUMO蛋白酶對所純化的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，使標(biāo)簽部分HS與EGF目的蛋白解離，并利用金屬螯合介質(zhì)將標(biāo)簽部分與EGF目的蛋白分離。獲得了純度達(dá)95%的無首位Met的天然結(jié)構(gòu)和活性
2.2 X 108IU/mg的目的蛋`白的。每毫克費(fèi)用由1.05元降至0.32元。
[0029]可將本發(fā)明的EGF蛋白質(zhì)作為基本活性成分，并加入一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床應(yīng)用的藥物組合物或美白化妝產(chǎn)品。所說的載體或賦形劑包括但不只限于磷酸鹽緩沖鹽水、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根據(jù)所治療的疾病的不同，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入一種或多種與本發(fā)明的蛋白質(zhì)有輔助或協(xié)同作用的其他天然的、合成的或重組的活性化合物。另外，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸及金屬陽離子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白質(zhì)保護(hù)劑，以及聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的穩(wěn)定劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1顯示用于表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下借助實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識到，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍的限制。
[0032]實(shí)施例1 =HS-EGF表達(dá)載體和工程菌的制備 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定a.基因合成:本發(fā)明中按照前文所述的設(shè)計(jì)理念進(jìn)行酶切位點(diǎn)和HS-EGF全基因序列的設(shè)計(jì)并人工體外合成如下序列:
NdeI內(nèi)切酶識別序列(CATATG) +His6+SUM0+EGF多肽基因+終止密碼子(TAA) +EcoRI內(nèi)切酶識別序列(GAATTC)，基因序列見SEQ ID NO: 1，本合成序列直接克隆入大連Takara公司提供的T載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)菌，經(jīng)PCR鑒定確定陽性克隆株，陽性克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)，常規(guī)分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒DNA，利用Ndel、EcoRI雙酶切本質(zhì)粒和PET28a質(zhì)粒，回收目的片段和PET28a質(zhì)粒載體粘性末端片段，以正確的閱讀框架在T4連接酶(Promega)存在下將目的片段插入到同樣酶切的PET28a質(zhì)粒載體中，構(gòu)建融合蛋白雙鏈表達(dá)基因并轉(zhuǎn)化JM109工程菌。
[0033]b.經(jīng)PCR鑒定確定陽性克隆株，陽性克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)，常規(guī)分子克隆技術(shù)提取質(zhì)粒DNA，利用Ndel、EcoRI雙酶切PET28a_HS_EGF質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，然后陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，并將被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)于含卡那霉素(50μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，以擴(kuò)增質(zhì)粒DNA。培養(yǎng)完成后，破碎細(xì)胞，離心收集質(zhì)粒并純化質(zhì)粒DNA測序，含有測序正確的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株即為工程菌株，SEQ ID NO:1顯示了所測得的融合蛋白重組基因的核苷酸序列。圖1顯示了重組質(zhì)粒pET28a-HS-EGF的構(gòu)建。
[0034]實(shí)施例2:融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及EGF產(chǎn)物的純化:
將攜帶重組基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)(含有T7 RNA聚合酶基因)培養(yǎng)在含有卡那霉素(50yg/ml)的LB瓊脂平皿上。培養(yǎng)后挑選卡那霉素抗性菌落，于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)，當(dāng)A_達(dá)到約0.4~0.6時(shí)加入ImM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(終濃度lmM)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時(shí)，以誘導(dǎo)目的產(chǎn)物的表達(dá)。然后離心分離細(xì)胞和培養(yǎng)基，并將含有目的蛋白質(zhì)的菌體中加入緩沖液成分，終濃度達(dá)50mM Tris-HCl, pH8.0,超聲破碎，4°C離心(20，OOOg, 30分鐘)，取可溶性部分即為融合蛋白粗提物(氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示)。
`[0035]粗提物通過用20mM Tris-HCl, pH 8.0，0.15M NaCl，20mM咪唑緩沖液平衡過的
1.6 X 20cm IMAC 柱(Pharmacia)，并用含有 0.15M NaCl 的緩沖液(20mM Tris-HCl, pH 8.0200mM咪唑)洗脫。收集目的蛋白峰部分并進(jìn)行10倍稀釋(緩沖液為20mM Tris-HCl, pH
8.0)，加入1%的特異性高活性SUMO蛋白酶，于30°C水浴中酶切目的蛋白4hr，樣品再次過IMAC液相色譜柱，收集流川部分再經(jīng)過緩沖液(20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA)平衡的DEAE-Sepharose 4 Fast Flow柱(Pharmacia),結(jié)合在層析柱上的EGF用含有0.5M NaCl 的TE緩沖液(20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA)進(jìn)行0-100%連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分，于_20°C下儲存?zhèn)溆?。如此純化的蛋白質(zhì)純度>95% (氨基酸序列見SEQ IDN0:3)。
[0036]實(shí)施例3:利用體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞Balb/c_3T3測定EGF的生物學(xué)活性作用，(具體操作參考中國藥典2005版，第三部附錄XH)。
[0037]細(xì)胞增殖試驗(yàn):
將培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞Balb/c-3T3單層細(xì)胞經(jīng)0.5%胰蛋白酶消化，吹打收集細(xì)胞懸液，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板記數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為60000個(gè)/ml，按照85 μ I/孔加入到96孔培養(yǎng)板中(每孔5000細(xì)胞)，5% C02，37°C條件下培養(yǎng)4h。調(diào)整制備的新、舊兩種工藝制備的EGF起始濃度為lmg/ml，定量的樣品經(jīng)過濾除菌，按等倍稀釋法將不同量的樣品加入各細(xì)胞孔中，然后補(bǔ)足培養(yǎng)基，使之總體積為100 μ I, 5% C02，37°C條件下培養(yǎng)48h。然后棄去細(xì)胞板中上清液，每孔加入50 μ I染色液,室溫放置30min后，用流水沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100μ 1，室溫放置5min，混勻后，用酶標(biāo)儀以630nm為參比波長，在波長570nm出測定吸光度，記錄測定結(jié)果。
[0038] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行參數(shù)回歸計(jì)算:對各實(shí)驗(yàn)樣品的各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)OD值、預(yù)稀釋倍數(shù)、樣本梯度等數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行處理。分別計(jì)算各實(shí)驗(yàn)樣品的半效稀釋倍數(shù)，并計(jì)算50%效應(yīng)點(diǎn)的濃度(見表1)。
【權(quán)利要求】
1.重組的表皮生長因子EGF基因，其堿基序列如序列表SEQID N0.1所示。
2.重組的表皮生長因子EGF，其堿基序列如序列表SEQID N0.3所示。
3.重組的表皮生長因子EGF的制備方法，它包括: 1)人工合成序列表SEQID N0.1所不的基因； 2)插入表達(dá)載體中； 3)轉(zhuǎn)染至大腸桿菌中表達(dá)；破碎細(xì)菌，取可溶性部分即為融合蛋白粗提物； 4)在咪唑存在下進(jìn)行金屬螯合介質(zhì)純化； 5)用SUMO蛋白酶酶切，并利用金屬螯合介質(zhì)將標(biāo)簽部分與EGF目的蛋白分離、純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組的表皮生長因子EGF的制備方法，其特征在于:所述的表達(dá)載體為攜帶T7強(qiáng)啟動子且含有多克隆位點(diǎn)的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組的表皮生長因子EGF的制備方法，其特征在于:所述的表達(dá)載體為pET28a。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組的表皮生長因子EGF的制備方法，其特征在于:所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3、4、5或6所述的重組的表皮生長因子EGF的制備方法，其特征在于:所述的步驟5)為:粗提物通過用20mM Tris-HCl, pH 8.0,0.15M NaCl,20mM咪唑緩沖液平衡過的1.6X20cm IMAC柱，并用含有0.15M NaCl的緩沖液洗脫，所述的緩沖液為:20mM Tris-HCl, pH 8.0 200mM咪唑；收集目的蛋白峰部分并進(jìn)行10倍稀釋，緩沖液為20mMTris-HCl, pH 8.0，加入1%的特異性高活性SUMO蛋白酶，于30°C水浴中酶切目的蛋白4hr，樣品再次過IMAC液相色譜柱，收集流川部分再經(jīng)過緩沖液20mM Tris-HCl, pH8.0, ImMEDTA平衡的DEAE-S印harose 4 Fast Flow柱，結(jié)合在層析柱上的EGF用含有0.5M NaCl的TE緩沖液20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA進(jìn)行0-100%連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分。
【文檔編號】C07K14/485GK103834664SQ201410117214
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】張國利, 史飛, 劉雨玲, 李澤鴻, 田園, 于佳, 何苗 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所