專利名稱：表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株(rDEVul41HA)及其構(gòu)建 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地涉及重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗領(lǐng)域。 本發(fā)明提供一種表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201026，命名為rDEVul41HA，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又稱鴨病毒性腸炎病毒。能引起鴨、 鵝和其它雁形目禽類發(fā)生急性、熱性、敗血性為特征的烈性傳染病。但對(duì)DEV的研究相對(duì)于其它皰疹病毒而言相對(duì)比較少。故第八次國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)報(bào)告將其分類為皰疹病毒 [1]，而未能進(jìn)一步將其進(jìn)行分類。直到最近，其全序列才被全部測(cè)通[2]。自2007年，本研究室開始了 DEV疫苗株基因組的測(cè)序工作，通過(guò)構(gòu)建DEV疫苗株全基因組粘粒文庫(kù)，分段對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和分析，至2009年中期，已將DEV疫苗株全基因組測(cè)序工作完成。幾乎同時(shí)，Li等也報(bào)道了 DEV疫苗株全基因組的測(cè)序和分析結(jié)果，其基因組大小約為158Kb，約編碼78個(gè)蛋白。通過(guò)對(duì)DEV疫苗株基因組基因構(gòu)成及結(jié)構(gòu)分析，DEV被認(rèn)為是α皰疹病亞科中的中間型病毒，與水痘病毒屬成員更為相近β]。而同為禽類皰疹病毒的馬立克病毒(MDV)和火雞皰疹病毒(HTV)屬于馬立克病毒屬，雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和鸚鵡皰疹病毒O3SHV) 為傳染性喉氣管炎病毒屬。
自上世紀(jì)80年代成功利用痘苗病毒為載體表達(dá)單純皰疹病毒的TK基因以來(lái)，人們開始嘗試用各種不同DNA病毒為載體，表達(dá)不同外源基因，并將構(gòu)建的重組疫苗用于人和各種不同動(dòng)物疾病的預(yù)防。大量的研究結(jié)果表明，皰疹病毒因其基因組大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被認(rèn)為是一種良好的構(gòu)建重組活疫苗的病毒載體。截止目前， 已有大量的相關(guān)研究報(bào)道。在常見畜禽皰疹病毒疾病中，如以偽狂犬病毒(PRV)為載體， 分別在gD、gE、gG和TK等基因中插入CSF的E2等外源基因，并用其免疫豬，取得了良好的免疫效果[4-"]。用在雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的ULO和UL50中分別插入不同HA基因構(gòu)建成功的重組病毒免疫雞，均效果良好[11 ]。同樣，Sakaguchi M(1993 ；1994)和Sonoda K (1996)等分別在MDVl的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫1日齡無(wú)特定病原雞 (SPF雞)，1周后用vMDV、vvMDV攻毒，其對(duì)SPF雞的保護(hù)效率為80 100% [.16]；在MDVl 的USlO中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重組病毒對(duì)MDV強(qiáng)毒的保護(hù)效率與對(duì)照MDVl相當(dāng)[17,18] ；Tsukamoto K等(2002)以Pec作為傳染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因的啟動(dòng)子插入火雞皰疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之間成功構(gòu)建重組病毒，用其免疫的SPF雞足以抵抗IBDV強(qiáng)毒的攻擊[19]。現(xiàn)在，我國(guó)用于鴨瘟預(yù)防的疫苗主要是上世紀(jì)60年代研究成功的雞胚弱化活疫苗。作為α皰疹病亞科一員，DEV也應(yīng)該是一種良好的構(gòu)建重組活疫苗的病毒載體。但DEV的基因組成及結(jié)構(gòu)與MDV等有著較大的差異，如 MDV的基因組結(jié)構(gòu)為TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS，而DEV基因組的結(jié)構(gòu)是UL-IRS-US-TRS。且 DEV與同亞科的另外幾種畜禽皰疹病毒在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)復(fù)制的生物學(xué)特點(diǎn)也不盡相同。因3此，在PRV、MDV、ILTV中可穩(wěn)定插入外源基因的位點(diǎn)不一定適用于DEV。
由于對(duì)DEV的研究相對(duì)滯后，至今為止，國(guó)內(nèi)外關(guān)于DEV基因中復(fù)制非必需區(qū)的研究報(bào)道仍是空白。常用于構(gòu)建皰疹病毒重組病毒的方法有三種。一種是同源重組；第二種是將病毒基因組插入BAC中，然后在BAC上構(gòu)建突變，用其轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞拯救出重組病毒； 第三種是將含有相互重疊區(qū)的皰疹病毒基因片段分別插入粘粒中，并在其相應(yīng)區(qū)段上構(gòu)建突變，再用其共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞拯救出重組病毒。然而對(duì)于DEV這種基礎(chǔ)研究缺乏、分類不清楚、非必需基因未知的病毒而言，用第一或第二種方法構(gòu)建重組病毒工作量大，且效率低。 而第三種方法的難點(diǎn)在于多粘粒感染性克隆的建立，如果這個(gè)平臺(tái)構(gòu)建成功，將能快速有效的構(gòu)建重組病毒。至今，皰疹病毒的這種感染性克隆構(gòu)建技術(shù)已比較成熟，且已見諸報(bào)道[20-27]O
本研究室在前期研究中，在鴨病毒性腸炎病毒的基因組中鑒定出可供外源基因穩(wěn)定插入的復(fù)制非必需區(qū)。在此基礎(chǔ)之上，本研究將目前中國(guó)用于禽流感預(yù)防的疫苗株血凝素(HA)基因插入DEV基因組的UL41基因中，用其免疫無(wú)特定病原鴨(SPF鴨)能使SPF 鴨產(chǎn)生良好的對(duì)抗流感的抗體，同時(shí)還不影響DEV的免疫效果。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號(hào)為CCTCC V201026，命名為rDEVul41Ha，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。具體地， 本發(fā)明利用重組克隆技術(shù)，將包含禽流感病毒血凝素(HA)基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段SV40-HA(所述基因片段的核苷酸序列為SEQ ID NO 1)插入到鴨腸炎病毒(duck enteritisvirus，DEV)的UL41基因中，構(gòu)建獲得在UL41基因中插入SV40-HA表達(dá)框的粘粒pF0Slul41SV40HA，由其拯救獲得表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201026，命名為rDEVul41HA。本發(fā)明還涉及構(gòu)建該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的方法，以及該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎和禽流感的疫苗的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號(hào)為CCTCCV201(^6，命名為rDEVul41HA，其于 2010年10月沈日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)武漢，武漢大學(xué))。所述表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201(^6在鴨病毒性腸炎病毒DEV基因組的UL41基因(SEQ ID NO 5)中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段SV40-HA(SEQID NO :1)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201026的方法，所述方法包括下述步驟
(1)構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒(DEV)基因組的R)smid文庫(kù)，并從中選擇用于拯救鴨病毒性腸炎病毒的5粘粒組合系統(tǒng)，將它們分別命名為pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5， 其中pFOSl粘粒包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的UL41基因；
(2)利用步驟(1)中獲得的包含DEV基因組中的UL41基因的粘粒PFOS 1，在該粘粒的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段 SV40-HA(SEQ ID NO 1)，構(gòu)建重組突變粘粒；和
(3)利用步驟O)中獲得的重組突變粘粒和步驟(1)中獲得的5粘粒組合系統(tǒng)中的pF0S2、pF0S3、pF0S4和pF0S5共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，拯救出重組病毒株CCTCC V201026，將其命名為 rDEVul41HA。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述步驟(1)中得到的5粘?？寺∷镍啿《拘阅c炎病毒DNA片段兩端都含有Fse I-SbfI-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒全基因組(它們的重疊和覆蓋模式可參見圖9)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述步驟(2)中的禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉堿性裂解位點(diǎn)的HA基因，其由2006年從安徽分離的H5W型禽流感毒株(其詳細(xì)名稱為A/ duck/Anhui/106/2006(H5Nl)，由本發(fā)明人所在的國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室保存，該實(shí)驗(yàn)室是國(guó)內(nèi)合法保存禽流感病毒的機(jī)構(gòu))擴(kuò)增得到；上述步驟( 中的SV40啟動(dòng)子序列來(lái)源于包含SV40啟動(dòng)子的質(zhì)粒，例如，pSI質(zhì)粒(購(gòu)自Promega公司)等。
本發(fā)明所用的鴨病毒性腸炎病毒為DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBank EU082088)(中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)，目錄編號(hào)AV1222 ；購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。
在本研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，HA基因的插入位置不影響所構(gòu)建的重組疫苗株對(duì)鴨病毒性腸炎病毒的免疫效果(數(shù)據(jù)未顯示)。但HA基因插入其他位置，是否會(huì)影響其對(duì)鴨病毒性腸炎病毒的保護(hù)效果需要實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供所述表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201026的應(yīng)用，其用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒弓I起的傳染病的疫苗。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒引起的傳染病包括鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒在鴨、鵝和其它雁形目禽類中引起的傳染病，例如，由鴨病毒性腸炎病毒DEV引起的鴨病毒性腸炎，由禽流感病毒A/duck/LN/51/2005 (H5N1)和 A/duck/HuB/49/2005 (H5N1)等引起的禽流感等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種疫苗，其包括本發(fā)明所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201026,以及藥用佐劑、 賦形劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所述疫苗的應(yīng)用目的、進(jìn)行免疫的禽類等因素，可以容易地選擇適合的藥用佐劑、賦形劑等。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗可以有效用于預(yù)防由鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒在鴨、鵝和其它雁形目禽類中引起的傳染病，例如，有效用于預(yù)防由鴨病毒性腸炎病毒DEV引起的鴨病毒性腸炎，由禽流感病毒A/duck/LN/51/2005 (H5N1)和A/duck/ HuB/49/2005 (H5N1)等引起的禽流感等。
因此，本發(fā)明提供下述
1.表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號(hào)為 CCTCC V201(^6，命名為 rDEVul41HA。
2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中在鴨病毒性腸炎病毒DEV基因組的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA 基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段SV40-HA，所述基因片段的核苷酸序列為SEQ ID NO :1。
3.根據(jù)第1項(xiàng)或第2項(xiàng)所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉堿性裂解位點(diǎn)的血凝素HA 基因，其由H5m型禽流感毒株A/duck/Anhui/106/2006(H5Nl)擴(kuò)增得到。
4.權(quán)利要求2所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段替換所述鴨病毒性腸炎病毒基因組的UL基因的第506到891位的核苷酸片段。
5.根據(jù)第2項(xiàng)所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述SV40啟動(dòng)子序列來(lái)源于包含SV40啟動(dòng)子的質(zhì)粒，例如pSI質(zhì)粒。
6.構(gòu)建第1項(xiàng)所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟
(1)構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒DEV基因組的R)smid文庫(kù)，并從中選擇用于拯救鴨病毒性腸炎病毒的5粘粒組合系統(tǒng)，將它們分別命名為pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中pFOSl粘粒包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的UL41基因；
(2)利用步驟(1)中獲得的包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的UL41基因的粘粒 pFOSl，在該粘粒的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段SV40-HA(SEQ ID NO :1)，構(gòu)建重組突變粘粒；和
(3)利用步驟O)中獲得的重組突變粘粒和步驟(1)中獲得的5粘粒組合系統(tǒng)中的pF0S2、pF0S3、pF0S4和pF0S5共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，拯救出重組病毒株CCTCC V201026，將其命名為 rDEVul41HA。
7.根據(jù)第6項(xiàng)所述的方法，其中步驟(1)中得到的5粘粒組合系統(tǒng)中的每一個(gè)粘粒克隆所包含的DEV DNA片段兩端都含有Fse I-Sbf I-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒全基因組。
8.第1項(xiàng)所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的應(yīng)用，其用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒引起的傳染病的疫苗。
9.根據(jù)第8項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒引起的傳染病包括鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒在鴨、鵝和其它雁形目禽類中引起的傳染病。
10. 一種疫苗，其包括第1項(xiàng)所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，以及藥用佐劑、賦形劑等。


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中
圖 1 :PCClFos 粘粒圖譜；
圖2 拯救的病毒dDEV與親本DEV疫苗株病毒基因組分別用BamH I.EcoR I.BbvC I酶切后的脈沖電泳圖譜，其中DEV 親本DEV疫苗株(即用于構(gòu)建重組病毒的親本病毒疫苗株)，dDEV:由本發(fā)明人構(gòu)建和篩選的5粘粒系統(tǒng)(參見實(shí)施例1-3)拯救出的三株病毒， Ml 低范圍 PFG 分子標(biāo)記(Low Range PFG Marker) ；M2 :DL15000 分子標(biāo)記；M3 λ -HindIII 消化分子標(biāo)記(λ-Hind III digest Marker)；
圖 3 :pUC ccdB kan 質(zhì)粒圖譜；
圖 4 :pF0Slul41Kan ccdB 粘粒圖譜；
圖 5 :pENTR MCS 質(zhì)粒圖譜；
圖6 :pSI HA質(zhì)粒圖譜；
圖 7 :pENTR sv40_ha 質(zhì)粒圖譜；
圖 8 :pF0Slul41SV40HA 粘粒圖譜；
圖9 鴨病毒性腸炎病毒感染性克隆拯救重組病毒示意圖10 重組病毒HA基因在CEF中的表達(dá)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖11 =PCR檢測(cè)外源表達(dá)框架在rDEVul41Ha中的情況；
圖12 免疫重組病毒后，在SPF鴨體內(nèi)誘導(dǎo)HI抗體的情況。
圖13 =SEQ ID N0:1 :SV40_HA表達(dá)框架，其中斜體加粗部分為禽流感血凝素HA基因。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說(shuō)明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
實(shí)施例1. DEV疫苗株基因組R)smid文庫(kù)的構(gòu)建
按EPICENTRE 公司"CopyControl Fosmid Library Production Kit，，試劑盒說(shuō)明書構(gòu)建DEV基因組的R)smid文庫(kù)。
方法如下將DEV 疫苗株病毒(CVCC AV 1222) (GeneBank EU082088)(中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)，目錄編號(hào)AV1222 ；購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所) DNA用物理方法即用25號(hào)針頭(購(gòu)自上海治宇醫(yī)療器械有限公司)抽吸多次進(jìn)行切斷處理，用T4DNA聚合酶(T4DNAPolymerase，購(gòu)自New England Biolabs)及堿性磷酸酶 (AlkalinePhosphatase，購(gòu)自New England Biolabs)對(duì)DNA片段進(jìn)行末端平滑化及去磷酸化處理，脈沖電泳(用BiO-Rad公司CHEF Mapper XA Pulsed Field系統(tǒng)進(jìn)行脈沖電泳，脈沖電泳的條件為電泳緩沖液為0. &TBE，瓊脂糖膠濃度為1%，程序?yàn)橛^-SOK)，回收 381Λρ-481Λρ之間的DNA片段。將回收后的DEV DNA片斷兩端用"Γ4連接酶連接上Fse I-Sbf I-Pme I接頭，精制后連接到pCClR)s(購(gòu)自EPICENTRE，圖譜見圖1)載體上，4°C過(guò)夜連接。 對(duì)混和液進(jìn)行包裝，轉(zhuǎn)染大腸桿菌EPI300-T1 (購(gòu)自EPICENTRE)。對(duì)文庫(kù)滴度進(jìn)行確認(rèn)，其試驗(yàn)過(guò)程如下將包裝好的混和液進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取10_2，ΙΟ"4, ΙΟ"5,10_6四個(gè)稀釋度的稀釋液10 μ 1感染100 μ 1ΕΡΙ300-Τ1細(xì)胞，將此菌涂于含12. 5 μ g/ml氯霉素的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，并計(jì)算其滴度，結(jié)果為3. 8xl05cfU/lib。即成功構(gòu)建DEV 的fosmid文庫(kù)。
實(shí)施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的選擇
文庫(kù)構(gòu)建成功后，挑取286個(gè)克隆提取粘粒，用堿裂解法[5]提取粘粒，送大連寶生物公司對(duì)插入PCC1R)S中的DEV DNA片段末端進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物序列如下
Primer 1 :5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’
Primer 2 :5’ -GCCAAGCTATTTAGGTGAGA-3’
經(jīng)過(guò)末端測(cè)序的分析，共得到插入片段兩端都連接有完整Fse I-SbfI-Pme I接頭的克隆250個(gè)。從這250個(gè)克隆中選取多組用于拯救DEV的5粘粒組合。其中每組中克隆的DEV DNA片段兩端都含有Fse I-SbfI-PmeI接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋全DEV基因組。7
實(shí)施例3.病毒拯救
用Qiagen公司的中量提取試劑盒提取所選擇的粘粒的DNA。用Fse I.Sbfl或Rne I內(nèi)切酶(均購(gòu)自New England Biolabs)對(duì)所選擇的粘粒進(jìn)行線性化處理，反應(yīng)條件如下 ^fI內(nèi)切酶20U(也可以使用Fse I或Riie I內(nèi)切酶)，粘粒10 μ g，37°C作用1小時(shí)，酚/ 氯仿抽提，乙醇沉淀制備轉(zhuǎn)染用DEV DNA。
參照Reddy SM (2002)的磷酸鈣方法將5段DEV DNA共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞 (CEF)[28]，經(jīng)多次重復(fù)，其中有3組5粘粒組合轉(zhuǎn)染4-6天后可見CEF出現(xiàn)DEV病毒典型病變，選取重復(fù)性較好的一組5粘粒組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收獲此組5粘粒共轉(zhuǎn)染拯救的病毒， 命名為dDEV，用此dDEV與親本DEV病毒(即用于構(gòu)建該感染性克隆的親本病毒)分別接種次代CEF。
CEF的制備方法如下取9-10日齡SPF雞胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭氣室部位，脫碘后無(wú)菌取出雞胚，放置到盛有Hank’ s液(購(gòu)自HyClone)的平皿中洗滌，并去除頭、四肢和內(nèi)臟，用剪刀剪碎。用0.25%的胰酶(4mL/胚)在37°C水浴中消化4_5分鐘，棄去胰酶，用Hank’ s液洗滌2次。加入適量的含血清與雙抗(青霉素100u/mL，鏈霉素IOOmg/ mL)的M199營(yíng)養(yǎng)液(購(gòu)自HyClone)，吹打使細(xì)胞分散，用四層紗布過(guò)濾后制成IO6-IO7細(xì)胞 /毫升的細(xì)胞懸液，最后分裝于培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。36-48小時(shí)后，按毒種細(xì)胞培養(yǎng)液體積為1 1000將病毒接種于CEF。待細(xì)胞病變達(dá)到100%時(shí)，收集培養(yǎng)液；4°C 6000g 離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片；取上清50000g離心2小時(shí)富集病毒；然后經(jīng)20%和60%蔗糖密度梯度離心，50000g離心2小時(shí)，回收20%和60%中間層；之后經(jīng)50000g離心2小時(shí)超速離心脫糖處理獲得純化好的病毒。提取病毒全基因組DNA[29]，分別用BamH I.EcoR I和 BbvC 1(均購(gòu)自New EnglandBiolabs)對(duì)原疫苗株DEV和dDEV進(jìn)行酶切。反應(yīng)條件如下 分別取BamHI、EcoR I和BbvC I各20U，分別與DEV基因組DNA 8 μ g混和，于50 μ 1體系中37°C作用1小時(shí)。用Bio-Rad公司CHEF Mapper XA Pulsed Field系統(tǒng)進(jìn)行脈沖電泳，脈沖電泳的條件為電泳緩沖液位0. 5x TBE，瓊脂糖膠濃度為1%，程序?yàn)镮-70K。
拯獲的病毒酶切圖譜和親本病毒相同，如圖2所示。說(shuō)明所選擇的5粘粒組成功拯救DEV病毒。本發(fā)明人將所選擇的5粘粒組成員分別命名為pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、 PF0S5，該5粘?？寺∷腄EVDNA片段兩端都含有Fse I-SbfI-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋全DEV基因組(它們的重疊和覆蓋模式可參見圖9)，并且其中pFOSl包含 DEV基因組的UL41基因(SEQ ID NO 5)。關(guān)于該5粘粒系統(tǒng)本發(fā)明人已經(jīng)申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01010207207. 8，題目為“鴨病毒性腸炎病毒疫苗株感染性克隆系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用”，申請(qǐng)日期為2010年6月13日。
實(shí)施例4.在DEV基因組的UL41基因中插入SV40-HA表達(dá)框架(SEQ IDNO 1)的重組突變粘粒的構(gòu)建
基于上述實(shí)施例1-3結(jié)果，在所選擇的5粘粒組成員pFOSl中DEV基因組的UL41 基因中，具體為缺失UL41基因的第506到891位核苷酸，并代之以插入SV40-HA表達(dá)框架， 即SV40-HA表達(dá)框架替換所述UL基因(SEQ ID NO 5)的第506到891位的核苷酸片段(其中SV40-HA表達(dá)框架的核苷酸序列為SEQ ID NO :1，其中包含SV40啟動(dòng)子，也參見圖13，其中斜體加粗部分為HA基因(SEQ ID NO :4))，構(gòu)建1個(gè)重組突變粘粒，pF0Slul41SV40HA (該突變粘粒的圖譜如圖8所示，其構(gòu)建模式可參見圖9)。在本研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，HA基因的插入位置不影響其對(duì)鴨病毒性腸炎病毒的免疫效果。但HA基因插入其他位置，是否會(huì)影響其對(duì)鴨病毒性腸炎病毒的保護(hù)效果需要實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。
pF0Slul41SV40HA粘粒的構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)述如下
4. IpUC ccdB kan 的構(gòu)建
用表1所示的三對(duì)引物(由TaKaRa公司合成)分別對(duì)hvitrogen公司Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2TlCompetent Cells 試劑盒中提供的“RfA”(其中基因?yàn)閍atRl-氯霉素-ccdB-aatR2)基因(SEQ ID NO 2)進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增。
表1 用于克隆“Rfkan” (SEQ ID NO :3，其中基因?yàn)閍atRl-卡那霉素 -ccdB-aatR2)基因的PCR引物
引物名稱序列tRl5'- GCG TCT AGA ATC ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCT GAA CG-3' (XbaI)tR25'- GTG ATT TAAAT TCC ACA CAT TAT ACG AGC CGG-3'P6K15，-CCG GCT CGT ATA ATG TGT GGA ATT TAA ATC ACA TCT CAA CCATCATCG-3'P6K25'- CAG CGC GCA AAT ACG CAT ACA TTT AAA TCG AGC TCG AAT TCGATG AA-3'ccdBl5'- TCG ATT TAAATG TAT GCG TAT TTG CGC GCT G-3'ccdB25'- GCG AAG CTT ATC ACC ACT TTG TAC AAG AAA G-3' (HindIII)
其具體過(guò)程簡(jiǎn)述如下分別用tRl和tR2，以及ccdBl和ccdB2這兩對(duì)引物從 Reading Frame Cassette A中擴(kuò)增到aatRl基因及ccdB_aatR2基因，其反應(yīng)條件為 950C 5min-35*(94°C 45s_54°C 45s_72°C 45s)-72°C IOmin0 然后用 P6K1 和 P6K2 這對(duì)引物從PM0D6質(zhì)粒(購(gòu)自EPICENTRE公司)中擴(kuò)增到卡那霉素抗性基因，其反應(yīng)條件為95°C 5m in-35*(94°C 45s-54°C 45s_72°C 45s)-72°C lOmin。分別純化這三個(gè)片段DNA，并以此三個(gè)片段共同作為模板，以tRl和ccdB2作為引物，擴(kuò)增得到RfKan基因(SEQ ID NO :3)，即其基因?yàn)?aatRl-卡那霉素-ccdB-aatR2，其反應(yīng)條件為95°C 5min_35* (94°C 45s-54°C 45s_72°C 1. 5min)-72°C IOmin0
并將得到的"RfKan"利用XbaI和HindIII克隆入pUC 18載體(購(gòu)自TaKaRa公司)中，獲得pUC ccdB kan，如圖3所示。
4. 2pF0Slul41Kan ccdB 粘粒的構(gòu)建
用表2所示的引物UL41ccdl和UL41ccd2從上述構(gòu)建的pUC ccdB kan中擴(kuò)增帶有重組臂的 ccdB基因，其反應(yīng)條件為95°C 5min-35*(94°C 45s_54°C 45s_72°C 2min) -72°C 1Omin0 用 Gene Bridges 公司的 Counter-klection BAC Modification Kit 試劑盒將所擴(kuò)增的片段克隆入PFOSl粘粒中，獲得pF0Slul41Kan ccdB粘粒，即在pFOSl粘粒的UL41基因中插入ccdB和卡那霉素抗性基因，如圖4所示。
表2 用于從pUC ccdB kan中擴(kuò)增帶有重組臂的ccdB基因的引物
引物名稱序列UL4 Iccdl5 ’ -ATT GTC AAT CGG ATG AAT GCG TAC AGG AAG GCG ATG TAT GCC AGG AGT ATC ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCT G-3 ‘UL41ccd25 ’ - CAA CAC GGC ATG AAC AGA CTT CAG TAT AGG GTA GCG GTG TAAATC AGT ATC ACC ACT TTG TAC AAG AAA G-3 ’
4. 3pENTR MCS 質(zhì)粒的構(gòu)建
^jjJ i^f^^it,^., ^JfftM invitrogen ^W] Gateway Vector ConversionSystem with One Shot ccdB Survival 2TlCompetent Cells試劑盒中提供的pENTR-gus質(zhì)粒(購(gòu)自hvitrogen公司)做了以下改造將pENTR-gus中的gus基因刪除，而加入了 BamHI、 BglII、EcoRI、EcoRV、SacI、SalI、KpnI 和 XbaI 八個(gè)酶切位點(diǎn)。
用表3所示的兩條引物MCSl和MCS2，用點(diǎn)突變克隆試劑盒(購(gòu)自hvitrogen公司)將pENTR-gus改造成pENTR MCS,如圖5所示。
表3 用于將pENTR-gus改造成pENTR MCS的引物
權(quán)利要求
1.表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號(hào)為 CCTCC V201026。
2.權(quán)利要求1所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株， 其中在鴨腸炎病毒DEV的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段，所述基因片段的核苷酸序列為SEQ ID NO :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉堿性裂解位點(diǎn)的血凝素HA基因， 其由H5m型禽流感毒株A/duck/Anhui/106/2006(H5N 1)擴(kuò)增得到。
4.權(quán)利要求2所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株， 其中所述包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段替換所述UL基因的第506到891位的核苷酸片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述SV40啟動(dòng)子序列來(lái)源于包含SV40啟動(dòng)子的質(zhì)粒，例如pSI質(zhì)粒。
6.構(gòu)建權(quán)利要求1所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的方法，(1)構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒DEV基因組的R)smid文庫(kù)，并從中選擇用于拯救鴨病毒性腸炎病毒的5粘粒組合系統(tǒng)，將它們分別命名為pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中 pFOSl粘粒包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的UL41基因；(2)利用步驟(1)中獲得的包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的UL41基因的粘粒 pFOSl，在該粘粒的UL41基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段SEQ ID NO :1，構(gòu)建重組突變粘粒；和(3)利用步驟O)中獲得的重組突變粘粒和步驟(1)中獲得的5粘粒組合系統(tǒng)中的 pF0S2、pF0S3、pF0S4和pF0S5共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，拯救出重組病毒株CCTCC V201026，將其命名為 rDEVul41HA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(1)中得到的5粘粒組合系統(tǒng)中的每一個(gè)粘?？寺∷镍啿《拘阅c炎病毒DNA片段兩端都含有Fse I-Sbf I-Pme I接頭，相互重疊，并且拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒全基因組。
8.權(quán)利要求1所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的應(yīng)用，其用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒引起的傳染病的疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒引起的傳染病包括鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒在鴨、鵝和其它雁形目禽類中引起的傳染病。
10.一種疫苗，其包括權(quán)利要求1所述的表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201026,以及藥用佐劑、賦形劑等。
全文摘要
本發(fā)明提供一種表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201026，命名為rDEVul41HA，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。具體地，本發(fā)明利用重組克隆技術(shù)，將包含禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動(dòng)子序列的基因片段SV40-HA插入到鴨病毒性腸炎病毒的UL41基因中，構(gòu)建獲得在UL41基因中插入SV40-HA表達(dá)框的粘粒，由其拯救獲得表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201026。本發(fā)明還涉及構(gòu)建該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的方法，以及該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎和禽流感的疫苗的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102533674SQ20101059238
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者姜永萍, 柳金雄, 步志高, 陳化蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所