專利名稱：編碼h5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工合成的含有雞體偏嗜性密碼子的基因optiHA，該基因與H5亞型高致病力禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]血凝素(HA)基因的核苷酸同源率為70％，氨基酸同源率為100％，編碼并表達(dá)H5亞型禽流感病毒GD/1/96(H5N1)的血凝素(HA)蛋白。該基因可作為H5亞型流感DNA疫苗及其它基因工程疫苗的免疫原基因。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽類感染和/或疾病綜合征，AIV在分類學(xué)上屬于病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒屬(Influenza VirusA and B)----禽流感病毒(Avian Influenza Virus)。
高致病力禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)被國(guó)際獸醫(yī)局列為A類烈性傳染病(Alexander，D.J，et al.An outbreak of highlypathogenic avian influenza in turkeys in Great Britain in 1991.VeterinaryRecord，1993，132，535-536.)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，H5和H7亞型高致病力禽流感病毒(Highly Pathogenic Avian Influenza Virus，HPAIV)不但可給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，而且可以感染人并致人死亡，對(duì)HPAI的防制是關(guān)系養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展與人類生命安全的重大課題(Tran TH，et al.Avian influenza A(H5N1)in 10 patients in Vietnam.N Engl J Med.2004，350(12)1179-88.)。DNA疫苗是防制高致病力禽流感最具潛力的基因工程疫苗之一，其抗原合成和提呈過(guò)程與病原的自然感染相似，抗原蛋白經(jīng)內(nèi)源性合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，通過(guò)MHC-I類MHC-II類分子直接遞呈給免疫系統(tǒng)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)(Robinson HL.Nucleic acid vaccinesan overview.Vaccine，1997，15785-787)。
血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答，抗HA的抗體可以通過(guò)干擾病毒與唾液酸受體的結(jié)合或者病毒囊膜與內(nèi)吞體膜的融合過(guò)程從而中和病毒的感染。大量研究證明基于流感病毒HA基因的DNA疫苗可以有效保護(hù)同一HA亞型流感病毒的攻擊(Robinson HL，et al.Protection against a lethal influenzavirus challenge by immunization with a haemagglutinin-expressing plasmidDNA.Vaccine 1993，11(9)957-60.2.Kodihalli S，et al.DNA vaccine encodinghemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virusinfection in mice.Virol.1999 Mar，73(3)2094-8.3.Kodihalli S，et al.Strategies for inducing protection against avian influenza A virus subtypes withDNA vaccines.Vaccine.2000 May 22，18(23)2592-9.3)。A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]為我國(guó)最早分離的H5亞型高致病力禽流感病毒(唐秀英等.中國(guó)禽流感流行株的鑒定.中國(guó)畜禽傳染病，1998，20(1)1-5.)。研究表明，表達(dá)GD/1/96(H5N1)HA基因的DNA疫苗質(zhì)粒pCIHA不僅表現(xiàn)出了良好的免疫原性，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生的有效保護(hù)性HI抗體可以持續(xù)至一年(H Chen，et al.DNA immunization elicitshigh HI antibody and protects chicken from AIV challenge.ImmuntionalCongress Series 1219(2001)917-921.姜永萍.抗原基因密碼子及其表達(dá)載體的優(yōu)化增強(qiáng)H5亞型禽流感DNA疫苗的免疫保護(hù)效果[博士學(xué)位論文].哈爾濱，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，2004.)，但由于H5亞型禽流感DNA疫苗高劑量的依賴性造成使用成本提高，與傳統(tǒng)禽流感滅活疫苗相比經(jīng)濟(jì)可行性缺乏競(jìng)爭(zhēng)力。將異源的免疫原基因的密碼子優(yōu)化為免疫接種動(dòng)物偏嗜使用的密碼子可顯著提高DNA疫苗抗原表達(dá)效率、降低有效免疫劑量(Garmory HS，et al.DNA vaccinesimproving expression ofantigens.Genet Vaccines Ther.2003 Sep 16，1(1)2.)，并將有可能突破DNA疫苗進(jìn)一步推廣應(yīng)用的制約瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種人工合成的密碼子優(yōu)化的基因optiHA(SEQ ID NO1)，該基因含有雞體偏嗜使用的密碼子，編碼并表達(dá)H5亞型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的血凝素(HA)蛋白(SEQ ID NO2)，該基因可作為H5亞型禽流感DNA疫苗及其它基因工程疫苗的免疫原基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包含optiHA基因的表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于表達(dá)optiHA基因的宿主細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞可以是人胚胎腎細(xì)胞、COS細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞等真核細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及optiHA基因在制備H5亞型流感病毒DNA疫苗中作為免疫原基因的應(yīng)用，在亞單位疫苗、重組禽痘病毒基因工程疫苗等基因工程疫苗中作為免疫原基因的應(yīng)用，以及在單克隆抗體制備中作為免疫原基因的應(yīng)用。
本發(fā)明關(guān)于H5亞型禽流感DNA疫苗免疫原基因的密碼子優(yōu)化策略的理論依據(jù)有以下幾點(diǎn)1)禽流感病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白HA是其最主要的免疫原蛋白。
2)雞與A型流感病毒保護(hù)性免疫原HA蛋白氨基酸密碼子使用頻率存在著明顯差異。編碼氨基酸密碼子的搖擺性導(dǎo)致了不同物種間細(xì)胞在蛋白翻譯過(guò)程中具有密碼子使用的偏嗜性。由于削弱的翻譯效率，特別是相應(yīng)的tRNA含量的缺少和起始密碼子的改變，將會(huì)大大影響蛋白質(zhì)的翻譯起始和延伸效率(Hamdan FF，et al.Codon optimization improves heterologousexpression of a Schistosoma mansoni cDNA in HEK293 cells.Parasitol Res.2002 Jun，88(6)583-6.Epub 2002 Feb 16.)。雞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞在蛋白翻譯過(guò)程中具有相同的密碼子偏嗜性，但與A型流感病毒保護(hù)性免疫原HA蛋白氨基酸密碼子使用頻率存在著明顯差異，在20個(gè)氨基酸中，只有6個(gè)氨基酸使用了相同的密碼子，其余14個(gè)氨基酸的密碼子使用情況截然不同(Holm L.Codon usage and gene expression.Nucleic Acids Res.1986 Apr11，14(7)3075-87.)。
3)將異源的免疫原基因的密碼子優(yōu)化為免疫接種動(dòng)物偏嗜使用的密碼子可顯著提高抗原表達(dá)效率。將異源的免疫原基因的密碼子優(yōu)化為免疫接種動(dòng)物偏嗜使用的密碼子可顯著提高抗原表達(dá)效率，這一結(jié)果已在人類免疫缺陷病(艾滋病)的DNA疫苗研究中已得到了充分的證實(shí)。鑒于大多數(shù)慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因密碼子使用頻率嚴(yán)重偏離哺乳動(dòng)物細(xì)胞密碼子的偏嗜性，Haas J(Haas J，et al.Codon usage limitation in theexpression of HIV-1 envelope glycoprotein.Curr Biol.1996 Mar1，6(3)315-24.)等利用合成的末端重疊寡核苷酸，采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增了哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化的人類免疫缺陷病毒(HIV)MN株gp120基因，大大提高了體外表達(dá)水平，用于構(gòu)建DNA疫苗，顯著增強(qiáng)了特異性的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)水平。除Env糖蛋白，密碼子優(yōu)化的HIVGag、Gag-pol、Tat、Rev以及Nef用于DNA疫苗或重組病毒活載體疫苗同樣取得了顯著改善的特異細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)(Gao F，et al.Codon usage optimization ofHIV type 1 subtype C gag，pol，env，and nef genesin vitro expression andimmune responses in DNA-vaccinated mice.AIDS Res Hum Retroviruses.2003 Sep，19(9)817-23.)。目前幾乎所有的HIV重組疫苗都采用了密碼子優(yōu)化的免疫原基因。密碼子優(yōu)化的免疫原基因在人的乳頭瘤病毒(Cid-Arregui A，et al.A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is usefulfor DNA immunization studies.J Virol.2003 Apr；77(8)4928-37)、狗的乳頭瘤病毒(Moore RA，et al.Intraepithelial DNA immunisation with a plasmidencoding a codon optimised COPV E1 gene sequence，but not the wild-typegene sequence completely protects against mucosal challenge with infectiousCOPV in beagles.Virology.2002 Dec 20；304(2)451-9.)以及SARS冠狀病毒(Gao W，et al.Effects of a SARS-associated coronavirus vaccine in monkeys.Lancet.2003 Dec 6；362(9399)1895-6.)DNA疫苗中相繼得到應(yīng)用。密碼子優(yōu)化的免疫原基因增強(qiáng)免疫反應(yīng)的機(jī)制不僅僅涉及翻譯過(guò)程密碼子移動(dòng)速度加快。密碼子哺乳動(dòng)物偏嗜性優(yōu)化往往導(dǎo)致mRNA中CG含量的大幅度提高，因而徹底改變RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這一方面有可能增加mRNA的穩(wěn)定性，另一方面還有可能增加mRNA轉(zhuǎn)錄后從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。另外，CG含量的增加還有可能增加CpG的出現(xiàn)頻率，進(jìn)一步發(fā)揮DNA疫苗本身免疫佐劑的作用(McCluskie MJ，et al.The use of CpG DNAas a mucosal vaccine adjuvant.Curr Opin Investig Drugs.2001Jan；2(1)35-9.)。
4)重疊延伸PCR[Overlap Extension PCR(OE-PCR)]技術(shù)是免疫原基因密碼子優(yōu)化的最簡(jiǎn)單、基本的策略。重疊延伸PCR技術(shù)的基本原理是將相互互補(bǔ)重疊的兩個(gè)片段(一般基因合成公司可合成長(zhǎng)為100bp左右的寡核苷酸片段)置于同一PCR反應(yīng)體系中，控制PCR條件使其互補(bǔ)延伸后再加入片段兩邊的引物(第一個(gè)片段的上游引物與第二個(gè)片段的下游引物)繼續(xù)進(jìn)行PCR反應(yīng)而得到含有兩個(gè)片段的大片段(Mehta RK，et al.Bridge-overlap-extension PCR method for constructing chimeric genes.Biotechniques.1999 Jun，26(6)1082-6.)。對(duì)于免疫原基因的密碼子優(yōu)化，Haas J(Haas J，et al.Codon usage limitation in the expression of HIV-1envelope glycoprotein.Curr Biol.1996 Mar 1，6(3)315-24.)等利用重疊的引物及特異的酶切位點(diǎn)，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增了gp120的8個(gè)長(zhǎng)的寡核苷酸片段，然后將這8個(gè)片段以一定的順序亞克隆到載體pCdm7上而合成和構(gòu)建了gp120基因，此后這一技術(shù)被大多數(shù)研究者所采用。Kim CH(KimCH，et al.Codon optimization for high-level expression of humanerythropoietin(EPO)in mammalian cells.Gene.1997 Oct15，199(1-2)293-301.)等利用重疊延伸PCR技術(shù)(OE-PCR)技術(shù)合成了人成熟的促紅細(xì)胞生成素基因(EPO)。合成的8個(gè)長(zhǎng)為80-90bp的寡核苷酸片段互相互補(bǔ)重疊15-20bp以便于PCR反應(yīng)。首先將合成的前4個(gè)寡核苷酸片段及后4個(gè)寡核苷酸片段分別置于同一PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR，通過(guò)第一輪PCR，分別擴(kuò)增得到了編碼EPO基因的N末端半個(gè)片段和C末端半個(gè)片段，然后將兩個(gè)PCR反應(yīng)體系得到的小片段混合，并以與前面同樣的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后將含有酶切位點(diǎn)和EPO基因的5‘和3’端互補(bǔ)接頭序列的引物加入，再進(jìn)一步擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)而得到了全長(zhǎng)的EPO基因。
基于以上幾點(diǎn)，我們以寡核苷酸合成、重疊延伸PCR(OverlapExtension PCR，OE-PCR)技術(shù)、限制性內(nèi)切酶酶切和連接技術(shù)以及測(cè)序技術(shù)獲得一種新的密碼子優(yōu)化的基因optiHA，該基因與A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA基因的核苷酸同源率為70％，氨基酸同源率為100％，編碼H5亞型禽流感病毒GD/1/96(H5N1)的HA蛋白。將該基因和禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因分別插入CMV啟動(dòng)子表達(dá)載體pCI，構(gòu)建的H5亞型禽流感DNA疫苗質(zhì)粒pCIoptiHA(含基因optiHA)和pCIHA(含GD/1/96(H5N1)HA基因)分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，間接免疫熒光和Western-blot檢測(cè)證實(shí)密碼子優(yōu)化的HA基因optiHA的HA蛋白體外瞬時(shí)表達(dá)水平顯著高于野生型HA基因。隨之將pCIoptiHA及pCIHA分別以100μg和10μg劑量一次免疫3周齡SPF雞，4周后用100LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途徑進(jìn)行攻擊，結(jié)果免疫SPF雞后，100μg pCIoptiHA可形成75％的免疫保護(hù)，100μgpCIHA可形成50％的免疫保護(hù)；10μg pCIoptiHA可形成對(duì)免疫雞75％的部分免疫保護(hù)，而10μg pCIHA則基本不能形成免疫保護(hù)；pCIoptiHA誘導(dǎo)的HI抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pCIHA。結(jié)果表明，HA基因密碼子的優(yōu)化可顯著提高HA基因體外表達(dá)水平和H5亞型禽流感DNA疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)水平，提高免疫原性，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。


圖1為按照本發(fā)明的optiHA基因的核苷酸序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
圖2為片段optiHAF1-optiHAF11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖片，其中泳道1為DNA MarkerDL2000(D501A，寶生物技術(shù)工程(大連)有限公司)；泳道2為片段optiHAF1的PCR產(chǎn)物，大小為88bp；泳道3為片段optiHAF2的PCR產(chǎn)物，大小為162bp；泳道4為片段optiHAF3的PCR產(chǎn)物，大小為204bp；泳道5為片段optiHAF4的PCR產(chǎn)物，大小為162bp；泳道6為片段optiHAF5的PCR產(chǎn)物，大小為164bp；泳道7為片段optiHAF6的PCR產(chǎn)物，大小為201bp；泳道8為片段optiHAF7的PCR產(chǎn)物，大小為201bp；泳道9為片段optiHAF8的PCR產(chǎn)物，大小為155bp；泳道10為片段optiHAF9的PCR產(chǎn)物，大小為157bp；泳道11為片段optiHAF10的PCR產(chǎn)物，大小為168bp；泳道12為片段optiHAF11的PCR產(chǎn)物，大小為182bp。
圖3為基因optiHA的連接構(gòu)建策略，optiHA基因的11個(gè)片段optiHAF1-optiHAF11分別由合成的寡核苷酸片段利用重疊延伸PCR法擴(kuò)增并克隆到pBluscript載體上，之后將11個(gè)片段的克隆質(zhì)粒pBluscript-optiHAF1-pBluscriptoptiHAF11利用選定的酶切位點(diǎn)以一定的順序相連而構(gòu)建出optiHA基因。
圖4為基因optiHA的PCR鑒定圖片，其中泳道1為DNA MarkerDL2000；泳道2為PCR鑒定時(shí)的H2O對(duì)照，泳道3為基因optiHA的1.8kb大小的PCR產(chǎn)物。
圖5為基因optiHA的酶切鑒定圖片，其中泳道1為DNA 1KbMarker(CD002，北京駝峰星生物技術(shù)工程有限公司)；泳道2為含有基因optiHA的質(zhì)粒pCIoptiHAFull用PvuII酶切時(shí)得到的1.0Kb和4.8kb的兩條帶；泳道3為質(zhì)粒pCIoptiHAFull用XhoI酶切時(shí)得到的1.6kb和4.2kb的條帶；泳道4為質(zhì)粒pCIoptiHAFull用NotI酶切時(shí)得到的1.2kb和4.6kb的條帶；泳道5為質(zhì)粒pCIoptiHAFull用EcoRI酶切時(shí)得到的線性化的5.8kb的片段；泳道6為質(zhì)粒pCIoptiHAFull用BamHI酶切時(shí)得到的300bp和5.5kb的條帶；泳道7為DNA Marker DL15000。
圖6為質(zhì)粒pCIoptiHA的酶切分析圖譜，其中泳道1為DNA 1KbMarker(CD002，北京駝峰星生物技術(shù)工程有限公司)；泳道2為pCIoptiHA用EcoRI酶切時(shí)得到的線性化的5.8kb的片段；泳道3為pCIoptiHA用PstI酶切時(shí)得到的1.2Kb、530bp、300bp和3.87kb的條帶、泳道4為pCIoptiHA用BglII酶切得到的1.1kb和4.7kb的條帶。
圖7為表達(dá)A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因的質(zhì)粒pCIHA(作為對(duì)照)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24h在熒光顯微鏡(200×)下觀察到的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞主要在其細(xì)胞膜呈現(xiàn)為亮綠色，圖中箭頭所示的細(xì)胞為表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞。
圖8為表達(dá)optiHA基因的質(zhì)粒pCIoptiHA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24h在熒光顯微鏡(200×)下觀察到的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞主要在其細(xì)胞膜呈現(xiàn)為亮綠色，圖中箭頭所示的細(xì)胞為表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞。
圖9為表達(dá)A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因的質(zhì)粒pCIHA(作為對(duì)照)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后48h在熒光顯微鏡(200×)下觀察到的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞主要在其細(xì)胞膜呈現(xiàn)為亮綠色，圖中箭頭所示的細(xì)胞為表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞。
圖10為表達(dá)optiHA基因的質(zhì)粒pCIoptiHA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后48h在熒光顯微鏡(200×)下觀察到的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞主要在其細(xì)胞膜呈現(xiàn)為亮綠色，圖中箭頭所示的細(xì)胞為表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞。
圖11為293T細(xì)胞對(duì)照在熒光顯微鏡(200×)下觀察到的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，所有細(xì)胞均沒(méi)有表達(dá)HA蛋白，細(xì)胞在熒光顯微鏡下不呈現(xiàn)亮綠色。
圖12為pCIoptiHA和pCIHA的SDS-PAGE圖片，其中泳道1為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCIHA的293T細(xì)胞；泳道2為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCIoptiHA的293T細(xì)胞；泳道3為H5亞型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]；泳道4為293T細(xì)胞對(duì)照；泳道5為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖13為pCIoptiHA和pCIHA的Western blot分析結(jié)果圖片，其中泳道1為293T細(xì)胞對(duì)照；泳道2為H5亞型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的大小為74KDa的HA蛋白；泳道3為質(zhì)粒pCIoptiHA在293T細(xì)胞中表達(dá)的大小為74KDa的HA蛋白；泳道4為質(zhì)粒pCIHA在293T細(xì)胞中表達(dá)的大小為74KDa的HA蛋白。
具體實(shí)施例方式
下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。
本發(fā)明實(shí)施例中所用原料及試驗(yàn)試劑的來(lái)源(1)H5亞型高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[簡(jiǎn)寫(xiě)為GD/1/96(H5N1)]購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。
(2)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因核苷酸序列來(lái)自Genebank(Genebank登錄號(hào)AF144305)，其氨基酸序列由核苷酸序列推導(dǎo)而來(lái)。
(3)293T細(xì)胞為人胚胎腎細(xì)胞(CRL-11268)，來(lái)自ATCC。
(4)受體菌E.coli JM109(D9025)為寶生物技術(shù)工程(大連)有限公司產(chǎn)品。
(5)質(zhì)粒pBluscript(212207)為Stratagene公司產(chǎn)品。
(6)表達(dá)載體pCI(E1731，Genebank登錄號(hào)U47119)為Promega公司產(chǎn)品。
(7)PlatinumPfx Taq DNA聚合酶(11708-013)為Ivitrogen公司產(chǎn)品。
(8)T4DNA聚合酶(M0203S)、T4DNA連接酶(M0202S)為New EnglandBliolabs公司產(chǎn)品。
(9)SapI(R0569S)為New England Bliolabs公司產(chǎn)品，BglII(D1021A)、PstI(D1073A)、PvuII(D1076A)、EcoO109I(D1043A)、NotI(D1166A)、SphI(D1180A)、KpnI(D1068A)、XhoI(D1094A)、EcoRI(D1040A)和XbaI(D1093A)等限制性內(nèi)切酶均為寶生物技術(shù)工程(大連)有限公司產(chǎn)品。
(10)膠回收(小量)試劑盒(W5212)、質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒(W5002)為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品。
(11)CEQTMDTCS-QUICK Star Kit(608120)為Beckman公司產(chǎn)品。
(12)PerfectprepPlasmid Mini(0032005.500)為EppendorfAG公司產(chǎn)品。
(13)LipofectamineTM2000(11668-027)為Invitrogen公司產(chǎn)品。
(14)DMEM干粉(12100-046)為GIBCO公司產(chǎn)品，用無(wú)離子水配制成pH7.2的1×DMEM(配制1000ml培養(yǎng)液需加入3.7g的NaHCO3和2.4g的HEPES)溶液4℃保存，臨用時(shí)加入終濃度為10％的胎牛血清(26149-095，Gibco)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。
(15)OPTi-MEMI(51985-034)為不含血清的用于轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)液，為Invitrogen公司產(chǎn)品。
(16)H5亞型禽流感多克隆陽(yáng)性血清(批號(hào)040524)為哈爾濱獸醫(yī)研究所產(chǎn)品。
(17)蛋白電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)(SM0431)為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。
(18)熒光標(biāo)記的二抗兔抗雞IgG(F8888，F(xiàn)ITC-IgG)為Sigma公司產(chǎn)品。
(19)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗兔抗雞IgG(A9046，HRPO-IgG)為Sigma公司產(chǎn)品。
(20)DAB顯色試劑盒(AR1022)為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。
(21)9～11日齡雞胚購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所試驗(yàn)動(dòng)物中心。
(22)無(wú)特定病原菌(Specific-pathogen-free，SPF)的白色來(lái)杭雞購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所試驗(yàn)動(dòng)物中心。
(23)其它化學(xué)試劑均為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品。
實(shí)施例1.H5亞型HA基因雞體偏嗜性密碼子的改寫(xiě)與序列分析利用密碼子使用頻率表(見(jiàn)附表1，國(guó)家科學(xué)數(shù)字圖書(shū)館，生命科學(xué)學(xué)科信息門(mén)戶，密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)，網(wǎng)址為http//www.kazusa.or.jp/codon/)，將H5亞型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA基因的密碼子全部變換為雞體偏嗜性密碼子，并書(shū)寫(xiě)出密碼子優(yōu)化后的HA基因(命名為optiHA)的序列，長(zhǎng)1779bp(SEQ ID NO1，參見(jiàn)圖1)，并對(duì)optiHA基因序列用DNASTAR軟件(DNASTAR.Inc.)進(jìn)行序列和酶切位點(diǎn)分析，根據(jù)optiHA基因上可以選擇利用的單酶切位點(diǎn)，將optiHA基因分成11個(gè)長(zhǎng)約200bp的片段，11個(gè)片段依次命名為optiHAF1(片段長(zhǎng)88bp，在基因optiHA上的位置為1-88)、optiHAF2(片段長(zhǎng)162bp，在基因optiHA上的位置為81-243)、optiHAF3(片段長(zhǎng)204bp，在基因optiHA上的位置為237-441)、optiHAF4(片段長(zhǎng)162bp，在基因optiHA上的位置為436-597)、optiHAF5(片段長(zhǎng)164bp，在基因optiHA上的位置為587-751)、optiHAF6(片段長(zhǎng)201bp，在基因optiHA上的位置為744-944)、optiHAF7(片段長(zhǎng)201bp，在基因optiHA上的位置為939-1139)、optiHAF8(片段長(zhǎng)155bp，在基因optiHA上的位置為1134-1288)、optiHAF9(片段長(zhǎng)157bp，在基因optiHA上的位置為1285-1441)、optiHAF10(片段長(zhǎng)168bp，在基因optiHA上的位置為1436-1603)、optiHAF11(片段長(zhǎng)182bp，在基因optiHA上的位置為1598-1779)。這11個(gè)片段在選定的單酶切位點(diǎn)相互重疊并各自包含選定的單酶切位點(diǎn)，即片段optiHAF1的3‘端和片段optiHAF2的5’端相互重疊含有BglII位點(diǎn)；片段optiHAF2的3‘端和片段optiHAF3的5’端相互重疊含有PstI位點(diǎn)；片段optiHAF3的3‘端和片段optiHAF4的5’端相互重疊含有PvuII位點(diǎn)片段optiHAF4的3‘端和片段optiHAF5的5’端相互重疊含有EcoO109I位點(diǎn)；片段optiHAF5的3‘端和片段optiHAF6的5’端相互重疊含有NotI位點(diǎn)；片段optiHAF6的3‘端和片段optiHAF7的5’端相互重疊含有SphI位點(diǎn)；片段optiHAF7的3‘端和片段optiHAF8的5’端相互重疊含有KpnI位點(diǎn)；片段optiHAF8的3‘端和片段optiHAF9的5’端由于沒(méi)有可以選擇的的單酶切位點(diǎn)而分別在片段optiHAF8的3‘端和片段optiHAF9的5’端另外加入了SapI位點(diǎn)識(shí)別序列(該加入的酶切位點(diǎn)不包含在圖1的序列中)；片段optiHAF9的3‘端和片段optiHAF10的5’端相互重疊含有PvuII位點(diǎn)；片段optiHAF10的3‘端和片段optiHAF11的5’端相互重疊含有XhoI。11個(gè)片段中，片段optiHAF1設(shè)計(jì)直接由一段正向(5’-3’)的寡核苷酸片段利用OE-PCR法擴(kuò)增合成，片段optiHAF2-optiHAF11分別由兩個(gè)正反兩向、互相重疊約20bp、長(zhǎng)約100bp的寡核苷酸片段利用OE-PCR法擴(kuò)增合成。
附表1 雞和流感病毒最偏嗜的密碼子氨基酸雞 流感病毒精氨酸Arg(R) CGC AGA亮氨酸Leu(L) CUG CUG絲氨酸Ser(S) AGC UCA蘇氨酸Thr(T) ACC ACA脯氨酸Pro(P) CCC CCA丙氨酸Ala(A) GCC GCA甘氨酸Gly(G) GGC GGA纈氨酸Val(V) GUG GUG賴氨酸Lys(K) AAG AAA谷氨酰胺Gln(Q)CAG CAA天冬酰胺Asn(N)AAC AAU組氨酸His(H) CAC CAU谷氨酸Glu(E) GAG GAA
天冬氨酸Asp(D)GAC GAU酪氨酸Tyr(Y) UAC UAU半胱氨酸Cys(C)UGC UGC苯丙氨酸Phe(F)UUC UUC異亮氨酸Ile(I)AUC AUA甲硫氨酸Met(M)AUG AUG色氨酸Trp(W) UGG UGG實(shí)施例2.用于OE-PCR的寡核苷酸片段和引物的合成片段optiHAF1的寡核苷酸片段optiHAF1-Forward(101)直接送由Sigma公司合成；片段optiHAF2的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF2-Forward(90)和optiHAF2-Reverse(101)；片段optiHAF3的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF3-Forward(110)和optiHAF3-Reverse(110)；片段optiHAF4的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF4-Forward(99)和optiHAF4-Reverse(100)；片段optiHAF5的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF5-Forward(97)和optiHAF5-Reverse(99)；片段optiHAF6的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF6-Forward(110)和optiHAF6-Reverse(110)；片段optiHAF7的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF7-Forward(110)和optiHAF7-Reverse(110)；片段optiHAF8的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF8-Forward(91)和optiHAF8-Reverse(103)；片段optiHAF9的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF9-Forward(97)和optiHAF9-Reverse(99)；片段optiHAF10的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF10-Forward(99)和optiHAF10-Reverse(101)；片段optiHAF11的兩個(gè)寡核苷酸片段為optiHAF11-Forward(107)和optiHAF11-Reverse(101)。這些寡核苷酸片段均送由Sigma公司合成(見(jiàn)附表2)。
附表2 合成的寡核苷酸片段片段編號(hào)寡核苷酸片段序列optiHAF1- AGCGAAAGCAGGGGTCCAATCTGTCAAAATGGAGAForward(101)AGATCGTGCTGCTGCTGGCCATCGTGAGCCTGGTGA
AGAGCGACCAGATCTGCAT CGGCTACCACG(SEQID NO3)CCAGATCTGCATCGGCTACCACGCCAACAACAGCACoptiHAF2-CGAGCAGGTGGACACCATCATGGAGAAGAACGTGACForward(90)CGTGACCCACGCCCAGGA (SEQ ID NO4)GCCACGCTGCAGTCGCGCAGGATCAGGGGCTTCACGoptiHAF2- CCGTTCAGGTCGCACAGCTTGCCGTTGTGGGTCTTCTReverse(101) CCAGGATGTCCTGGGCGTGGGTCACGGT (SEQ IDNO5)TGCAGCGTGGCCGGCTGGCTGCTGGGCAACCCCATGoptiHAF3- TGCGACGAGTTCATCAACGTGCCCGAGTGGAGCTACForward(110) ATCGTGGAGAAGGCCAGCCCCGCCAACGACCTGTGCTA (SEQ ID NO6)CTGCTCTTGGGGATGATCTGGATCTTCTCGAAGTGGToptiHAF3- TGGTGCGGCTCAGCAGGTGCTTCAGCTCCTCGTAGTCReverse(110) GTTGAAGTCGCCGGGGTAGCACAGGTCGTTGGCGGG(SEQ ID NO7)CAAGAGCAGCTGGAGCAACCACGACGCCAGCAGCoptiHAF4- GGCGTGAGCAGCGCCTGCCCCTACCACGGCCGCAGCForward(99) AGCTTCTTCCGCAACGTGGTGTGGCTGA (SEQ IDNO8)TGCCCCACAGCACCAGCAGGTCCTCCTGGTTGGTGToptiHAF4- TGTTGTAGCTGCGCTTGATGGTGGGGTAGGCGCTGTTReverse(100) CTTCTTGATCAGCCACACCACGTTGCG (SEQ IDNO9)AGGAGGACCTGCTGGTGCTGTGGGGCATCCACCACCoptiHAF5-CCAACGACGCCGCCGAGCAGACCAAGCTGTACCAGAForward(97)ACCCCACCACCTACATCAGCGTGGG (SEQ ID NO10)optiHAF5- CTCCATGCGGCCGCTCTGCCCGTTCACCTTGGGGCGGReverse(99) GTGGCGATCTCGGGCACCAGGCGCTGGTTCAGGGTG
CTGGTGCCCACGCTGATGTAGGTGGT(SEQ ID NO11)GCGGCCGCATGGAGTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCoptiHAF6- CCAACGACGCCATCAACTTCGAGAGCAACGGCAACTForward(110) TCATCGCCCCCGAGTACGCCTACAAGATCGTGAAGAAG (SEQ ID NO12)CATGCTGCTGTTGATGGCGCCCATGGGGGTCTGGCACoptiHAF6- TTGGTGTTGCAGTTGCCGTACTCCAGCTCGCTCTTCAReverse(110) TGATGGCGCTGTCGCCCTTCTTCACGATCTTGTAGG(SEQ ID NO13)GCATGCCCTTCCACAACATCCACCCCCTGACCATCGGoptiHAF7- CGAGTGCCCCAAGTACGTGAAGAGCAACCGCCTGGTForward(110) GCTGGCCACCGGCCTGCGCAACACCCCCCAGCGCGAG (SEQ ID NO14)GTACCCGTACCAGCCGTCCACCATGCCCTGCCAGCCGoptiHAF7- CCCTCGATGAAGCCGGCGATGGCGCCGAACAGGCCGReverse(110) CGCTTCTTGCGGCGGCGCTCGCGCTGGGGGGTGTTGC (SEQ ID NO15)GGTACGGGTACCACCACAGCAACGAGCAGGGCAGCoptiHAF8-GGCTACGCCGCCGACAAGGAGAGCACCCAGAAGGCForward(91)CATCGACGGCGTGACCAACAA (SEQ ID NO16)GCGGCGGCTCTTCCTCCAGGTTGTTGAACTCGCGGCoptiHAF8- CCACGGCCTCGAACTGGGTGTTCATCTTGTCGATGATReverse(103) GCTGTTCACCTTGTTGGTCACGCCGTCGAT (SEQ IDNO17)CAACCTGCTCTTCGGAGCGCCGCATCGAGAACCTGAoptiHAF9-ACAAGCAGATGGAGGACGGCTTCCTGGACGTGTGGAForward(97)CCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGCT(SEQ ID NO18)GCGCAGCTGCAGGCGCACCTTGTCGTACAGGTTCTToptiHAF9-CACGTTGCTGTCGTGGAAGTCCAGGGTGCGCTCGTTReverse(99)CTCCATCAGCACCAGCAGCTCGGCGTT(SEQ
ID NO19)GTGCGCCTGCAGCTGCGCGACAACGCCAAGGAGCTGoptiHAF10- GGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACForward(99)AACGAGTGCATGGAGAGCGTGAAGAAC (SEQ IDNO20)TGCTCTCGAGCTTCACGCCGCTGATCTCCTCGCGGTToptiHAF10- CAGGCGGGCCTCCTCGCTGTACTGGGGGTAGTCGTAReverse(101) GGTGCCGTTCTTCACGCTCTCCATGC (SEQ IDNO21)GTGAAGCTCGAGAGCATGGGCACCTACCAGATCCTGoptiHAF11- AGCATCTACAGCACCGTGGCCAGCAGCCTGGCCCTGForward(107) GCCATCATGGTGGCCGGCCTGAGCCTGTGGATGTG(SEQ ID NO22)AGTAGACACAAGGGTGTTTTTAACTACAATCTGAACToptiHAF11- CACAAATTTAGATGCAGATGCGGCACTGCAGGCTGCReverse(101) CGTTGCTGCACATCCACAGGCTCAGGCC(SEQ IDNO23)另外，分別根據(jù)片段optiHAF2-optiHAF11的2個(gè)寡核苷酸片段序列，同時(shí)參照片段optiHAF2-optiHAF11的序列，用Oligo 6.0軟件(Wojciech&Piotr Rychlik Copyright，Version 6.67)設(shè)計(jì)用于OE-PCR擴(kuò)增的上下游引物，片段optiHAF2的兩個(gè)引物為optiHAF2-Forward-5’和optiHAF2-Reverse-5’；片段optiHAF3的兩個(gè)引物為optiHAF3-Forward-5’和optiHAF3-Reverse-5’；片段optiHAF4的兩個(gè)引物為optiHAF4-Forward-5’和optiHAF4-Reverse-5’；片段optiHAF5的兩個(gè)引物為optiHAF5-Forward-5’和optiHAF5-Reverse-5’；片段optiHAF6的兩個(gè)引物為optiHAF6-Forward-5’和optiHAF6-Reverse-5’；片段optiHAF7的兩個(gè)引物為optiHAF7-Forward-5’和optiHAF7-Reverse-5’；片段optiHAF8的兩個(gè)引物為optiHAF8-Forward-5’和optiHAF8-Reverse-5’；片段optiHAF9的兩個(gè)引物為optiHAF9-Forward-5’和optiHAF9-Reverse-5’；片段optiHAF10的兩個(gè)引物為optiHAF10-Forward-5’和optiHAF10-Reverse-5’；片段optiHAF11的兩個(gè)引物為optiHAF11-Forward-5’和optiHAF11-Reverse-5’。對(duì)optiHAF1-Forward(101)片段只設(shè)計(jì)其上游引物optiHAF1-Forward-5’，所有引物均送由Sigma公司直接合成(見(jiàn)附表3)。
附表3 用于OE-PCR的引物


實(shí)施例3.optiHA基因11個(gè)片段optiHAF1-optiHAF11的OE-PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序鑒定11個(gè)片段optiHAF1-optiHAF11分別用PlatihumPfx Taq DNA聚合酶擴(kuò)增。首先在PCR管中依次加入10X Pfx Taq聚合酶緩沖液10ul、2.5mmoldNTPs 4ul、Pfx Taq DNA聚合酶1ul(1-2U)以及對(duì)應(yīng)的正反向寡核苷酸片段(對(duì)于optiHAF1只加入正向寡核苷酸片段)各10ul，滅菌去離子水補(bǔ)足100ul后，95℃5min，48℃～55℃退火1min，72℃5min，5個(gè)循環(huán)后再加入20pmol對(duì)應(yīng)于各個(gè)寡核苷酸片段的上、下游引物(附表3)各1ul在PTC-100基因擴(kuò)增儀(M.J.Research.inc)上擴(kuò)增(對(duì)于optiHAF1只加入上游引物)。OE-PCR的反應(yīng)條件是48℃1min、72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5min延伸，取5ul PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，片段optiHAF1-optiHAF11的大小依次分別為88bp、162bp、204bp、162bp、164bp、201bp、201bp、155bp、157bp、168bp和182bp(見(jiàn)圖2)。
將11個(gè)片段的PCR產(chǎn)物按照膠回收(小量)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟回收，之后分別克隆于pBluscript載體的SmaI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化受體菌E.coliJM109后分別隨機(jī)選取4個(gè)克隆，按照質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，溶于50μL的滅菌去離子水中，用CEQTMDTCS-QUICK Star Kit進(jìn)行質(zhì)粒DNA模板的測(cè)序前處理，具體步驟如下分別將1μL的11個(gè)片段的克隆質(zhì)粒和6μL滅菌去離子水混合，96℃加熱1-3分鐘，自然涼到室溫后加入T3引物(T3ATTAACCCTCACTAAAGGGAA，SEQ ID NO45)1μl(5pmol/μl)和DTCS Quick Start Master Mix 2μl，混勻后進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?6℃20sec、50℃20sec、60℃4min，35個(gè)循環(huán)，最后保持在4℃。PCR反應(yīng)完后加入2.5ul的反應(yīng)終止液(3M PH5.2的NaOAC 2ul，100mM PH8.0的EDTA 2ul，20mg/ml的Glycogen 1ul，即用即配)終止反應(yīng)，然后加入30ul 95％冰乙醇沉淀DNA，混勻，4℃、12000rpm立即離心20min。小心倒掉上清后，用100～200ul 70％冰乙醇兩次洗脫殘留的鹽，4℃、12000rpm離心5min。真空抽干或室溫晾干DNA后，用30ul甲酰胺充分溶解DNA沉淀，小心加入CEQ樣品板孔內(nèi)，最后加一滴石蠟油到樣品板孔內(nèi)。隨即采用雙脫氧鏈終止法在BechmanCEQ8000測(cè)序儀(Bechman，America)上對(duì)克隆重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，之后利用DNASTAR軟件(DNASTAR.Inc.)將得到的序列進(jìn)行分析，結(jié)果所挑取的每個(gè)片段的4個(gè)克隆中，分別有1-2個(gè)為陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆依次命名為pBluscript-optiHAF1至pBluscript-optiHAF11。
實(shí)施例4.基因optiHA的連接構(gòu)建策略將實(shí)施例3中測(cè)序驗(yàn)證好的11個(gè)片段的陽(yáng)性質(zhì)粒pBluscript-optiHAF1至pBluscript-optiHAF11根據(jù)實(shí)施例1中所選定的單酶切位點(diǎn)按以下方法和順序，使用常規(guī)技術(shù)依次酶切連接(1)將pBluscript-optiHAF1用XbaI酶切后用klenow酶補(bǔ)平、BglII酶切后回收大小為2700bp的片段，將pBluscript-optiHAF2用BglII和EcoRV雙酶切后回收大小為160bp的片段，然后將所回收的兩個(gè)片段相連接成含有optiHAF1與optiHAF2的質(zhì)粒pBluscript-optiHAF1-2，將pBluscript-optiHAF1-2與pBluscript-optiHAF3分別用PstI和HindIII酶切后連接成pBluscript-optiHAF1-2-3，再將用SacI酶切、T4 DNA聚合酶補(bǔ)平和EcoRI處理后的pBluscript-optiHAF1-2-3與用KpnI酶切、klenow酶補(bǔ)平和EcoRI處理后的載體pCI相連接而得到pCI-optiHAF1-2-3；(2)將pBluscript-optiHAF5與pBluscript-optiHAF6分別用NotI和HindIII酶切后連接成pBluscript-optiHAF5-6，將pBluscript-optiHAF5-6與pBluscript-optiHAF7分別用SphI和BamHI酶切后連接成pBluscript-optiHAF5-6-7，再將pBluscript-optiHAF5-6-7與pBluscript-optiHAF4分別用EcoO109I和BamHI酶切后連接成pBluscript-optiHAF4-5-6-7；(3)先將pBluscript-optiHAF9和載體pCI分別用XbaI和EcoRI處理后連接成pCIoptiHAF9，將pCI-optiHAF9與pBluscript-optiHAF8分別用SapI和EcoRI酶切后連接成pCIoptiHAF8-9，將pBluscript-optiHAF10與pBluscript-optiHAF11分別用BamHI和EcoRI酶切后連接成pBluscript-optiHAF10-11，再將pCI-optiHAF8-9與pBluscript-optiHAF10-11分別用PstI和XbaI酶切后連接成pCI-optiHAF8-9-10-11；(4)將pCI-optiHAF1-2-3與pBluscript-optiHAF4-5-6-7分別用PvuII和XbaI酶切后連接成pCI-optiHAF1-2-3-4-5-6-7，再將pCI-optiHAF8-9-10-11與pCI-optiHAF1-2-3-4-5-6-7分別用KpnI和XbaI酶切后連接成含有全長(zhǎng)的optiHA基因的質(zhì)粒pCI-optiHAFull(連接策略見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例5.基因optiHA的PCR鑒定及酶切分析含有optiHA基因的質(zhì)粒pCIoptiHAFull用pCI上的上游引物pCI-up5’-ACTTAATACGACTCACTATA-3’(SEQ ID NO46)；基因的下游引物5‘-CCACTCTAGAGTGTTTTTAACTACAA-3’(SEQ ID NO47)進(jìn)行PCR鑒定，PCR條件為94℃ 5min、94℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10min延伸，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1％)電泳，結(jié)果得到了長(zhǎng)約1.7kb的條帶，與A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA基因的片段大小一致(見(jiàn)圖4)。按照限制性內(nèi)切酶的說(shuō)明書(shū)，將質(zhì)粒pCIoptiHAFull進(jìn)行酶切處理，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1％)電泳，結(jié)果，用PvuII酶切時(shí)得到了1.0Kb和4.8kb的兩條帶、用XhoI酶切得到了1.6kb和4.2kb的條帶、用NotI酶切得到了1.2kb和4.6kb的條帶、用EcoRI酶切時(shí)得到了線性化的5.8kb的片段、用BamHI酶切時(shí)得到了300bp和5.5kb的條帶，所得結(jié)果均與對(duì)所書(shū)寫(xiě)的optiHA基因序列(SEQ ID NO1)的分析結(jié)果一致(見(jiàn)圖5)。
實(shí)施例6.基因optiHA的測(cè)序驗(yàn)證將含有optiHA基因的質(zhì)粒pCIoptiHAFull按照質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取，用CEQTMDTCS-QUICK Star Kit進(jìn)行質(zhì)粒DNA模板的測(cè)序前處理，具體步驟如下在5個(gè)PCR管中分別將1ul的質(zhì)粒pCIoptiHAFullDNA模板和6ul滅菌去離子水混合，96℃加熱1-3分鐘，自然涼到室溫后依次分別加入pCI-up5’-ACTTAATACGACTCACTATA-3’(SEQ IDNO48)；opt-w1p5’-GCACCAACCACTTCGAGA-3’(SEQ ID NO49)；opt-w1f5‘-GCTACCACGCCAACAACAGC-3’(SEQ ID NO50)；opt-w2p5‘-GAAGAGCGAGCTGGAGTAC-3’(SEQ ID NO51)；opt-w3p5‘-GCAGATGGAGGACGGCTTCCT-3’(SEQ ID NO52)；pCI-lower5‘-TGCAGCTTATAATGGTTACA-3’(SEQ ID NO53)1μl(5pmol/μl)和DTCS Quick Start Master Mix 2μl，混勻后進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?6℃20sec、50℃20sec、60℃4min，35個(gè)循環(huán)，最后保持在4℃。PCR反應(yīng)完后加入2.5ul的反應(yīng)終止液(3M PH5.2的NaOAC 2ul，100mM PH8.0的EDTA 2ul，20mg/ml的Glycogen 1ul，即用即配)終止反應(yīng)，然后加入30ul 95％冰乙醇沉淀DNA，混勻，4℃、12000rpm立即離心20min。小心倒掉上清后，用100～200ul 70％冰乙醇兩次洗脫殘留的鹽，4℃、12000rpm離心5min。真空抽干或室溫晾干DNA后，用30ul甲酰胺充分溶解DNA沉淀，每個(gè)PCR管中的樣品分別小心加入到CEQ樣品板孔內(nèi)，最后加一滴石蠟油到樣品板孔內(nèi)。雙脫氧鏈終止法在BechmanCEQ8000測(cè)序儀上對(duì)優(yōu)化的基因optiHA進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)測(cè)序，所構(gòu)建的optiHA基因與所書(shū)寫(xiě)的optiHA基因序列(SEQ ID NO1)完全一致，基因總長(zhǎng)為1779bp，閱讀框架含核苷酸1707bp，共編碼568個(gè)氨基酸(SEQ ID NO2)。
實(shí)施例7.基因optiHA表達(dá)質(zhì)粒pCIoptiHA的構(gòu)建用特異性引物(上游5‘-TCAAAATGGAGAAGATCGTGCT-3’(SEQID NO54)，下游5‘-CCACTCTAGAGTGTTTTTAACTACAA-3’(SEQ IDNO55))從質(zhì)粒pCIoptiHAFull中用Pfx Taq DNA聚合酶擴(kuò)增僅含開(kāi)放閱讀框架(ORF)的optiHA基因。在PCR管中依次加入10X Pfx Taq聚合酶緩沖液10ul、2.5mmol dNTP s4ul、Pfx Taq DNA聚合酶1ul(1-2U)、質(zhì)粒pCIoptiHAF1ul以及對(duì)應(yīng)的上下游引物1ul，滅菌去離子水補(bǔ)足100ul，擴(kuò)增條件為94℃5min、94℃ 1min、58℃1min、72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min延伸，將PCR產(chǎn)物用XbaI徹底酶切后定向克隆到用KpnI酶切后用klenow酶補(bǔ)平、再用XbaI酶切處理的質(zhì)粒載體pCI中，得到質(zhì)粒pCIoptiHA，將構(gòu)建好的質(zhì)粒pCIoptiHA進(jìn)行酶切鑒定，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1％)電泳，結(jié)果，質(zhì)粒pCIoptiHA用EcoRI酶切時(shí)得到了線性化的5.8kb的片段，用PstI酶切時(shí)得到了1.2Kb、530bp、300bp和3.87kb的條帶、用BglII酶切得到了1.1kb和4.7kb的條帶，所得結(jié)果均與對(duì)所構(gòu)建的optiHA基因序列(SEQ ID NO1)的分析結(jié)果一致(見(jiàn)圖6)。
實(shí)施例8.基因optiHA在293T細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒pCIoptiHA和pCIHA(作為對(duì)照，將含有禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA基因的克隆質(zhì)粒pBH5(陳化蘭，于康震，步志高。一株鵝源高致病力禽流感病毒分離株血凝素基因的分析。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，32(2)87-92.))經(jīng)EcoRI酶切、klenow酶補(bǔ)平及SalI酶切后切下HA基因片段，插入SalI和SmaI酶切的CMV啟動(dòng)子表達(dá)載體pCI而構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒pCIHA)按照PerfectprepPlasmid Mini操作步驟進(jìn)行提取。293T細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞)先以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，連續(xù)傳代5代以上后傳于六孔板中，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待293T細(xì)胞長(zhǎng)至60％～80％鋪滿時(shí)，按LipofectamineTM2000試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后通過(guò)間接免疫熒光和Western blot檢測(cè)其表達(dá)的HA蛋白。
8.1 間接免疫熒光檢測(cè)質(zhì)粒pCIoptiHA(pCIHA作為對(duì)照)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24h、48h時(shí)，進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞陰性對(duì)照。用70％乙醇固定20min-30min后，自然干燥。用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗滌后，取H5亞型禽流感多克隆陽(yáng)性血清用PBS(0.01mol/L，pH7.4)20倍稀釋，滴加在6孔板中央選定的區(qū)域內(nèi)，37℃作用45min。用PBS洗滌三次，每次5min，洗后用去離子水再?zèng)_一次，自然干燥。取FIFC標(biāo)記的兔抗雞IgG(FITC-IgG)用含伊文斯藍(lán)(1/104)的PBS(0.01mol/L，pH7.4)100倍稀釋，滴加在6孔板中央選定的區(qū)域內(nèi)，37℃作用45min。之后用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗滌三次，用去離子水脫鹽后，自然干燥。滴加堿性甘油(pH9.8)，于熒光顯微鏡(Leica DMIRE2)下觀察。結(jié)果，質(zhì)粒pCIoptiHA和pCIHA在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)間接免疫熒光染色，表達(dá)的HA蛋白產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞膜上，并在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出亮綠色的特殊熒光(如圖7、8、9和10中箭頭所示)。2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24h均即可表達(dá)H5亞型HA蛋白(見(jiàn)圖7和圖8)，在轉(zhuǎn)染后48h，能表達(dá)HA蛋白的細(xì)胞數(shù)明顯比24h的多(見(jiàn)圖9，圖10)。在轉(zhuǎn)染后24h和48h，優(yōu)化的基因optiHA的表達(dá)水平均明顯高于野生型HA基因的表達(dá)水平(見(jiàn)圖8，圖10)。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞對(duì)照(見(jiàn)圖11)未見(jiàn)有特異的熒光表達(dá)產(chǎn)物。
8.2 Western blot檢測(cè)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞及H5亞型禽流感病毒GD/1/96(H5N1)裂解后制備的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上用H5亞型禽流感多克隆陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blot檢測(cè)2種質(zhì)粒所表達(dá)的AIV HA蛋白。
8.2.1 SDS-PAGE電泳樣品制備在質(zhì)粒pCIoptiHA(pCIHA作為對(duì)照)轉(zhuǎn)染48h后收獲293T細(xì)胞，用PBS(pH7.4)洗三遍，加入與細(xì)胞收集液等倍體積的預(yù)熱的2×SDS電泳緩沖液裂解細(xì)胞，收集到1.5ml微量離心管中，置于沸水中煮10min使蛋白樣品充分變性即可。H5亞型禽流感病毒GD/1/96(H5N1)作為陽(yáng)性對(duì)照，在SPF雞胚中繁殖后收集尿囊液，其SDS-PAGE電泳樣品的制備過(guò)程同上。
凝膠灌制及電泳分別配制10％分離膠，5％的濃縮膠，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)(美J.薩姆布魯克等編著，金冬雁等譯，2002，科學(xué)出版社)所述進(jìn)行灌制，同時(shí)灌制兩塊凝膠。待其聚合后，用微量移液器分別加入10ul質(zhì)粒pCIoptiHA轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞、質(zhì)粒pCIHA轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞、H5亞型禽流感病毒GD/1/96(H5N1)裂解后制備的樣品及293T細(xì)胞，同時(shí)加蛋白電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)(SM0431，晶美生物工程有限公司)作對(duì)照，在BIO-RAD垂直電泳槽上先80V電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為120V，待染料移至凝膠底部時(shí)停止電泳。將其中一凝膠置于0.25％考馬斯亮藍(lán)染色液中(0.25％R250，40％甲醇，10％乙醇)2小時(shí)，用脫色液(40％甲醇，10％乙酸)脫色，結(jié)果轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞的條帶與293T細(xì)胞對(duì)照的條帶一致，而流感病毒對(duì)照的不同的蛋白條帶清晰可見(jiàn)(見(jiàn)圖12)。另一凝膠置于轉(zhuǎn)印裝置，用于Western-blot檢測(cè)。
8.2.2 Western blot檢測(cè)電轉(zhuǎn)移將6張Whatman濾紙和NC膜剪成與凝膠同樣大小，在轉(zhuǎn)移緩沖液(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS)中浸泡5min，按3張濾紙、NC膜、凝膠、3張濾紙的順序依次將起疊放在一起，放置每一層均要除去它們之間的氣泡，按NC膜側(cè)靠陽(yáng)極、凝膠側(cè)靠陰極將其放入轉(zhuǎn)印槽中，在TRANS-BLOT SD(Semi-dry Transfer Cell BIO-RAD)轉(zhuǎn)印裝置22V電轉(zhuǎn)移45min，取出NC膜，作好標(biāo)記，夾于濾紙之間室溫干燥30min。然后22V電轉(zhuǎn)45min(纖維素膜側(cè)靠正極，膠側(cè)靠負(fù)極)。轉(zhuǎn)印完畢，取出NC膜用鉛筆在膜上作好標(biāo)記。夾于兩層濾紙之間，室溫干燥30min。
免疫檢測(cè)將NC膜放在一平皿中，加封閉液(0.02％疊氮鈉，1％(w/v)BSA溶于PBS)，浸過(guò)膜即可，室溫下輕振2-3h。然后用PBS洗3次，加H5亞型禽流感多克隆陽(yáng)性血清作為一抗(用PBS 1∶100稀釋)4℃作用4-5h或過(guò)夜，再用PBS洗3次，Buffer I(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris.ClpH7.5)洗10min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgG(HRPO-IgG)(用含1％BSA的Buffer I作1∶1000稀釋)37℃作用2h。用Buffer I洗3次，Buffer II(10mmol/L Tris.Cl pH7.5，150mmol/L NaCl)洗一次，吸凈余液，用DAB顯色試劑盒(包括DAB×20倍濃縮液、H2O2×20倍濃縮液、TBS×20倍濃縮緩沖液)顯色3分鐘。顯色完畢，加0.5mM EDTA(pH8.0)終止顯色。
結(jié)果2種質(zhì)粒均可檢測(cè)出分子量約為74Kda的蛋白，優(yōu)化的基因optiHA比野生型HA基因的表達(dá)水平更高(見(jiàn)圖13)。
實(shí)施例9.表達(dá)optiHA的質(zhì)粒pCIoptiHA對(duì)SPF雞的免疫保護(hù)試驗(yàn)9.1 免疫保護(hù)試驗(yàn)將3周齡SPF雞隨機(jī)分為5組，4或5只/組。第1組用pCIHA 100μg免疫，經(jīng)腿部分兩點(diǎn)肌肉注射200μl 0.5μg/μl的pCIHA。第2組為pCIHA10μg免疫組，經(jīng)腿部分兩點(diǎn)肌肉注射200μl 0.05μg/μl的pCIHA；第3組為pCIoptiHA 100μg免疫，免疫方法同第1組，第4組為pCIoptiHA 10μg免疫，免疫方法同第2組。第5組為對(duì)照組，注射200μl PBS溶液。兩種DNA疫苗質(zhì)粒在單次免疫后4周分別用100LD50的HPAIVA/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]經(jīng)鼻腔途徑感染，0.1ml/只，攻毒后2周內(nèi)每天觀察記錄雞只的發(fā)病和死亡情況，并根據(jù)死亡數(shù)統(tǒng)計(jì)死亡率。對(duì)每組雞于免疫后和攻毒后每周采集其翅靜脈血，分離血清，分別采用血凝抑制試驗(yàn)(HI)(高致病性禽流感診斷技術(shù)(GB/T/18936-2003))、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)(高致病性禽流感診斷技術(shù)(GB/T/18936-2003))測(cè)定其相應(yīng)HI抗體和AGP抗體滴度。在攻毒后第三天、第五天和第七天采集每組雞的泄殖腔拭子和喉頭拭子，將每個(gè)拭子用PBS溶液從10-1至10-6稀釋度作10倍連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種3枚9～11日齡雞胚，0.1ml/枚，48h收集尿囊液，微量血凝法(高致病性禽流感診斷技術(shù)(GB/T/18936-2003))檢測(cè)病毒，并根據(jù)其不同稀釋度的血凝結(jié)果用Reed & Muench法(殷震等著，動(dòng)物病毒學(xué)，第二版，1997，科學(xué)出版社，329.)計(jì)算其病毒分離的滴度。
9.2 試驗(yàn)結(jié)果9.2.1 免疫及強(qiáng)毒攻擊后的HI抗體反應(yīng)pCIHA和pCIoptiHA分別以100μg和10μg劑量免疫一次后，免疫雞的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)情況以及抗體水平明顯不同。100μg pCIHA在免疫后3周只有1只雞可檢測(cè)到抗體，100μg pCIoptiHA免疫后2周有2只雞檢測(cè)到抗體，免疫后4周僅有1只雞沒(méi)有抗體，10μg pCIHA免疫后沒(méi)有檢測(cè)到抗體，而10μg pCIoptiHA免疫后2周有2只雞檢測(cè)到抗體；pCIoptiHA以100μg和10μg單次免疫后誘導(dǎo)的HI抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相同劑量pCIHA免疫后的HI抗體水平(見(jiàn)表4)。
表4.pCIHA和pCIoptiHA單次免疫后HI抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)情況及免疫和攻毒后HI抗體(log2)的動(dòng)態(tài)變化


注抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)表示方法為HI抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)雞數(shù)/免疫雞總數(shù)，-表示在攻毒后雞群已全部死亡。*免疫后第四周攻毒。
9.2.2 發(fā)病和死亡情況統(tǒng)計(jì)及AGP抗體檢測(cè)GD/1/96(H5N1)HPAIV攻擊后，所有對(duì)照雞在攻毒后2至7天內(nèi)全部死亡。pCIoptiHA 100μg一次免疫后有1只雞發(fā)病并死亡，其死亡保護(hù)率為75％，pCIHA 100μg單免組在病毒攻擊后11天內(nèi)死亡2只雞；pCIoptiHA10μg的保護(hù)率為75％，pCIHA 10μg單免組在病毒攻擊后的7天之內(nèi)即死亡4只雞，另外1只雞在攻毒后第11天死亡。免疫后血清AGP抗體檢測(cè)均為陰性；在攻毒后2周時(shí)，pCIHA 100μg單免組中有1只雞AGP抗體為陽(yáng)性，其它所有存活雞的AGP抗體檢測(cè)均為陰性(見(jiàn)表5)。
表5.pCIHA和pCIoptiHA免疫雞用HPAIV H5N1攻擊后發(fā)病與死亡情況及AGP抗體檢測(cè)結(jié)果

注*免疫后第四周攻毒；-代表所有實(shí)驗(yàn)雞AGP抗體檢測(cè)為陰性；GD/1/96(H5N1)HPAIV攻擊后AGP抗體表示方法為斜線‘/’的上面和下面分別為AGP抗體陽(yáng)性雞數(shù)和當(dāng)時(shí)存活雞數(shù)；×表示雞在攻毒一周后已全部死亡。
9.2.3 病毒分離滴定結(jié)果將采集的瀉殖腔和喉頭拭子接種雞胚進(jìn)行病毒分離和滴定，結(jié)果，100μg pCIoptiHA和pCIHA單次免疫形成不完全免疫保護(hù)；pCIoptiHA以10μg單次免疫也形成不完全免疫保護(hù)；pCIHA以10μg單次免疫幾乎不能形成免疫保護(hù)，GD/1/96(H5N1)HPAIV攻擊后的3天、5天和7天均可分離到不同滴度的病毒(見(jiàn)表6)。
表6.pCIHA和pCIoptiHA單次免疫雞用H5N1攻擊后病毒分離及滴定結(jié)果

注斜線‘/’的上面和下面分別為病毒分離陽(yáng)性雞數(shù)和當(dāng)時(shí)存活雞數(shù)，拭子原液為陽(yáng)性時(shí)，病毒滴定結(jié)果定義為0.9。
9.3 結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，HA基因密碼子優(yōu)化而得到的optiHA基因可顯著提高H5亞型禽流感DNA疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)水平，提高免疫原性，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。
I040426-序列表SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>編碼H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其應(yīng)用<130>I040426<160>55<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1779<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>CDS<222>(29)..(1732)<223>
<400>1agcgaaagca ggggtccaat ctgtcaaa atg gag aag atc gtg ctg ctg ctg 52Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu1 5gcc atc gtg agc ctg gtg aag agc gac cag atc tgc atc ggc tac cac 100Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His10 15 20gcc aac aac agc acc gag cag gtg gac acc atc atg gag aag aac gtg 148Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val25 30 35 40acc gtg acc cac gcc cag gac atc ctg gag aag acc cac aac ggc aag 196Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys45 50 55ctg tgc gac ctg aac ggc gtg aag ccc ctg atc ctg cgc gac tgc agc 244Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser60 65 70gtg gcc ggc tgg ctg ctg ggc aac ccc atg tgc gac gag ttc atc aac 292Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn75 80 85gtg ccc gag tgg agc tac atc gtg gag aag gcc agc ccc gcc aac gac 340Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Ser Pro Ala Asn Asp90 95 100ctg tgc tac ccc ggc gac ttc aac gac tac gag gag ctg aag cac ctg 388Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu
I040426-序列表105 110 115 120ctg agc cgc acc aac cac ttc gag aag atc cag atc atc ccc aag agc 436Leu Ser Arg Thr Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser125 130 135agc tgg agc aac cac gac gcc agc agc ggc gtg agc agc gcc tgc ccc 484Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro140 145 150tac cac ggc cgc agc agc ttc ttc cgc aac gtg gtg tgg ctg atc aag 532Tyr His Gly Arg Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys155 160 165aag aac agc gcc tac ccc acc atc aag cgc agc tac aac aac acc aac 580Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn170 175 180cag gag gac ctg ctg gtg ctg tgg ggc atc cac cac ccc aac gac gcc 628Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala185 190 195 200gcc gag cag acc aag ctg tac cag aac ccc acc acc tac atc agc gtg 676Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val205 210 215ggc acc agc acc ctg aac cag cgc ctg gtg ccc gag atc gcc acc cgc 724Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Glu Ile Ala Thr Arg220 225 230ccc aag gtg aac ggg cag agc ggc cgc atg gag ttc ttc tgg acc atc 772Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile235 240 245ctg aag ccc aac gac gcc atc aac ttc gag agc aac ggc aac ttc atc 820Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile250 255 260gcc ccc gag tac gcc tac aag atc gtg aag aag ggc gac agc gcc atc 868Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile265 270 275 280atg aag agc gag ctg gag tac ggc aac tgc aac acc aag tgc cag acc 916Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr285 290 295ccc atg ggc gcc atc aac agc agc atg ccc ttc cac aac atc cac ccc 964Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro300 305 310ctg acc atc ggc gag tgc ccc aag tac gtg aag agc aac cgc ctg gtg 1012Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val315 320 325ctg gcc acc ggc ctg cgc aac acc ccc cag cgc gag cgc cgc cgc aag 1060Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Thr Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys330 335 340aag cgc ggc ctg ttc ggc gcc atc gcc ggc ttc atc gag ggc ggc tgg 1108Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp345 350 355 360cag ggc atg gtg gac ggc tgg tac ggg tac cac cac agc aac gag cag 1156Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln365 370 375ggc agc ggc tac gcc gcc gac aag gag agc acc cag aag gcc atc gac 1204Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp380 385 390ggc gtg acc aac aag gtg aac agc atc atc gac aag atg aac acc cag 1252Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln395 400 405ttc gag gcc gtg ggc cgc gag ttc aac aac ctg gag cgc cgc atc gag 1300
I040426-序列表Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu410 415 420aac ctg aac aag cag atg gag gac ggc ttc ctg gac gtg tgg acc tac 1348Asn Leu Asn Lys Gln Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr425 430 435 440aac gcc gag ctg ctg gtg ctg atg gag aac gag cgc acc ctg gac ttc 1396Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe445 450 455cac gac agc aac gtg aag aac ctg tac gac aag gtg cgc ctg cag ctg 1444His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu460 465 470cgc gac aac gcc aag gag ctg ggc aac ggc tgc ttc gag ttc tac cac 1492Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His475 480 485aag tgc gac aac gag tgc atg gag agc gtg aag aac ggc acc tac gac 1540Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp490 495 500tac ccc cag tac agc gag gag gcc cgc ctg aac cgc gag gag atc agc 1588Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser505 510 515 520ggc gtg aag ctc gag agc atg ggc acc tac cag atc ctg agc atc tac 1636Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr525 530 535agc acc gtg gcc agc agc ctg gcc ctg gcc atc atg gtg gcc ggc ctg 1684Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu540 545 550agc ctg tgg atg tgc agc aac ggc agc ctg cag tgc cgc atc tgc atc 1732Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile555 560 565taaatttgtg agttcagatt gtagttaaaa acacccttgt gtctact 1779<210>2<211>568<212>PRT<213>人工合成<400>2Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val20 25 30Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile35 40 45Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys50 55 60Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn65 70 75 80Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
I040426-序列表85 90 95Glu Lys Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn100 105 110Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Thr Asn His Phe Glu115 120 125Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser130 135 140Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr His Gly Arg Ser Ser Phe Phe145 150 155 160Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile165 170 175Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp180 185 190Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln195 200 205Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg210 215 220Leu Val Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn245 250 255Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile260 265 270Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly275 280 285Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser290 295 300Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Thr325 330 335Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile340 345 350Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr355 360 365Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys370 375 380
I040426-序列表Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser385 390 395 400Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe405 410 415Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Gln Met Glu Asp420 425 430Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met435 440 445Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu450 455 460Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu485 490 495Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala500 505 510Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly515 520 525Thr Tyy Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala530 535 540Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly545 550 555 560Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile565.
<210>3<211>101<212>DNA<213>人工合成<400>3agcgaaagca ggggtccaat ctgtcaaaat ggagaagatc gtgctgctgc tggccatcgt 60gagcctggtg aagagcgacc agatctgcat cggctaccac g101<210>4<211>90<212>DNA<213>人工合成<400>4
I040426-序列表ccagatctgc atcggctacc acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccatcatgga 60gaagaacgtg accgtgaccc acgcccagga 90<210>5<211>101<212>DNA<213>人工合成<400>5gccacgctgc agtcgcgcag gatcaggggc ttcacgccgt tcaggtcgca cagcttgccg 60ttgtgggtct tctccaggat gtcctgggcg tgggtcacgg t101<210>6<211>110<212>DNA<213>人工合成<400>6tgcagcgtgg ccggctggct gctgggcaac cccatgtgcg acgagttcat caacgtgccc 60gagtggagct acatcgtgga gaaggccagc cccgccaacg acctgtgcta 110<210>7<211>110<212>DNA<213>人工合成<400>7ctgctcttgg ggatgatctg gatcttctcg aagtggttgg tgcggctcag caggtgcttc 60agctcctcgt agtcgttgaa gtcgccgggg tagcacaggt cgttggcggg 110<210>8<211>98<212>DNA<213>人工合成<400>8caagagcagc tggagcaacc acgacgccag cagcggcgtg agcagcgcct gcccctacca 60cggccgcagc agcttcttcc gcaacgtggt gtggctga 98<210>9<211>100<212>DNA
I040426-序列表<213>人工合成<400>9tgccccacag caccagcagg tcctcctggt tggtgttgtt gtagctgcgc ttgatggtgg 60ggtaggcgct gttcttcttg atcagccaca ccacgttgcg 100<210>10<211>97<212>DNA<213>人工合成<400>10aggaggacct gctggtgctg tggggcatcc accaccccaa cgacgccgcc gagcagacca 60agctgtacca gaaccccacc acctacatca gcgtggg 97<210>11<211>99<212>DNA<213>人工合成<400>11ctccatgcgg ccgctctgcc cgttcacctt ggggcgggtg gcgatctcgg gcaccaggcg 60ctggttcagg gtgctggtgc ccacgctgat gtaggtggt99<210>12<211>110<212>DNA<213>人工合成<400>12gcggccgcat ggagttcttc tggaccatcc tgaagcccaa cgacgccatc aacttcgaga 60gcaacggcaa cttcatcgcc cccgagtacg cctacaagat cgtgaagaag 110<210>13<211>110<212>DNA<213>人工合成<400>13catgctgctg ttgatggcgc ccatgggggt ctggcacttg gtgttgcagt tgccgtactc 60cagctcgctc ttcatgatgg cgctgtcgcc cttcttcacg atcttgtagg 110<210>14
I040426-序列表<211>110<212>DNA<213>人工合成<400>14gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag tacgtgaaga 60gcaaccgcct ggtgctggcc accggcctgc gcaacacccc ccagcgcgag 110<210>15<211>110<212>DNA<213>人工合成<400>15gtacccgtac cagccgtcca ccatgccctg ccagccgccc tcgatgaagc cggcgatggc 60gccgaacagg ccgcgcttct tgcggcggcg ctcgcgctgg ggggtgttgc 110<210>16<211>91<212>DNA<213>人工合成<400>16ggtacgggta ccaccacagc aacgagcagg gcagcggcta cgccgccgac aaggagagca 60cccagaaggc catcgacggc gtgaccaaca a91<210>17<211>103<212>DNA<213>人工合成<400>17gcggcggctc ttcctccagg ttgttgaact cgcggcccac ggcctcgaac tgggtgttca 60tcttgtcgat gatgctgttc accttgttgg tcacgccgtc gat 103<210>18<211>97<212>DNA<213>人工合成<400>18caacctgctc ttcggagcgc cgcatcgaga acctgaacaa gcagatggag gacggcttcc 60
I040426-序列表tggacgtgtg gacctacaac gccgagctgc tggtgct 97<210>19<211>99<212>DNA<213>人工合成<400>19gcgcagctgc aggcgcacct tgtcgtacag gttcttcacg ttgctgtcgt ggaagtccag60ggtgcgctcg ttctccatca gcaccagcag ctcggcgtt 99<210>20<211>99<212>DNA<213>人工合成<400>20gtgcgcctgc agctgcgcga caacgccaag gagctgggca acggctgctt cgagttctac60cacaagtgcg acaacgagtg catggagagc gtgaagaac 99<210>21<211>99<212>DNA<213>人工合成<400>21tgctctcgag cttcacgccg ctgatctcct cgcggttcag gcgggcctcc tcgctgtact60gggggtagtc gtaggtgccg ttcttcacgc tctccatgc 99<210>22<211>107<212>DNA<213>人工合成<400>22gtgaagctcg agagcatggg cacctaccag atcctgagca tctacagcac cgtggccagc60agcctggccc tggccatcat ggtggccggc ctgagcctgt ggatgtg 107<210>23<211>101<212>DNA<213>人工合成
I040426-序列表<400>23agtagacaca agggtgtttt taactacaat ctgaactcac aaatttagat gcagatgcgg 60cactgcaggc tgccgttgct gcacatccac aggctcaggc c101<210>24<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>24agcgaaagca ggggtccaat ctgtca 26<210>25<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>25ccagatctgc atcggctacc acgcca 26<210>26<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>26gccacgctgc agtcgcgcag gatca 25<210>27<211>27<212>DNA<213>人工合成<400>27gactgcagcg tggccggctg gctgctg 27<210>28<211>28<212>DNA<213>人工合成
I040426-序列表<400>28ccagctgctc ttggggatga tctggatc 28<210>29<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>29caagagcagc tggagcaacc acga 24<210>30<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>30tgccccacag caccagcagg tcctc25<210>31<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>31aggaggacct gctggtgctg tgg 23<210>32<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>32ctccatgcgg ccgctctgcc cgttc25<210>33<211>27<212>DNA<213>人工合成<400>33gagcggccgc atggagttct tctggac 27<210>34
I040426-序列表<211>27<212>DNA<213>人工合成<400>34ggcatgctgc tgttgatggc gcccatg 27<210>35<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>35cagcatgccc ttccacaaca tccac25<210>36<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>36gtggtacccg taccagccgt ccacca 26<210>37<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>37ggtacgggta ccaccacagc aacga25<210>38<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>38gcggcggctc ttcctccagg ttgt 24<210>39<211>25<212>DNA
I040426-序列表<213>人工合成<400>39caacctgctc ttcggagcgc cgcat25<210>40<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>40gcgcagctgc aggcgcacct tgtc 24<210>41<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>41gtgcgcctgc agctgcgcga caac 24<210>42<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>42tgctctcgag cttcacgccg ctg 23<210>43<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>43gtgaagctcg agagcatggg cac 23<210>44<211>27<212>DNA<213>人工合成<400>44
I040426-序列表agtagacaca agggtgtttt taactac 27<210>45<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>45attaaccctc actaaaggga a21<210>46<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>46acttaatacg actcactata 20<210>47<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>47ccactctaga gtgtttttaa ctacaa 26<210>48<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>48acttaatacg actcactata 20<210>49<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>49gcaccaacca cttcgaga18<210>50
I040426-序列表<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>50gctaccacgc caacaacagc 20<210>51<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>51gaagagcgag ctggagtac 19<210>52<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>52gcagatggag gacggcttcc t21<210>53<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>53tgcagcttat aatggttaca 20<210>54<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>54tcaaaatgga gaagatcgtg ct 22<210>55<211>26<212>DNA<213>人工合成
I040426-序列表<400>55ccactctaga gtgtttttaa ctacaa 2權(quán)利要求
1.一種禽流感病毒血凝素基因，其特征在于具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一種表達(dá)載體，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的基因。
3.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其是pCIoptiHA。
4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于表達(dá)權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其是真核細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其是人胚胎腎細(xì)胞、COS細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的基因在制備H5亞型流感病毒DNA疫苗中作為免疫原基因的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的基因在制備亞單位疫苗、重組禽痘病毒基因工程疫苗中作為免疫原基因的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的基因在制備單克隆抗體中作為免疫原基因的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工合成的含有雞體偏嗜性密碼子的基因optiHA，其閱讀框架含1707bp核苷酸，共編碼568個(gè)氨基酸，該基因與H5亞型高致病力禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]血凝素(HA)基因的核苷酸同源率為70％，氨基酸同源率為100％，編碼H5亞型禽流感病毒GD/1/96(H5N1)的血凝素(HA)蛋白。本發(fā)明同時(shí)涉及該基因作為H5亞型流感DNA疫苗及其它基因工程疫苗的免疫原基因的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1632124SQ20041000986
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2004年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日
發(fā)明者陳化蘭, 姜永萍, 步志高, 于康震 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所