專利名稱：一種h9n2亞型禽流感病毒三個基因的多重逆轉(zhuǎn)錄擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域的，具體涉及一種H9N2亞型禽流感病毒三個基因的多重逆轉(zhuǎn)錄擴增方法，即用于同時擴增H9N2亞型禽流感病毒HA、NA、M三個全長基因的寡核苷酸引物組及使用該引物組的多重擴增方法。
背景技術(shù)：
禽流感是由流感病毒屬的A型流感病毒引起的禽類的一種以呼吸系統(tǒng)癥狀為主的禽類傳染病。其中H9N2亞型低致病性禽流感病毒雖不及H5亞型禽流感病毒的致病力強，但由于其臨床的分離率較高，且具有致病力變強造成免疫失敗的趨勢，所以，H9N2亞型禽流感病毒給養(yǎng)禽業(yè)帶來的危害也不容忽視。 禽流感病毒基因組由8個負鏈單鏈RNA片段組成，分別為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因，這種核酸的多段性易使抗原性發(fā)生突變而不斷變異，使得H9N2低致病性禽流感的致病力也隨之變異。血凝素(HA)是構(gòu)成病毒囊膜纖突的主要成分之一，在病毒吸附和穿膜過程中以及決定病毒致病力方面起著關(guān)鍵作用。神經(jīng)氨酸酶(NA)是構(gòu)成病毒囊膜纖突的另一部分。研究HA、NA基因發(fā)生的突變對掌握H9N2亞型禽流感病毒變異情況至關(guān)重要?；|(zhì)蛋白(M)位于病毒囊膜的類脂雙層內(nèi)側(cè)，核衣殼外側(cè)，是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白，具有特異性，其抗原性的差異也是流感病毒分型依據(jù)之一。常規(guī)禽流感序列分析需對各個基因分別反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，若對大量毒株進行分析時用普通PCR方法擴增全基因則既花費大量時間，又耗費實驗材料。因此，建立一種能同時擴增H9N2亞型禽流感病毒HA、NA、M三個全長基因的多重PCR方法具有重要的應用上的價值。而且目前多重RT-PCR方法均應用于禽流感病毒的檢測或者分型，擴增出的目的片段僅是目的基因的一部分基因片段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種H9N2亞型禽流感病毒三個基因的多重逆轉(zhuǎn)錄擴增方法，可快速同時擴增H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M三個全長基因，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明首先提供能夠同時擴增H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M三個全長基因的引物組，包括有一個通用的逆轉(zhuǎn)錄引物和用于擴增HA、NA、M基因的引物對，其中逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1，用于擴增A、NA、M基因的引物對的核苷酸序列分別為SEQID NO:2-7。本發(fā)明還提供能夠同時擴增H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M三個全長基因的方法，包括如下的步驟:I)病原RNA的提取
取H9N2亞型禽流感病毒感染的陽性雞胚尿囊液400 u L，加入600 u L細胞裂解液和400 u L氯仿，顛倒混勻后，_20°C沉淀IOmin, 15，OOOg離心IOmin ;取上清加入到750 u L異丙醇中，顛倒混勻，_20°C沉淀30min，15，OOOg離心IOmin ;棄去上清液，用75%的冷乙醇洗2遍，棄去上清液，并吸干殘余液體；2)反轉(zhuǎn)錄采用20ii L 的反轉(zhuǎn)錄體系:5XRT buffer4 y L，2.5mmol/L 的 dNTPs 2u L,40U/U L RNA酶抑制劑0.5 ii L，200U/ u L M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 y L，25 y mol/L的通用反轉(zhuǎn)錄引物1.5 ii L，用DEPC水補足體積至20 u L，42°C水浴I小時；3)多重RT-PCR擴增HA、NA、M全長基因采用總體積為30 ii L的多重PCR反應體系:10XPCR Buffer 3 u L, 25mMMgCl24ii L，2.5mmol/L 的 dNTPs 5 y L，Taq 酶 0.5 y L，基因上下游引物各 0.5 y L，RT 產(chǎn)物2 ii L，用DEPC水補足至30 u L，混勻離心后進行PCR，循環(huán)條件為94°C預變性5min后，94°C變性30S，60°C退火40S，72°C延伸90S，共循環(huán)30次，最后72°C終延伸IOmin完成擴增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見三個目的條帶，其中HA全長基因擴增出1742bp的特異性條帶，NA全長基因擴增出1410bp的特異性條帶，M全長基因擴增出1027bp的特異性條帶。本發(fā)明的引物組及建立的多重擴增方法可在一個反應中將三個基因同時擴增出來，且設(shè)計的多重引物在多重PCR反應中無非特異性擴增，具有很好的應用價值。



圖1:本發(fā)明方法的擴增結(jié)果的電泳圖；其中l(wèi)、Marker DL2000 2、H9N2 禽流感病毒；圖2:本發(fā)明方法的特異性試驗電泳圖，其中1、Marker DL2000 2、H9N2禽流感病毒3、傳染性支氣管炎病毒4、新城疫病毒5、傳染性法氏囊病毒；圖3:本發(fā)明方法的敏感性試驗的電泳圖，其中:1、10ii g/ ii I cDNA ； 2、I U g/ U I cDNA ;3、10 U g/ U I cDNA cDNA ；4、10_2ii g/ii I cDNA ;5、10_3ii g/ii I cDNA ；6,Marker DL2000。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的引物組及擴增方法進行詳細的描述。(I)引物設(shè)計由于H9N2亞型禽流感病毒HA、NA、M全長基因在5’端堿基同源性很高，因此設(shè)計引物時既要防止交叉擴增，又要保持引物的普遍性，引物序列長度至關(guān)重要，而申請人通過序列的比對，篩選出了各自的特異引物，從而促成了本發(fā)明。根據(jù)H9N2亞型的HA全基因序列、NA全基因序列、M全基因序列，運用DNAStar軟件分析其同源性，再使用Primer Premier 5.0軟件,在全基因的5’端和3’端設(shè)計特異性
引物及通用反轉(zhuǎn)錄引物。引物序列如下:
權(quán)利要求
1.一種擴增H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M三個全長基因的引物組，其特征在于，包括有一個通用的逆轉(zhuǎn)錄引物和用于擴增HA、NA、M基因的引物對，其中逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1，用于擴增A、NA、M基因的引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:2_7。
2.一種同時擴增H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M三個全長基因的方法，包括如下的步驟: 1)病原RNA的提取 取H9N2亞型禽流感病毒感染的陽性雞胚尿囊液400 u L，加入600 u L細胞裂解液和400 V- L氯仿,顛倒混勻后，_20°C沉淀IOmin, 15, OOOg離心IOmin ;取上清加入到750 ii L異丙醇中，顛倒混勻，_20°C沉淀30min，15，OOOg離心IOmin ;棄去上清液，用75%的冷乙醇洗2遍，棄去上清液，并吸干殘余液體； 2)反轉(zhuǎn)錄 采用 20 ii L 的反轉(zhuǎn)錄體系:5 X RT buffer4 u L, 2.5mmol/L 的 dNTPs 2 u L, 40U/ u LRNA酶抑制劑0.5iiL，200U/iiL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 y L，25 y mol/L的通用逆轉(zhuǎn)錄引物1.5 ii L，用DEPC水補足體積至20 u L，42°C水浴I小時; 3)多重RT-PCR擴增HA、NA、M全長基因 采用總體積為30iiL的多重PCR反應體系:10XPCR Buffer 3u L,25mM MgCl24u L,2.5mmol/L 的 dNTPs 5yL，Taq 酶 0.5 y L，基因上下游引物各 0.5 y L，RT 產(chǎn)物 2 y L，用 DEPC水補足至30 u L，混勻離心后進行PCR，循環(huán)條件為94°C預變性5min后，94°C變性30S，60°C退火40S，72°C延伸90S，共循環(huán)30次，最后72°C終延伸IOmin完成擴增。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的通用逆轉(zhuǎn)錄引物為權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)錄引物。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的基因上下游引物為權(quán)利要求1所述的用于擴增HA、NA、M基因的引物對，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0:2_7。
5.如權(quán)利要求 2所述的方法，其特征在于，所述的HA全長基因為1742bp，NA全長基因為1410bp，M全長基因為1027bp。
全文摘要
本發(fā)明目的是提供一種H9N2亞型禽流感病毒三個基因的多重逆轉(zhuǎn)錄擴增方法，可快速同時擴增H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M三個全長基因。 本發(fā)明首先提供能夠同時擴增H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M三個全長基因的引物組，包括有一個通用的逆轉(zhuǎn)錄引物和用于擴增HA、NA、M基因的引物對，其中逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:1，用于擴增A、NA、M基因的引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:2-7。本發(fā)明還提供能夠同時擴增H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M三個全長基因的方法，可在一個反應中同時擴增出HA、NA、M三個基因。
文檔編號C12N15/10GK103194443SQ20131011199
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者張樂萃, 陳欣, 尹燕博, 單虎 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學