專利名稱：鷹嘴豆殼二孢葉枯病環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行菌樣的快速檢測的方法，具體是一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法。
背景技術(shù)：
鷹嘴豆殼二孢葉枯病由鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei引起,是一種毀滅性的病害。1911年，鷹嘴豆殼二孢葉枯病在巴基斯坦被首次發(fā)現(xiàn)，該病害的危害性很高，在鷹嘴豆的重要種植區(qū)巴基斯坦，年受害面積高達(dá)25-50%。冷涼的氣候非常適合病害發(fā)展，常造成100%的產(chǎn)量損失。2007年，該病害在新疆北部的鷹嘴豆主栽區(qū)昌吉州木壘縣、奇臺(tái)縣等地暴發(fā)，其中僅在木壘縣發(fā)病面積為4000hm2，平均為害株率46%，嚴(yán)重田塊為害株率達(dá)到100%，產(chǎn)量損失率為40% -50%。該病害主要危害葉片、葉柄、莖桿，也可侵染幼嫩的莢果。葉片被害后由葉緣向內(nèi)擴(kuò)散，形成“U”形或“V”形淺褐色至深褐色病斑，潮濕時(shí)病斑上產(chǎn)生分散的細(xì)小黑點(diǎn)，葉柄和莖桿受害初期產(chǎn)生水浸狀病斑，隨后病斑逐漸變?yōu)樯詈稚?，病斑處凹陷并逐漸萎蔫干枯造成落葉斷枝，嚴(yán)重時(shí)整株枯萎死亡。豆莢受害初期產(chǎn)生水浸狀病斑，然后變成深褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)豆莢干枯。雨水偏多年份，發(fā)病嚴(yán)重，產(chǎn)量損失極大。因此，開展鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌檢測，防止其從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，以及在其發(fā)病初期進(jìn)行診斷檢測，對(duì)鷹嘴豆殼二孢葉枯病的傳播與控制具有重要意義。自從發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆殼二孢葉枯病以來，各國研究人員便對(duì)其檢測技術(shù)進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的檢測方法是從病殘?bào)w或帶病種子分離菌體，將其接種在相應(yīng)培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天，再對(duì)這些菌體的形態(tài)進(jìn)行觀察。若產(chǎn)孢則繼續(xù)觀察分生孢子的形態(tài)特征，從菌落上挑片鏡檢，觀察菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態(tài)。從而確定是否存在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助顯微鏡技術(shù)對(duì)發(fā)病癥狀進(jìn)行判定是否由Ascochyta rabiei引起的病害。傳統(tǒng)的檢測方法不僅操作繁瑣、費(fèi)時(shí),而且要求有高度的專業(yè)知識(shí)，尤其不能滿足病害防治中快速診斷及海關(guān)進(jìn)出境快速檢測和鑒定的需求?；蛐酒夹g(shù)雖然能夠同時(shí)進(jìn)行多種真菌的鑒定，但成本高，制約了其發(fā)展；雜交方式固有的局限性影響了其特異性；質(zhì)譜技術(shù)以其快速真確的優(yōu)點(diǎn)被用于微生物鑒定，由于質(zhì)譜鑒定必須是培養(yǎng)后分純的單克隆菌落，而且設(shè)備昂貴，操作難度高，因此，限制了其應(yīng)用。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了多種核酸擴(kuò)增方法，如鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)(Strand Displacement Amplification, SDA),滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling CircleAmplification, RCA),以及目前被廣泛使用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase ChainReaction, PCR)等。這些擴(kuò)增方法都有其啟動(dòng)新一輪核酸合成的創(chuàng)新之處。 其中，基于rDNA-1TS的長度多態(tài)性和序列多態(tài)性的序列分析，由于可以從不太長的核酸序列中獲得相對(duì)足夠的信息用來反應(yīng)生物親緣關(guān)系與分類情況，因而成為真菌分類及鑒定研究的熱點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于真菌的屬種間及種內(nèi)組群水平的系統(tǒng)學(xué)研究。因此，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行特異、靈敏快速分子檢測的成功例子已越來越多。國內(nèi)外有學(xué)者利用基于ITS堿基序列設(shè)計(jì)引物對(duì)真菌的分子檢測開展研究，但PCR方法需要昂貴的PCR儀，對(duì)設(shè)備要求較高，不適宜在基層進(jìn)行推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatdIsothermal Amplification,簡稱 LAMP)，是2000年由日本的榮研株式會(huì)的Notomi T等人開發(fā)出來的一種新的核酸擴(kuò)增方法。LAMP法是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，具有高特異性和等溫快速擴(kuò)增的特點(diǎn)，可以在Ih之內(nèi)，將靶DNA片段擴(kuò)增IO9-1Oltl倍。反應(yīng)完成后，直接在擴(kuò)增產(chǎn)物中添加SYBR GREEN I染料后，可通過肉眼觀察有無熒光直接判定結(jié)果，體系呈綠色即為陽性，呈橙色即為陰性?；蛟贒NA延生合成時(shí)，從脫氧核酸三磷酸基質(zhì)(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中鎂離子結(jié)合，會(huì)產(chǎn)生一種焦磷酸鎂的衍生物，而高效擴(kuò)增的LAMP法生成大量這樣的衍生物，并呈現(xiàn)白色沉淀?？梢园褱啙岫茸鳛殍b定指標(biāo)，只要用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴(kuò)增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察等過程。具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡便等特點(diǎn)。已廣泛應(yīng)用于臨床疾病的診斷、流行性細(xì)菌或病毒的定性及定量檢測。因?yàn)長AMP反應(yīng)不需要PCR儀和昂貴的試劑，所以利于在一些基層機(jī)構(gòu)的應(yīng)用，有著極為廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，該方法包括真菌DNA的提取、真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、顯示檢測步驟完成，以克服現(xiàn)有技術(shù)所需周期長、操作復(fù)雜等等問題，該方法優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，且成本低，可用于田間鷹嘴豆殼二孢葉枯病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定。本發(fā)明所述的一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，按下列步驟進(jìn)行:a、待檢樣品或真菌的DNA提取:
采用常規(guī)真菌DNA提取方法提取待檢樣品核酸，其中提取樣品DNA的0D26(l/0D28(l為
1.6-2.0，濃度為 IO-1OOng/ μ L ；b、進(jìn)行鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng):在裝有22 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待檢樣品模板DNA和IyL Bst DNA聚合酶，于恒溫65 °C擴(kuò)增反應(yīng)30_60min，將溫度調(diào)到80°C終止反應(yīng)，3_5min后取出待檢；C、顯色檢測:在每個(gè)反應(yīng)管中加入I μ L顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，即為待檢樣品中含有或?yàn)辁椬於箽ざ呷~枯病真菌。步驟b中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液是由IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、1.0-1.4mmol/L脫氧核酸三磷酸基質(zhì)、4-8mmol/L硫酸鎂、0.8-1.6 μ mol/L上游內(nèi)引物FIP、0.8-1.6 μ mol/L下游內(nèi)引物ΒΙΡ、0.2-0.3 μ mol/L上游外引物F3、0.2-0.3 μ mol/L下游外引物B3、
0.2-0.8 μ mol/L上游環(huán)引物L(fēng)F和0.2-0.8 μ mol/L下游環(huán)引物L(fēng)B組成，其中:上游外引物F3:5 ’ -CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3，；下游外引物B3:5 ’ -ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3 ’ ；上游內(nèi)引物FIP: 5 ’ -GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3，；
下游外引物BIP:5’ -CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’ ；上游環(huán)引物L(fēng)F:5，-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3，；下游環(huán)引物 LB: 5 ’ -GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3 ’。步驟b環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中IOXThermopol反應(yīng)緩沖液中含有200mmolpH8.8的三輕基甲基氨基甲燒-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1%曲拉通X-100。步驟b環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的脫氧核酸三磷酸基質(zhì)由dUTP、dATP、dGTP和dCTP四種脫氧核糖核酸組成，其中四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP = 2:1:1:1。步驟b中Bst DNA聚合酶為8U/ μ L。步驟c中顯色劑為10%的熒光染料SYBR GREEN I。本發(fā)明所述的一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，該方法的主要原理為:(1)特殊設(shè)計(jì)一組可以識(shí)別靶DNA六個(gè)不同序列的兩個(gè)內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個(gè)外引物(上游外引物和下游外引物)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個(gè)內(nèi)引物首先和靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個(gè)外引物啟動(dòng)，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個(gè)內(nèi)弓I物和一個(gè)外引物啟動(dòng)的DNA合成模板，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA ； (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)D NA做模板，啟動(dòng)鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA和一個(gè)新的由兩倍莖長度的莖環(huán)DNA ； (4)在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個(gè)含有靶DNA重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA積累到IO9拷貝，可通過熒光染料來觀察擴(kuò)增結(jié)果。本發(fā)明涉及的鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，該方法中:鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的分離、純化，采用常規(guī)分離真菌的方法對(duì)其進(jìn)行分離，采用單孢分離進(jìn)行純化；鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的培養(yǎng):將鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei接種到鷹嘴豆煎汁PDA平板上，置溫度26°C溫箱中培養(yǎng)15d，備用；鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的DNA提取和檢測:將50mg冷凍干燥后的菌絲和孢子粉至研缽內(nèi)加入液氮充分研磨，倒入離心管中，加入200yL2%十六烷基三甲基溴化銨裂解液(lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷_鹽酸，PH8.0 ；20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0, 1.4mol/L氯化鈉和少量石英砂充分研磨，再加入300 μ L2%十六烷基三甲基溴化銨裂解液，將樣品充分混勻，溫度65°C，水浴lh(5-10min混勻一次)取出放置室溫，加入等體積的氯仿/異戍醇(v/v)24: I,充分顛倒混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心IOmin,取上清液至新的離心管中，繼續(xù)抽提一次，取上清液至新的離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇充分顛倒混勻，溫度4°C，放置l_2h促進(jìn)DNA沉淀，12000轉(zhuǎn)/分鐘，溫度4°C，離心IOmin,棄上清液，加入500 μ L70%乙醇混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘，溫度4°C，離心5min，棄上清液，在超凈工作臺(tái)上自然晾干無酒精味后加入適量的lXTE(10mmOl/L三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，0.lmmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0)緩沖液進(jìn)行溶解(TE中含5 μ g/ μ L核糖核酸酶(RNase))，得到DNA溶液待用；下載GenBank公布的多條鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei ITS序列，其序列號(hào)分別為 AY152550，DQ822479, DQ822480, EU167600, FJ032643, HQ700312,JF714463，將下載序列與本實(shí)驗(yàn)測序序列名為“ITS”進(jìn)行比對(duì)，找出保守區(qū)，即ITS序列的l-440bp,并根據(jù)其利用在線軟件www.primerexplorer, jp設(shè)計(jì)一套特異的LAMP引物,包括兩條外引物:上游外引物(F3)/下游外引物(B3)，兩條內(nèi)引物:上游內(nèi)引物(FIP)/下游內(nèi)引物(BIP)，兩條環(huán)引物:上游環(huán)引物(LF)/下游環(huán)引物(LB);鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei真菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP檢測引物的祀片段大小為181bp ；其中引物序列為:上游外引物F3:5’ -CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’ ；下游外引物B3:5 ’ -ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3 ’ ；上游內(nèi)引物FIP: 5 ’ -GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3，；下游外引物BIP:5，-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3，；上游環(huán)引物L(fēng)F:5’ -CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’ ；下游環(huán)引物L(fēng)B: 5，-GCG TATTGATTTCGGAGCGCAGT-3，。序列比對(duì)結(jié)果:AY152550.....ATCATTACCTAGAGTTTGTGGGCTTTGCCCGCTAC 35DQ822479 ____g----------------------------------- 36DQ822480 ____g----------------------------------- 36EU167600 gaagg----------------------------------- 1720FJ032643 gaagg----------------------------------- 58HQ700312 gaagg-------------------------------1--- 59JF714463.......ggggct----c_g_a------------------ 33ITS................................................8AY152550 CTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACTTACGTTTCCTCGGCG 75DQ822479 ---------------------------------------- 76DQ822480 ---------------------------------------- 76EU167600 ---------------------------------------- 1760FJ032643 ---------------------------------------- 98HQ700312 ---------------------------------------- 99JF714463 ---------------------------------------- 73ITS---------------------------------------- 48AY152550 GGTCCGCCCGCCGATTGGACAAAATCAAACCCTTTGCAGT 115DQ822479 ---------------------------------------- 116DQ822480 ---------------------------------------- 116EU167600 ---------------------------------------- 1800FJ032643 ---------------------------------------- 138HQ700312 ---------------------------------------- 139JF714463 ---------------------------------------- 11權(quán)利要求
1.一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行: a、待檢樣品或真菌的DNA提取: 采用常規(guī)真菌DNA提取方法提取待檢樣品核酸，其中提取樣品DNA的OD26(i/OD28Q為1.6-2.0，濃度為 IO-1OOng/ μ L ； b、進(jìn)行鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng): 在裝有22 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待檢樣品模板DNA和I μ LBst DNA聚合酶，于恒溫65°C擴(kuò)增反應(yīng)30-60min，將溫度調(diào)到80°C終止反應(yīng)，3-5min后取出待檢； C、顯色檢測:在每個(gè)反應(yīng)管中加入IuL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，即為待檢樣品中含有或?yàn)辁椬於箽ざ呷~枯病真菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液是由IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、1.0-1.4mmol/L脫氧核酸三磷酸基質(zhì)、4-8mmol/L硫酸鎂、 0.8-1.6ymol/L上游內(nèi)引物FIP、0.8-1.6 μ mol/L下游內(nèi)引物ΒΙΡ、0.2_0.3 μ mol/L上游外引物 F3、0.2-0.3 μ mol/L 下游外引物 B3、0.2-0.8 μ mol/L 上游環(huán)引物 LF 和 0.2-0.8ymol/L下游環(huán)引物L(fēng)B組成，其中: 上游外引物 F3:5’ -CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’ ； 下游外引物 B3:5，-ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3，；上游內(nèi)引物 FIP:5’ -GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’ ；下游外引物 BIP:5’ -CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’ ； 上游環(huán)引物 LF:5’ -CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’ ； 下游環(huán)引物 LB:5’ -GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中10 X Thermopol反應(yīng)緩沖液中含有200mmol pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、IOOmmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和I %曲拉通X-100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中的脫氧核酸三磷酸基質(zhì)由dUTP、dATP、dGTP和dCTP四種脫氧核糖核酸組成，其中四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP = 2:1:1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中BstDNA聚合酶為8U/ μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟c中顯色劑為10%的熒光染料SYBRGREEN I。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，該方法包括真菌DNA的提取、真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、顯示檢測步驟完成，以克服現(xiàn)有技術(shù)所需周期長、操作復(fù)雜等問題，該方法優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，且成本低，可用于田間鷹嘴豆殼二孢葉枯病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103215375SQ20131018632
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月20日
發(fā)明者馬德英, 馬麗娟, 羌松 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)