專利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種改進(jìn)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法及其在檢測西伯利亞立克次體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
西伯利亞立克次體(Rickettsia sibirica)又名北亞蝶傳立克次體，通過硬蝶傳播引起北亞蝶傳立克次體斑疫熱(North Asian tick-borne rickettsiosis)或叫北亞蝶傳斑疫傷寒(North Asian tick typhus),呈多形態(tài)在宿主細(xì)胞的胞核內(nèi)成片積集。經(jīng)蝶盯咬人體時，把病原體注入人體先在局部淋巴結(jié)繁殖，以后釋放入血液形成立克次體血癥，造成血內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，引起各個臟器的功能異常。臨床特點(diǎn)有發(fā)熱、初瘡，局部淋巴結(jié)腫大 及皮疹等。立克次體在自然界動物宿主與媒介之間維持持久循環(huán)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在必須經(jīng)電泳凝膠成像才可以觀察結(jié)果，或濁度儀顯示的結(jié)果信噪比低的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有操作簡單、反應(yīng)快速、耗時短等優(yōu)點(diǎn)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法，包括以西伯利亞立克次體GltA基因序列作為靶序列，比對后選取保守區(qū)域，引物設(shè)計包括兩個外引物和兩個內(nèi)引物的設(shè)計，內(nèi)引物FIP(上端內(nèi)引物)包含F(xiàn)lc序列和F2(F2c區(qū)域的互補(bǔ)序列)，即5' -Flc-F2;內(nèi)引物BIP(下端內(nèi)引物)包含Blc(Bl區(qū)域的互補(bǔ)序列)和B2序列，即5' -B1C-B2。外引物為F3和B3序列，能特異結(jié)合靶序列上的6個特異區(qū)域。選取的保守序列如下5' -GTATTAGCACGGGTATTGCCTCACTTTGGGGACCTGCTCACGGCGGGGCTAATGAAGCGGTAATAAATATGCTTAAAGAAATCGGTAGTTCTGAGTATATTCCTAAATATATAGCTA AA GCTA AGG ATA A A A ATF3 G ATCCATT1AGATTAATGGGTTTTGGTCA TCGTGTATATAAAAACT - F2ATGACCC GCGTG CC GCAGTACTTAAAGAAAC gtgcaaagaagtaFlcTTAAA GGAACTCGGGCAGCTAGACA令 CAATCCGCTCTTACAAATABlc
_Q CAATAGAACTTGA AGCTATCGCTCTTAAAGAl GAATAr TTTTATTGB2AGAGAAAATTAT Al CCAAArGTTGATTTTWTCCG' GTATTATCTATB3AAAGCTATGGGTATACCGTCGCAAATGTTCACTGTACTTTTTGCAATAGCAAGAACCGTAGGCTGGAT-3'設(shè)計外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP為下面序列或其全部對應(yīng)的互補(bǔ)序列第一組
權(quán)利要求
1.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法，其特征在于，該方法包括 以西伯利亞立克次體GltA基因序列作為靶序列，比對后選取保守區(qū)域，設(shè)計外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP為下面序列或其全部對應(yīng)的互補(bǔ)序列
2.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述外引物內(nèi)引物=比例范圍為I :4 I 12o
3.如權(quán)利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述外引物內(nèi)引物=I:8。
4.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增溫度為580C 65O。
5.如權(quán)利要求4所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增溫度為60°C。
6.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增時間為15分鐘 60分鐘。
7.如權(quán)利要求6所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增時間為60分鐘。
8.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述非診斷性方法包括步驟 ①提取樣品DNA:使用基因組DNA提取試劑盒進(jìn)彳丁 DNA的提??；②利用所述外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP、樣品DNA、酶、緩沖液配制25μ L反應(yīng)體系; ③環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增程序； ④電泳檢測分析結(jié)果或使用熒光定量PCR儀、GenieII直接分析結(jié)果。
9.如權(quán)利要求8所述的非診斷性方法，其特征在于，所述25μ L反應(yīng)體系組分如下
10.如權(quán)利要求8所述的非診斷性方法，其特征在于，所述等溫擴(kuò)增采用恒溫水浴、PCR、Real-time PCR、LC320濁度儀、Geniell，使用儀器GenieII進(jìn)行擴(kuò)增時，試劑中加入SYBR Green I染料再進(jìn)行擴(kuò)增；使用所述熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增時，試劑中加入SYBRGreen I染料，進(jìn)行擴(kuò)增時選用SYBR通道進(jìn)行熒光信號收集；試劑中加入鈣黃綠素進(jìn)行擴(kuò)增時選用FAM通道進(jìn)行熒光信號收集。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法，以西伯利亞立克次體GltA基因序列作為靶序列，比對后選取保守區(qū)域，設(shè)計一套引物進(jìn)行擴(kuò)增，并優(yōu)化各反應(yīng)條件。LAMP作為一種分子生物學(xué)檢測非診斷性方法，可使用濁度儀、熒光定量PCR儀或GenieII儀器檢測熒光信號判斷結(jié)果，可不需要凝膠成像判斷結(jié)果，具有快速簡便、反應(yīng)時間短、特異靈敏等獨(dú)特優(yōu)勢。
文檔編號C12R1/01GK102936622SQ201210367029
公開日2013年2月20日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者王靜, 楊宇, 楊永莉, 劉麗娟, 趙婷婷, 王旺, 王莎莎 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院