專利名稱：結(jié)核桿菌耐藥性基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有結(jié)核桿菌耐藥基因突變探針的基因芯片；本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)樣本中結(jié)核桿菌耐藥性的檢測(cè)試劑。
背景技術(shù)：
結(jié)核病為結(jié)核桿菌侵入人體后引起的一種具有強(qiáng)傳染性的慢性消耗性疾病。近年來(lái)，由于抗結(jié)核藥物的大量使用，耐藥結(jié)核病人越來(lái)越多，給結(jié)核病的治療帶來(lái)了很大的困難，而且這樣的盲目治療也導(dǎo)致了結(jié)核桿菌耐藥性的不斷產(chǎn)生。
目前臨床上通常使用藥敏培養(yǎng)的方法來(lái)檢測(cè)樣本中耐藥結(jié)核菌的存在以及耐藥的類型，以此來(lái)指導(dǎo)臨床治療和用藥。但此方法的缺點(diǎn)是操作繁瑣，且需要1個(gè)月左右的檢測(cè)周期，嚴(yán)重延誤了對(duì)病人的治療。
研究表明，常見結(jié)核桿菌的耐藥性主要是由于其相對(duì)應(yīng)的基因發(fā)生突變或微缺失引起的，例如，利福平耐藥主要由于rpoB基因了發(fā)生突變，導(dǎo)致編碼的RNA聚合酶β亞基構(gòu)象發(fā)生變化，利福平與其親合力降低所致；異煙肼主要是由于katG基因編碼區(qū)或InhA基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生突變所致。每個(gè)導(dǎo)致耐藥的基因突變都有幾種到幾十種甚至更多，因此根據(jù)它的突變頻率，設(shè)計(jì)相應(yīng)探針，并將這些探針固定在載體上，制成基因芯片，就可在一個(gè)載體上同時(shí)檢測(cè)導(dǎo)致利福平和異煙肼耐藥的結(jié)核桿菌的絕大多數(shù)突變。
以尼龍膜為載體的DNA芯片技術(shù)，采用的是微量點(diǎn)樣DNA微陣列技術(shù)。其主要的基本原理如下DNA探針為含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端帶有氨基標(biāo)記。經(jīng)活化處理的尼龍膜帶有負(fù)電荷基團(tuán)，可以與氨基形成共價(jià)結(jié)合。利用這種方法可將DNA探針按一定的排列規(guī)律永久的固定在尼龍膜的表面。其主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，技術(shù)要求低，并且探針不受探針分子大小種類的限制，能根據(jù)使用者的要求簡(jiǎn)便地制出符合目的的芯片。在此基礎(chǔ)上結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)微量待測(cè)樣品進(jìn)行大量快速擴(kuò)增，擴(kuò)增后含有相應(yīng)標(biāo)記物的待測(cè)樣品與芯片上的探針進(jìn)行特異性雜交，此后對(duì)雜交信號(hào)強(qiáng)弱和有無(wú)進(jìn)行分析，即可判斷樣品中靶分子的數(shù)量和性質(zhì)。
基因芯片的制作流程如圖1所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥性的基因芯片；本發(fā)明的另一目的在于提供一種可快速地檢測(cè)樣本中耐藥結(jié)核桿菌的檢測(cè)試劑。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的基因芯片包括一基底和固定于該基底上的探針，所述基底可以是例如玻片、各種纖維膜、尼龍膜等各種類型，優(yōu)選為尼龍膜，所述固定于基底上的探針為可與因基因突變而產(chǎn)生耐藥性的結(jié)核桿菌的核酸雜交的特異型探針。優(yōu)選的探針序列為針對(duì)結(jié)核桿菌rpoB基因、katG基因和/或InhA基因突變而設(shè)計(jì)的，可與含有這些突變基因的結(jié)核桿菌核酸雜交的探針。
本發(fā)明根據(jù)結(jié)核桿菌rpoB基因、katG基因編碼區(qū)和InhA基因啟動(dòng)子區(qū)域的突變頻率，設(shè)計(jì)了下面一系列探針N1(S1)5’-cggcaccagccagcyagcchattcatggacc-3’(SEQ ID NO.1)5’-ggtccatgaatdggctrgctggctggtgccg-3’(SEQ ID NO.2)N2(S2)5’-ccaattcatggdccagaacaacccgctgtcgg-3’(SEQ ID NO.3)5’-ccgacagcgggttgttctgghccatgaattgg-3’(SEQ ID NO.4)N3(S3)5’-cagaacaacccgctgtygkggttgacccaca-3’(SEQ ID NO.5)5’-tgtgggtcaaccmcracagcgggttgttctg-3’(SEQ ID NO.6)N4(S4)5’-tcggggttgaccbrcaagcgccgactgtcggcg-3’(SEQ ID NO.7)5’-cgccgacagtcggcgcttgyvggtcaaccccga-3’(SEQ ID NO.8)
N5(S5)5’-caagcgccgactgtbggcgcyggggcccggcggtc-3’(SEQ ID NO.9)5’-gaccgccgggccccrgcgccvacagtcggcgcttg-3’(SEQ ID NO.10)KatG1045’-ggccgctgtttatcckgatggcgtggcacg-3’(SEQ ID NO.11)5’-cgtgccacgccatcmggataaacagcggcc-3’(SEQ ID NO.12)KatG1085’-atccggatggcgtggcasgctgccggcacctac-3’(SEQ ID NO.13)5’-gtaggtgccggcagcstgccacgccatccggat-3’(SEQ ID NO.14)KatG1385’-acagctggcccgacarcgccagcttggacaa-3’(SEQ ID NO.15)5’-ttgtccaagctggcgytgtcgggccagctgt-3’(SEQ ID NO.16)KatG1485’-aggcgcgccggctgckgtggccggtcaagaa-3’(SEQ ID NO.17)5’-ttgtccaagctggcgytgtcgggccagctgt-3’(SEQ ID NO.18)KatG2705’-gatcgtcggcggtcasactttcggtaagacc-3’(SEQ ID NO.19)5’-ggtcttaccgaaagtstgaccgccgacgatc-3’(SEQ ID NO.20)KatG2755’-cacactttcggtaagmcccatggcgccggcc-3’(SEQ ID NO.21)5’-ggccggcgccatgggkcttaccgaaagtgtg-3’(SEQ ID NO.22)katG3155’-gtaaggacgcgatcaccmnmggcatcgaggtcgta-3’(SEQ ID NO.23)5’-tacgacctcgatgccknkggtgatcgcgtccttac-3’(SEQ ID NO.24)katG3215’-gcatcgaggtcgtakggacgaacaccccga-3’(SEQ ID NO.25)
5’-tcggggtgttcgtccmtacgacctcgatgc-3’(SEQ ID NO.26)katG3815’-cgatgctggccactgrcctctcgctgcgggt-3’(SEQ ID NO.27)5’-acccgcagcgagaggycagtggccagcatcg-3’(SEQ ID NO.28)KatG4635’-cttaagagccagatcskggcatcgggattgac-3’(SEQ ID NO.29)5’-gtcaatcccgatgccmsgatctggctcttaag-3’(SEQ ID NO.30)KatG6595’-ccggcagccgcgtggmcctggtcttcaggtc-3’(SEQ ID NO.31)5’-gacctgaagaccaggkccacgcggctgccgg-3’(SEQ ID NO.32)InhA-245’-ccgatttcggcccggcckcggcgagaygatagg-3’(SEQ ID NO.33)5’-cctatcrtctcgccgmggccgggccgaaatcgg-3’(SEQ ID NO.34)InhA-155’-ccggcckcggcgagaygataggttgtcggggtgac-3’(SEQ ID NO.35)5’-gtcaccccgacaacctatcrtctcgccgmggccgg-3’(SEQ ID NO.36)在上述序列中r代表a或g；m代表a或c；s代表g或c；k代表g或t；y代表c或t；v代表a或c或g；h代表a或c或t；d代表a或g或t；b代表g或c或t；n代表a或g或c或t。
在上述序列中，針對(duì)每一突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了正、反兩條序列，在使用時(shí)可選擇每一突變位點(diǎn)的任一個(gè)(正或反)序列中的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基的序列作為檢測(cè)探針固定于尼龍膜上。
在上述設(shè)計(jì)的各亞型序列的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行探針合成，并對(duì)其5’端或3’端進(jìn)行氨基標(biāo)記。優(yōu)選對(duì)探針進(jìn)行3’端氨基標(biāo)記，其相較5’端氨基標(biāo)記的探針，具有更好的雜交效果。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，制備芯片的方法為將尼龍膜經(jīng)EDAC(N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)預(yù)處理30分鐘后，激活表面負(fù)電荷基團(tuán)；同時(shí)，將在3’端帶有氨基標(biāo)記的探針用緩沖液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群?，按陣列順序點(diǎn)加于尼龍膜相應(yīng)位置上，此時(shí)，氨基與活化的負(fù)電荷基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而將探針固定在尼龍膜表面，最后，用0.1～0.5mol/L的NaOH處理尼龍膜，封閉未結(jié)合探針的表面負(fù)電荷基團(tuán)，膜芯片制作完成。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用于檢測(cè)樣本中結(jié)核桿菌耐藥性的檢測(cè)試劑至少包括用于擴(kuò)增樣本中結(jié)核桿菌基因的PCR引物以及上述本發(fā)明的基因芯片。本發(fā)明的PCR引物根據(jù)結(jié)核桿菌基因組的特點(diǎn)設(shè)計(jì)，通過(guò)PCR反應(yīng)可擴(kuò)增一種或幾種突變基因。在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)了如下引物序列rpoB-F5’-gacgtggaggcgatcacaccgcagacgttgatca-3’(SEQ ID NO.37)rpoB-R5’-gtagtccacctcagacgagggcacgtactccacct-3’(SEQ ID NO.38)rpo4-15’-aggggcccaacatcggtctgatcggctcgctgtcg-3’(SEQ ID NO.39)katG15’-gtgcccgagcaacacccacccattacagaa-3’(SEQ ID NO.40)katG25’-cgctgatcgtcggcggtcacactttcggtaag-3’(SEQ ID NO.41)katG35’-tgttgtcccatttcgtcggggtgttcgtcc-3’(SEQ ID NO.42)katG45’-ggccagccgcctttgctgctttctctatggcg-3’(SEQ ID NO.43)katG55’-tcagcgcacgtcgaacctgtcgaggttca-3’(SEQ ID NO.44)InhA-F5’-atccgtcatggtcgaagtgtgctgagtcacacc-3’(SEQ ID NO.45)InhA-R5’-ggtttcctccggtaaccaggactgaacgggat-3’(SEQ ID NO.46)KatG-CF5’-gtgcccgagcaacacccacccattacagaaa-3’(SEQ ID NO.47)KatG-CR5’-tcagcgcacgtcgaacctgtcgaggttcatcac-3’(SEQ ID NO.48)KatG-SP5’-tgtggccagccgcctttgctgctttctctatggcgg-3’(SEQ ID NO.49)在使用時(shí)，可以選擇上述給出序列中任意連續(xù)17-25個(gè)堿基序列作為合成的引物序列。上述本發(fā)明的引物可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行合成，可以使用混合引物。同時(shí)為便于結(jié)果檢測(cè)，可以在上述引物合成時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，使得合成的PCR產(chǎn)物的5’端帶有生物素標(biāo)記，以在后續(xù)的顯色反應(yīng)方便讀取結(jié)果。
本發(fā)明的探針和引物可以針對(duì)一個(gè)突變的基因進(jìn)行檢測(cè)，也可以組合使用檢測(cè)多個(gè)基因突變。例如，以SEQ ID NO.1～10所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.37～39所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測(cè)試劑，可用于針對(duì)rpoB基因突變，即利福平耐藥的結(jié)核桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.11～36所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.40～49所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測(cè)試劑，可用于針對(duì)katG基因突變，即異煙肼耐藥的結(jié)核桿菌的診斷試劑；較為優(yōu)選的實(shí)施方案為，以SEQ ID NO.1～39所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.37～49所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測(cè)試劑，可用于多種耐藥結(jié)核桿菌的檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)樣本中結(jié)核桿菌耐藥性的試劑盒，其至少包括本發(fā)明的上述檢測(cè)試劑，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包含下述試劑中的一種或幾種樣本處理試劑；PCR擴(kuò)增試劑；雜交試劑；以及顯色試劑。
上述樣本處理試劑、PCR擴(kuò)增試劑、雜交試劑以及顯色試劑均可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的在這些操作過(guò)程中需使用的各種試劑，這些試劑必要時(shí)可以包括在試劑盒中，也可以將其配方列明在試劑盒的說(shuō)明書中由使用者按照說(shuō)明書中的指示自行配制。
本發(fā)明的試劑盒中還可以包括相應(yīng)的陰性對(duì)照和/或陽(yáng)性對(duì)照樣本。
在本發(fā)明試劑盒的操作方法中，將標(biāo)記后的待測(cè)產(chǎn)物與固定在芯片上的探針進(jìn)行雜交，其雜交原理與普通核酸雜交相同。雜交溫度與探針和標(biāo)記后的待測(cè)樣品的長(zhǎng)度、GC含量、鹽濃度、甲酰胺等有關(guān)。優(yōu)選的是在本發(fā)明的試劑盒體系中58℃孵育2-4小時(shí)后可獲得滿意的雜交結(jié)果。
在本發(fā)明試劑盒的操作中，利用不同的洗脫條件，如溫度、鹽濃度等最大限度的去除非特異性雜交。標(biāo)記有過(guò)氧化物酶(POD)的鏈霉親和素(鏈霉抗生物素蛋白)與PCR產(chǎn)物5’端帶有的生物素特異結(jié)合，并與過(guò)氧化氫和棕色底物TMB(四甲基聯(lián)苯胺)的存在下發(fā)生化學(xué)顯色反應(yīng)，膜條相應(yīng)探針位置顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。經(jīng)閱讀儀閱讀后對(duì)信號(hào)與背景進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，有相應(yīng)的軟件系統(tǒng)分析獲得最終的雜交結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供一種評(píng)估待測(cè)樣本中結(jié)核桿菌耐藥性的方法。將來(lái)自待檢測(cè)個(gè)體的樣本使用本發(fā)明的檢測(cè)試劑檢測(cè)，通過(guò)樣本中結(jié)核桿菌各耐藥相關(guān)基因的表達(dá)情況評(píng)估該樣本中結(jié)核桿菌的耐藥情況及耐藥種類。
本發(fā)明構(gòu)建了針對(duì)耐藥結(jié)核桿菌的基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)臨床樣本中的耐藥結(jié)核桿菌的存在及耐藥類型，具有檢測(cè)周期短(整個(gè)過(guò)程只需1天)、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥和治療有重要的意義，可廣泛用于臨床藥敏試驗(yàn)。
通過(guò)目前臨床上常用的檢測(cè)方法與本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)的比較，可使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)更為明了



圖1為基因芯片的一般制作流程圖；圖2為檢測(cè)多種耐藥類型的結(jié)核桿菌耐藥基因芯片閱讀圖；
圖3為本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)的結(jié)核桿菌陽(yáng)性樣本的瓊脂糖凝膠電泳照片；圖4為檢測(cè)利福平耐藥的本發(fā)明結(jié)核桿菌耐藥基因芯片閱讀圖；圖5為3’氨基端標(biāo)記探針和5’端標(biāo)記探針的陽(yáng)性樣品雜交結(jié)果；圖中1--3’端氨基標(biāo)記探針雜交陽(yáng)性樣品；2--5’端氨基標(biāo)記探針雜交陽(yáng)性樣品；3--3’端氨基標(biāo)記探針雜交陰性樣品；4--5’端氨基標(biāo)記探針雜交陰性樣品；圖6為以不同堿基數(shù)的探針序列制膜后，樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與膜條的雜交結(jié)果。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
下面，結(jié)合附圖，通過(guò)對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述，詳細(xì)說(shuō)明但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1結(jié)核桿菌耐藥檢測(cè)芯片的制備1.生產(chǎn)原材料的廠商、規(guī)格

探針序列設(shè)計(jì)如SEQ ID 1～36所示，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成3’端氨基標(biāo)記探針。
2.生產(chǎn)膜條將膜條按要求裁剪↓新鮮配制EDAC溶液泡膜30分鐘↓用蒸餾水洗膜3-4次，2’/次，濾紙上晾干，將膜片固定在濾紙上↓用探針稀釋液將探針母液稀釋各探針的終濃度為5～15μM↓按照膜上的格子按順序每格點(diǎn)入1ul探針
↓點(diǎn)好的膜室溫放置20分鐘晾干↓
用0.1～0.5N NaOH浸泡膜條5分鐘↓棄去NaOH，用蒸餾水洗3-4次↓充分晾干后，裁成條狀，干燥瓶?jī)?nèi)保存?zhèn)溆?b>實(shí)施例2檢測(cè)多種耐藥型的結(jié)核桿菌耐藥芯片檢測(cè)試劑盒樣本檢測(cè)2003年7月～11月，分別在深圳東湖醫(yī)院和深圳市人民醫(yī)院進(jìn)行了臨床驗(yàn)證，結(jié)果證明，本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)通量大、靈敏度高，基因芯片技術(shù)的引入使得該方法具有與熒光定量PCR相當(dāng)?shù)撵`敏度。具體試劑、檢測(cè)方法如下試劑盒組成

其中TB PCR Mix I為按照SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.39序列設(shè)計(jì)的混合引物TB PCR MixII為按照SEQ ID NO.40～SEQ ID NO.49序列設(shè)計(jì)的混合引物●其他儀器及試劑PCR儀
DNA電泳儀分子雜交箱搖床生理鹽水3％H2O2配制或市場(chǎng)購(gòu)買下述溶液

●操作步驟1、臨床痰樣的處理方法1)收集病人痰樣，加入等量的化痰試劑(痰樣化解液+約0.5％NALC，現(xiàn)配當(dāng)天用)，化痰處理15～30分鐘。
2)痰樣消化液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入50mL無(wú)菌PBS，混勻。3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。倒凈上清液，再用移液器吸去殘余在離心管底附近的液體。
3)加入1mLPBS，混合懸浮樣品并轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管里，13000rpm離心5min，棄上清。
4)沉淀物加入1mL生理鹽水，混合懸浮樣品，13000rpm離心5min，棄上清。
5)加入50μL裂解液，打散沉淀塊，于沸水浴中煮沸10分鐘(注意離心管蓋可能會(huì)爆開，小心污染)。
6)短暫離心，上清液即可作為PCR模板。
2、PCR擴(kuò)增每個(gè)樣品各取一管15μL的TB PCR Mix I和TB PCR MixII，分別加入10μL樣品上清液作為PCR擴(kuò)增模板(若為菌株樣品只需加2μL模板并補(bǔ)加純水8μL)。
PCR擴(kuò)增程序?yàn)?3、雜交打開雜交箱，預(yù)熱至56℃。
取15mL塑料離心管，放入標(biāo)有樣本編號(hào)的膜條(應(yīng)在膜條的一角用鉛筆標(biāo)記)，加入A液4-6mL及相應(yīng)的兩管PCR產(chǎn)物，置于沸水浴中加熱10分鐘(確保雜交液面完全位于水浴液面之下)。
擰緊離心管蓋子，放入雜交箱于56℃雜交2小時(shí)至過(guò)夜。同時(shí)取50mL塑料管，加入40mL B液于雜交箱或水浴箱中預(yù)熱至56℃。
4、洗膜取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50mL管中，于56℃輕搖洗滌20分鐘(每管40mL溶液，最多可同時(shí)洗滌6張膜)
5、顯色用A液配制1∶2000的POD溶液(單做兩張膜只需3μLPOD母液，配制成6mL使用液，做四張膜可用5μLPOD母液，配制成10mL使用液)，室溫輕搖浸泡30分鐘，棄去POD溶液。用A液室溫輕搖洗兩次，每次5分鐘。用C液室溫洗膜1-2分鐘，同時(shí)配制顯色液(顯色液需新鮮配制，配法按順序加入以下成份19mL 0.1M檸檬酸鈉；1mL TMB 10μL 3％H2O2)。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色(每隔5-10分鐘觀察一次，直至肺結(jié)核陽(yáng)性樣品顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，此過(guò)程約需30分鐘至數(shù)小時(shí))。
6、結(jié)果判定參見圖2，膜條上的探針排列順序

注1.前11個(gè)位點(diǎn)(從N1到S531W)是rpoB基因相關(guān)位點(diǎn)，與利福平耐藥突變有關(guān)；315N、S315T、S315N是katG基因相關(guān)位點(diǎn)，最后4個(gè)位點(diǎn)(從-15N到-24M)是inhA基因相關(guān)位點(diǎn)，它們都與異煙肼耐藥突變有關(guān)。
2.516代表相關(guān)基因(這里是rpoB)上第516個(gè)氨基酸，其它位點(diǎn)類同；3.N代表該位點(diǎn)為野生型，M代表突變型；4.在rpoB基因相關(guān)位點(diǎn)中，N1探針覆蓋的位點(diǎn)有511和513及附近區(qū)域位點(diǎn)，即若正常位點(diǎn)中只有N1位點(diǎn)不顯色，則表明有511、513或附近區(qū)域位點(diǎn)發(fā)生了突變，其它位點(diǎn)類同；以下是幾個(gè)正常探針覆蓋到的位點(diǎn)及附近區(qū)域N1511、513；N2516；N3522、523；N4526、529；N5531、5335.突變位點(diǎn)的氨基酸變化D516VD→V，代表天冬氨酸突變成纈氨酸；
其它氨基酸含義H、組氨酸，Y、酪氨酸，L、亮氨酸，S、絲氨酸，T、蘇氨酸，N、天冬氨酸。
膜條顯色結(jié)果示例見圖2。
為判定檢測(cè)結(jié)果的可靠性，每次檢測(cè)務(wù)必設(shè)置陰性對(duì)照。
實(shí)施例3檢測(cè)利福平耐藥的結(jié)核桿菌耐藥芯片檢測(cè)試劑盒樣本檢測(cè)試劑盒組成

其中TB PCR Mix為按照SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.39的序列設(shè)計(jì)的混合引物。
其他試劑和儀器同實(shí)施例2。
●操作步驟1、臨床痰樣的處理方法同實(shí)施例22、PCR擴(kuò)增取10μL上清液作為PCR擴(kuò)增模板(若為菌株樣品只需加2μL模板并補(bǔ)加純水8μL)，加入到15μL的TB PCR Mix反應(yīng)液中。
PCR擴(kuò)增程序同實(shí)施例23、電泳檢測(cè)取5μL PCR產(chǎn)物加1μL6×上樣緩沖液，混和均勻后經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳15-20min后紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)核桿菌陽(yáng)性樣品應(yīng)能看到一約460bp的電泳帶。(見圖3)以下雜交、洗膜、顯色等步驟同實(shí)施例24、結(jié)果判定膜條上的探針排列順序

注1.516代表rpoB基因上第516個(gè)氨基酸，其它位點(diǎn)類同；2.S代表該位點(diǎn)為野生型，NC代表陰性對(duì)照；3.S1探針覆蓋的位點(diǎn)有511和513及附近區(qū)域位點(diǎn)，即若正常位點(diǎn)中只有S1位點(diǎn)不顯色，則表明有511、513或附近區(qū)域位點(diǎn)發(fā)生了突變，其它位點(diǎn)類同；以下是幾個(gè)正常探針覆蓋到的位點(diǎn)及附近區(qū)域S1511、513；S2516；S3522、523；S4526、529；S5531、5334.突變位點(diǎn)的氨基酸變化D516VD→V，代表天冬氨酸突變成纈氨酸；其它氨基酸含義H、組氨酸，Y、酪氨酸，L、亮氨酸，S、絲氨酸。
檢測(cè)結(jié)果見圖實(shí)施例43’端氨基標(biāo)記探針與5’端氨基標(biāo)記探針雜交效果比較雜交探針可以在寡核苷酸的3’端或5’端進(jìn)行氨基標(biāo)記，以下實(shí)驗(yàn)比較了3’端和5’端氨基標(biāo)記探針的雜交效果分別合成3’端氨基標(biāo)記和5’端氨基標(biāo)記的探針，以實(shí)施例1中的方法制備尼龍膜，分別以陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行雜交，結(jié)果見圖5，由圖5的結(jié)果可見，在同等條件下，3’端氨基標(biāo)記的效果要優(yōu)于5’端的標(biāo)記效果；3’端氨基標(biāo)記探針的雜交效果要優(yōu)于5’端氨基標(biāo)記，而且并沒有降低雜交的特異性。
實(shí)施例5不同堿基數(shù)的探針雜交效果比較在本發(fā)明中，對(duì)于SEQ ID NO.1～36中所示序列的探針實(shí)際使用時(shí)可以選擇任意連續(xù)17～25個(gè)堿基序列來(lái)合成探針，以下實(shí)驗(yàn)旨在證明上述堿基數(shù)的差異并不影響結(jié)果的靈敏度和特異性針對(duì)rpoB基因516位點(diǎn)序列合成以下不同長(zhǎng)度的突變及正常探針5’-ccaattcatggdccagaacaacccgctgtcgg-3’(SEQ ID NO.3)d＝a/g/tN2(S2)序列ASEQ ID NO.3的第4～23位堿基序列(共20個(gè)堿基)，即5’-attcatggaccagaacaacc-NH2-3’D516V序列BSEQ ID NO.3的第4～23位堿基序列(共20個(gè)堿基)，即5’-attcatggtccagaacaacc-NH2-3’N2(S2)序列CSEQ ID NO.3的第4～25位堿基序列(共22個(gè)堿基)，即5’-attcatggaccagaacaacccg-NH2-3’D516V序列DSEQ ID NO.3的第4～25位堿基序列(共22個(gè)堿基)，即5’-attcatggtccagaacaacccg-NH2-3’以上述序列合成的探針按照實(shí)施例1的方法制備膜條A和B，按照實(shí)施例1的方法以已知516位點(diǎn)正常及突變(D516V)的樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與膜條A、B雜交，正常及突變樣本互為陰性對(duì)照，結(jié)果見圖6，圖6中A-1、A-2中S2、D516V位置分別用序列A、B探針點(diǎn)膜B-1、B-2中S2、D516V位置分別用序列C、D探針點(diǎn)膜由圖6結(jié)果可見，不同長(zhǎng)度的探針均獲得了很好的雜交結(jié)果，因此證明不同堿基數(shù)的探針均有很好的靈敏度和特異性。
以上對(duì)本發(fā)明的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司<120>結(jié)核桿菌耐藥性基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)<130>SZ65-04P100149<160>49<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>y＝c/t；h＝a/c/t<400>1cggcaccagc cagcyagcch attcatggac c 31<210>2<211>31<212>DNA<213>Artificial<220>
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<222>(1)..(31)<223>d＝a/g/t<400>3ccaattcatg gdccagaaca acccgctgtc gg 32<210>4<211>32<212>DNA<213>Artificial<220>
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<400>6tgtgggtcaa ccmcracagc gggttgttct g31<210>7<211>33<212>DNA<213>Artificial<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400>36gtcaccccga caacctatcr tctcgccgmg gccgg 35<210>37<211>34<212>DNA<213>Artificial<400>37gacgtggagg cgatcacacc gcagacgttg atca 34<210>38<211>35<212>DNA<213>Artificial<400>38gtagtccacc tcagacgagg gcacgtactc cacct 35<210>39<211>35<212>DNA<213>Artificial<400>39aggggcccaa catcggtctg atcggctcgc tgtcg 35<210>40<211>30<212>DNA<213>Artificial<400>40gtgcccgagc aacacccacc cattacagaa 30<210>41<211>32<212>DNA<213>Artificial<400>41cgctgatcgt cggcggtcac actttcggta ag32<210>42<211>30
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1.用于檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥性的基因芯片，包括一基底，其特征在于它還包括固定于所述基底上的探針，所述探針為可分別與突變的結(jié)核桿菌rpoB基因、katG基因和/或InhA基因雜交的核酸。
2.權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述基底為尼龍膜，所述探針的3’末端進(jìn)行氨基標(biāo)記。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于所述探針包括選自下述核苷酸序列的幾種或全部SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQID NO.13或SEQ ID NO.14的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.15或SEQID NO.16的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ IDNO.23或SEQ ID NO.24的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.25或SEQ IDNO.26的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.30的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基和SEQ ID NO.35或SEQ IDNO.36的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基。
4.用于檢測(cè)樣本中結(jié)核桿菌耐藥性的檢測(cè)試劑，其特征在于它至少包括權(quán)利要求1所述的基因芯片；以及從待測(cè)樣本中擴(kuò)增結(jié)核桿菌各突變基因的PCR引物。
5.權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑，其特征在于所述基因芯片包括一基底以及固定于所述基底上的探針，所述探針為可分別與突變的結(jié)核桿菌rpoB基因、katG基因和/或InhA基因雜交的核酸；所述探針包括選自下述核苷酸序列的幾種或全部SEQ ID NO.1或SEQID NO.2的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQID NO.17或SEQ ID NO.18的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.19或SEQID NO.20的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ IDNO.27或SEQ ID NO.28的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.29或SEQ IDNO.30的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基和SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.36的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基。
6.權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑，其特征在于所述PCR引物包括選自下述核苷酸序列的幾種或全部SEQ ID NO.37的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ IDNO.38的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.39的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.40的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.41的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.42的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.43的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.44的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.45的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.46的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ IDNO.47的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基、SEQ ID NO.48的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基和SEQ ID NO.49的任意連續(xù)17～25個(gè)堿基。
7.權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑，其特征在于所述引物的末端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
8.一種用于檢測(cè)樣本中結(jié)核桿菌耐藥性的試劑盒，其特征在于它包括權(quán)利要求1所述的基因芯片；權(quán)利要求7所述的PCR引物；以及下述試劑的一種或幾種樣本處理試劑；PCR擴(kuò)增試劑；雜交試劑；和顯色試劑。
9.權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于它進(jìn)一步包含一陰性對(duì)照和/或陽(yáng)性對(duì)照樣本。
10.一種評(píng)估待測(cè)樣本結(jié)核桿菌耐藥的方法，其特征在于將待檢測(cè)樣本使用權(quán)利要求4所述檢測(cè)試劑檢測(cè)，通過(guò)樣本中結(jié)核桿菌各突變基因的表達(dá)情況評(píng)估該樣本中結(jié)核桿菌耐藥的可能性及耐藥類型。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)核桿菌耐藥基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，包括用于檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥性的基因芯片和從待測(cè)樣本中擴(kuò)增突變的耐藥基因的PCR引物，其中基因芯片包括一基底和固定于所述基底上的探針，所述探針為可分別與突變的結(jié)核桿菌rpoB基因、katG基因和/或InhA基因雜交的核酸。本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)，可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)臨床樣本中的結(jié)核桿菌耐藥性和耐藥類型，通量大、靈敏度高、特異性強(qiáng)，對(duì)于臨床診斷和治療有重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1712539SQ20041000923
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2004年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月21日
發(fā)明者張旭, 廖生赟, 向筑 申請(qǐng)人:亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司