專利名稱：一種水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa;Pht1;4的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa; Phtl ；4的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、轉(zhuǎn)基因糧食存在安全性問題植物轉(zhuǎn)基因是指把從動物、植物或微生物中分離到的目的基因，通過各種方法轉(zhuǎn) 移到植物基因組中，使之穩(wěn)定遺傳并賦予植物新的遺傳性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu) 質(zhì)等。但是對于轉(zhuǎn)基因糧食的安全性在全球一直存在激烈分歧。在我國更是如此，特別是 自去年11月農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)兩種轉(zhuǎn)基因水稻的安全證書以來，就轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè) 化問題的質(zhì)疑就沒有間斷過?？傊侥壳盀橹罐D(zhuǎn)基因安全性問題并沒有解決。2、培育籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份可放心食用的轉(zhuǎn)基因作物具有重要意義轉(zhuǎn)基因安全性問題包括食用安全和環(huán)境安全兩大方面，人們更關(guān)心的是食用安 全。在這方面各個國家還是比較“謹(jǐn)慎”的，例如，種植比較多的轉(zhuǎn)基因玉米和大豆在美國 主要是用于飼料、生物燃料、食品工業(yè)等，美國人直接食用的比例非常小。目前，轉(zhuǎn)基因育種基本都是利用強(qiáng)啟動子35S或WDiqitin啟動功能基因，這樣使 得植物各個組織器官組成型表達(dá)，其中也包括食用部分。在這種情況下，培育出食用部分， 如籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份將會消除人們對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種種顧慮，放心食用。水稻是全世界一半以上人口的主食，顯而易見培育大米中沒有轉(zhuǎn)基因成份可放心 食用的轉(zhuǎn)基因水稻具有重要意義。3、提高作物磷利用效率迫在眉睫磷素是作物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一，也是作物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合 物的組成成份。然而，一方面土壤中有效磷的濃度只有1-10 μ M，再加上植物對有效磷的吸 收利用效率的限制，已遠(yuǎn)不能滿足植物生長發(fā)育對磷的需要；另一方面大量使用磷肥已經(jīng) 造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。經(jīng)過十幾年的研究，人們發(fā)現(xiàn)植物基因組中存在的高親合力Witl家族磷酸鹽轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白擔(dān)負(fù)著低磷條件下根系吸磷重任。水稻中有多個磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其中本申請 ORYsa ；Phtl ；4是高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsWitl家族中的一個重要成員。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對轉(zhuǎn)基因植物安全性的問題，提供水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 ORYsa ；Phtl ；4在開發(fā)水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份、可放心食用的轉(zhuǎn)基因水稻品種中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4在提高土壤中 有效磷利用效率方面的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4在開發(fā)水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份、可 放心食用的轉(zhuǎn)基因水稻品種中的應(yīng)用。其中，所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4的核苷酸序列登錄號為 AF536964，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4編碼區(qū)擴(kuò)增的特異上下游引物序 列分別為:SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4啟動子區(qū)域擴(kuò)增的特異上下游引 物序列分別為SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6。水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4在提高土壤中有效磷利用效率方面的應(yīng)用。其中，所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4的核苷酸序列登錄號為 AF536964，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0. 2。所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4編碼區(qū)擴(kuò)增的特異上下游引物序 列分別為:SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4啟動子區(qū)域擴(kuò)增的特異上下游引 物序列分別為SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6。水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4在開發(fā)水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份同時 提高土壤中有效磷利用效率的水稻品種中的應(yīng)用。有益效果1、本發(fā)明通過大量的實(shí)驗研究，發(fā)現(xiàn)ORYsa ；Phtl ；4具有在根部特異表達(dá)這一特 點(diǎn)。基于這一發(fā)現(xiàn)，用其本身啟動子超表達(dá)該基因，這樣獲得的轉(zhuǎn)基因水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基 因成份、磷素利用效率也大大提高，為培育安全、放心食用、高磷素利用效率的水稻品種提 供新思路。2、ORYsa ；Phtl ；4具有根部特異表達(dá)特性，其轉(zhuǎn)基因水稻中只有根部具有轉(zhuǎn)基因 成份，為開發(fā)水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份可放心食用的轉(zhuǎn)基因水稻提供保障。3,ORYsa ；Phtl ；4基因啟動子+編碼區(qū)的轉(zhuǎn)基因水稻植株根長度顯著增加，表明轉(zhuǎn) 基因水稻磷吸收效率顯著增強(qiáng)，適于貧瘠土壤條件下種植。4、本發(fā)明首次提供了水稻ORYsa ；Phtl ；4蛋白的磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能，異源表達(dá) 系統(tǒng)研究表明ORYsa ；Phtl ；4為雙親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。5、本發(fā)明首次提供了水稻根部特異表達(dá)的基因ORYsa ；Phtl ；4的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 的工程應(yīng)用。ORYsa ；Phtl ；4基因所編碼的蛋白質(zhì)對磷雙親合力，將其作為目的基因?qū)胫?物，有望應(yīng)用于單子葉植物的遺傳改良。6、本發(fā)明提供的ORYsa ；Phtl ；4基因的編碼區(qū)及其啟動子來自水稻，其基因工程 受體植物除了雙子葉植物，如大豆、棉花、煙草等之外更加適合于水稻、玉米、小麥等單子葉 植物。


圖1兩種磷處理條件下ORYsa ；Phtl ；4在水稻不同部位(根，葉片)表達(dá)特征。示 ORYsa ；Phtl ；4根部特異表達(dá)。
圖20RYsa ；Phtl ；4本身啟動子+ORYsa ；Phtl ；4編碼區(qū)+GUS轉(zhuǎn)基因植株的組織染 色。示ORYsa ；Phtl ；4根部特異表達(dá)。左上四圖為在低磷(-P)和正常供磷(+P)條件下根尖的組織染色結(jié)果；右上四圖 為在低磷(-P)和正常供磷(+P)條件下支根發(fā)生區(qū)的組織染色結(jié)果；左下四圖為在低磷 (-P)和正常供磷(+P)條件下根莖結(jié)合部的組織染色結(jié)果；右下四圖為在低磷(-P)和正常 供磷(+P)條件下葉片的組織染色結(jié)果。圖3 轉(zhuǎn)基因株系在正常供磷條件下的磷含量4-T-6表示獲得的轉(zhuǎn)基因ORYsa ；Phtl ；4株系6 ；4-T-7表示獲得的轉(zhuǎn)基因ORYsa ； Phtl ；4株系7 ;WT表示日本晴野生型。圖4 酵母異源表達(dá)ORYsa ；Phtl ；4蛋白的功能驗證，A 酸性磷酸酶強(qiáng)度檢測ORYsa ；Phtl ；4基因?qū)θ笔?nèi)源高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的酵 母突變體MB192磷素吸收功能的互補(bǔ)，其中a 磷含量為20 μ M的YNB培養(yǎng)基；b 磷含量為 40 μ M的YNB培養(yǎng)基；c 磷含量為60 μ M的YNB培養(yǎng)基；d 磷含量為100 μ M的YNB培養(yǎng)基； B 用同位素33Ρ測定酵母Ypll2-0RYsa ；Phtl ；4對磷素吸收的速率(pH 6. 0)。圖5 雙元植物表達(dá)載體pSlaG-3圖譜。圖6 酵母異源表達(dá)載體P112A1NE圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.(基因)序列的獲得1、ORYsa ；Phtl ；4基因編碼區(qū)序列的獲得申請人:在NCBI網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. gov)上輸入0sPT4得到序列號為 AF536964的一段編碼水稻高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的DNA序列。根據(jù)植物分子生物學(xué)國際植 物基因命名法委員會，Commission for Plant Gene Nomenclature of the International Society for PlantMolecular Biology)的要求，我們將該DNA序列命名為ORYsa ;Phtl ；4。 分析表明該基因全長編碼區(qū)(即開放閱讀框，0RF)序列為SEQ ID N0. 1，總長1617bp，編碼 539個氨基酸。該基因沒有內(nèi)含子。2、ORYsa ；Phtl ；4基因啟動子序列的獲得根據(jù)獲得的ORYsa ；Phtl ；4 編碼區(qū)序列，在 NCBI 網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. gov)上 查找并獲得其啟動子區(qū)序列(SEQ ID N0. 7)。實(shí)施例2.利用RT-PCR鑒定水稻ORYsa ；Phtl ；4基因的時空表達(dá)模式1、總RNA的提取選用水稻品種“日本晴”，待水稻幼苗長至10天后，進(jìn)行正常供磷(300μΜ KH2PO4) 和低磷(10 μ M KH2PO4)處理，3周后采集葉片和根部，分別采用TriZol試劑抽提總RNA，用 甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。2、ORYsa ；Phtl ；4基因的時空表達(dá)模式鑒定根據(jù)水稻ORYsa ；Phtl ；4基因的編碼序列，設(shè)計以下ORYsa ；Phtl ；4基因特異引物 Ρ1、Ρ2擴(kuò)增長度為772bp片度鑒定ORYsa ；Phtl ；4基因的時空表達(dá)模式。Pl ATCGTGGAGGAGCAGGAGAAGG(SEQ ID N0. 10)P2 CATCGTCATCGTCCTCGTTCTC(SEQ ID NO. 11)
具體步驟為以步驟1獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25μ 1 :PCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP Mix 2 μ 1，正向和反向引物(PI、 P2)各1 μ 1，模板1 μ 1，DNA聚合酶0. 5 μ 1，雙蒸水17 μ 1 ；PCR程序如下94°C預(yù)變性4分 鐘，94°C變性30s，56°C復(fù)性lmin，72°C延伸1. 5min，33個循環(huán)后，72°C 5min。PCR產(chǎn)物凝膠 電泳鑒定ORYsa ；Phtl ；4基因的時空表達(dá)模式，結(jié)果見圖1。委托上海生工公司測序確定序 列為 ORYsa ；Phtl ；4 片段。有圖1可以看出，ORYsa ；Phtl ；4基因在低磷與供磷處理條件下，根部表達(dá)強(qiáng)烈，且 不受磷素營養(yǎng)調(diào)節(jié)。而葉片中沒有表達(dá)，說明ORYsa ；Phtl ；4基因在根部特異表達(dá)。實(shí)施例3.利用ORYsa ；Phtl ；4啟動子+編碼區(qū)+GUS轉(zhuǎn)基因水稻植株研究ORYsa ； Phtl ；4的應(yīng)用前景本發(fā)明利用ORYsa ；Phtl ；4本身啟動子序列啟動該基因編碼區(qū)序列。1、ORYsa ；Phtl ；4完整編碼區(qū)序列的克隆選用水稻品種“日本晴”，待水稻幼苗長至10天后，進(jìn)行正常供磷(300μΜ KH2PO4) 和低磷(10 μ M KH2PO4)處理，3周后取材(根尖、支根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部及葉片)，分別采 用TriZol試劑抽提總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定 RNA含量。根據(jù)水稻ORYsa ；Phtl ；4基因的全長編碼序列，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引 物，并在上游和下游引物(SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))(ho I。以獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，用高保真Tag酶進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR反應(yīng)體系為25 μ 1 =PCR Buffer 2. 5 μ 1，dNTP Mix 2 μ 1，上游和下游引物各1 μ 1， 模板1 μ 1，DNA聚合酶0. 5 μ 1，雙蒸水17 μ 1 ；PCR程序如下94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性 30s，56°C復(fù)性lmin，72°C延伸1. 5min，33個循環(huán)后，72°C 5min。PCR產(chǎn)物克隆至克隆載體 PUC18。委托上海生工公司測序確定獲得序列為水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa ；Phtl ；4的 完整編碼區(qū)序列。2、ORYsa ；Phtl ；4啟動子序列的克隆選用水稻品種“日本晴”，發(fā)芽后在正常供磷條件下生長，3周后抽提總DNA用于 ORYsa ；Phtl ；4啟動子序列的克隆。根據(jù)獲得的ORYsa ；Phtl ；4啟動子區(qū)序列(SEQ ID NO. 7)，設(shè)計帶有Asc I和Pac I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 5，下游引物序列 為 SEQ IDN0. 6。取Iyl以上獲得的總DNA(約50ng)為模板，在25 μ L體系中進(jìn)行目的序列的擴(kuò) 增，所用PCR反應(yīng)體系同上；擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，然后以94°C變性45s，55°C復(fù) 性45s，72°C延伸2. 5min，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。通過凝膠電泳回收擴(kuò)增 片段，與PUC18中間載體連接，委托上海生工公司測序確定獲得水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 ORYsa ；Phtl ;4 啟動子 DNA 序列。3、ORYsa ；Phtl ；4植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化植物雙元表達(dá)載體pSlaG-3，其中含有報告基因β-葡糖醛酸糖苷酶 GUS(β -Iucuronidase, β-GUS)其圖譜見圖 5。
(1)編碼區(qū)克隆至pSlaG-3 用限制性內(nèi)切酶BioI分別切開以上克隆在pUC18T載 體上的ORYsa ；Phtl ；4編碼區(qū)序列和表達(dá)載體pSlaG_3，回收后利用T-4連接酶將ORYsa ； Witl ;4基因編碼區(qū)克隆到雙元表達(dá)載體pSlaG-3。酶切鑒定表達(dá)載體準(zhǔn)確無誤。注表達(dá) 載體pSlaG-3中含有報告基因β -葡糖醛酸糖苷酶⑶S。(2)基因本身啟動子序列克隆至已含有編碼區(qū)的pSlaG-3 以上克隆在pUC18T載 體上的ORYsa ;Phtl ;4啟動子片段，用稀有限制性內(nèi)切酶Asc I和I^c I雙酶切下。電泳 回收后，與同樣用Asc I和I^c I雙酶切的以上含有目的基因編碼區(qū)序列的pSlaG-3載體 (含有⑶S報告基因)連接。然后轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105(上海invitrigen公司)中。(3)采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻日本晴品種。誘導(dǎo)水稻 成熟胚愈傷。將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5分鐘(愈傷 量沒過50ml離心管錐形部位即可，不停的搖動)；將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上浙干 30-40分鐘；愈傷組織置于共培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2. 5天。然后愈傷轉(zhuǎn)入含250mg/L羧芐 青霉素(Car)和50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。挑取顏色鮮黃的抗性愈傷移入 裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或分化罐中，放入恒溫培養(yǎng)室分化成苗。再放入生根培養(yǎng)基中壯 苗一到兩周。4、獲得轉(zhuǎn)基因水稻材料的鑒定(1)利用報告基因檢測ORYsa ；Phtl ；4基因的時空表達(dá)譜⑶S染色檢測將染色的組織放入含有⑶S染液的1.5ml離心管中，37°C過夜， 顯現(xiàn)藍(lán)色的樣品為陽性植株，沒有顏色的為假陽性苗。圖2為ORYsa ;Phtl ；4本身啟動子 +ORYsa ；Phtl ；4編碼區(qū)+GUS轉(zhuǎn)基因水稻植株的組織染色結(jié)果。結(jié)果(圖2)顯示，在正常 供磷(300 μ M)或低磷(10 μ Μ)兩種磷處理條件下，生長21天的轉(zhuǎn)基因苗中β-葡糖醛酸 糖苷酶⑶S表達(dá)的部位不同。與陽性對照(Ubi-GUS)相比，ORYsa ；Phtl ；4(0sPT4)無論在 低磷(10 μ M)還是在正常供磷(300 μ Μ)條件下只在根部表達(dá)，而在根莖連接部及葉片中沒 有表達(dá)，這與RT-PCR結(jié)果相吻合(圖1)。(2)轉(zhuǎn)基因植株磷素的利用效率分別取水稻地下部(根部)和地上部作為植株樣品，用鉬銻抗比色法測定植株樣 品(處理同上)中磷含量。105°C殺青30min，7(TC烘箱中烘烤兩天，磨碎。稱取約0. Ig植 株干樣，用濃KSO4-H2A混合消煮。冷卻定容后，用鉬銻抗比色法，在722紫外-可見分光光 度計700nm處比色測定(鮑士旦，2000)。結(jié)果(圖3)表明，該轉(zhuǎn)基因材料培養(yǎng)生長三周后 其吸磷總量地下部(根部)全磷量增加33. 43%，地上部增加40. 80%，大大提高了磷素的 利用效率。綜上所述，本發(fā)明人提供的ORYsa ；Phtl ；4的工程應(yīng)用為水稻中首次報道。實(shí)驗發(fā) 現(xiàn)該基因蛋白在水稻中只在根部表達(dá)，而在其他部位不表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株還大大提高了水 稻磷吸收能力。由此可見，ORYsa ;Phtl ；4本身啟動子+0RYsa;Phtl ；4編碼區(qū)導(dǎo)入植物，可 獲得根部特異表達(dá)、水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份可放心食用的、磷利用效率大大提高的轉(zhuǎn) 基因材料。實(shí)施例4.酵母異源系統(tǒng)鑒定水稻ORYsa ；Phtl ；4功能1、構(gòu)建酵母異源表達(dá)載體酵母突變體菌株MB192、酵母表達(dá)載體ρ112Α1ΝΕ (均見明鳳等.水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆、表達(dá)及功能分析.中國科學(xué)C輯，2006，36 :385-389)。以cDNA為模板(實(shí) 施例3步驟1)，以含有Eco R I，BamH I酶切位點(diǎn)引物(上游引物序列為SEQ ID NO. 8，下 游引物序列為SEQ IDN0. 9)擴(kuò)增ORYsa ；Phtl ；4編碼區(qū)后，與表達(dá)載體ρ112Α1ΝΕ載體(圖 6)連接，構(gòu)建酵母表達(dá)重組載體pll2AlNE-0RYsa ；Phtl ；4。ρ112Α1ΝΕ載體包含氨基酸選擇 標(biāo)記。2、酵母的轉(zhuǎn)化挑取酵母突變體MB192單克隆于YEPD液體培養(yǎng)基中，于30°C下，250r/min培養(yǎng)至 OD600約為1. 0-1. 3時，收集細(xì)胞沉淀，等量體積預(yù)冷的無菌水重新懸浮、離心；1/2體積的預(yù) 冷的無菌水懸浮離心；最后懸浮于1/25體積的預(yù)冷的lmol/L的山梨醇中。為了獲得好的 轉(zhuǎn)化效果，加入25mmol/L的二硫蘇糖醇在室溫下處理lOmin，再用適量的lmol/L的山梨醇 洗滌酵母細(xì)胞，最終懸浮于1/200體積的預(yù)冷的山梨醇溶液中。取5μ L酵母重組表達(dá)載 體pll2AlNE-0RYsa ；Phtl ；4加入到50 μ L感受態(tài)酵母懸浮液中，混勻，迅速轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)化 杯中，以1. 5kV，200 Ω, 25 μ F進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。加入ImLYEPD液體培養(yǎng)基溫育Ih,重新用Imol/ L的山梨醇懸浮，平鋪于YNB平板上，轉(zhuǎn)化后的酵母稱為酵母轉(zhuǎn)化子Ypll2-0RYsa ；Phtl ；4 ； 含有PH084基因的陽性對照為野生型酵母(見明鳳等.水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆、 表達(dá)及功能分析.中國科學(xué)C輯，2006，36 :385-389)；陰性對照為突變株MB192。3、酵母互補(bǔ)實(shí)驗將陽性對照野生型酵母、酵母轉(zhuǎn)化子Ypll2-0RYsa ；Phtl ；4以及陰性對照磷轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白基因突變體MB192培養(yǎng)于YNB固體培養(yǎng)基(不含磷素)上，挑取單菌落接種于液體不 含磷素的YNB培養(yǎng)基中，使其0D600為1. 0。取2ml培養(yǎng)物經(jīng)3%葡萄糖溶液洗滌后分別接 種于含有不同磷素濃度(20 μ Μ、40 μ Μ、60 μ Μ、100 μ Μ)的YNB培養(yǎng)基中(試管)，在30°C恒 溫箱中培養(yǎng)使其0D600為1. 0，然后加入2滴溴甲酚紫作為指示劑，觀察不同磷濃度的培養(yǎng) 中顏色的變化，指示劑顏色的變化能夠反應(yīng)培養(yǎng)基的酸化程度，顏色為黃色為正常生長，顏 色越深(紅或黑)表明酵母的生長狀態(tài)不好。結(jié)果顯示突變體MB192細(xì)胞只有在Pi濃度 100 μ M生長良好，具有酸性反應(yīng)；而在20 μ Μ、40 μ M和60 μ M細(xì)胞生長顯著受抑，無酸性反 應(yīng)。而含有pll2-0RYsa ；Phtl ；4的細(xì)胞可以在Pi為60 μ M及以上的培養(yǎng)基上生長良好，并 具有酸性反應(yīng)(圖4)。根據(jù)功能互補(bǔ)實(shí)驗，得出結(jié)論是ORYsa ；Phtl ；4所編碼蛋白介導(dǎo)了 酵母細(xì)胞膜的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)。4、酵母生長過程中磷吸收量的測定采用同位素標(biāo)記的方法測定酵母轉(zhuǎn)化子Ypll2-0RYsa ；Phtl ；4和突變株MB192 對磷素的吸收速率實(shí)驗，方法參照P.Martinez and Persson(Martinez P, Persson B L.Identification, cloning and characterization of a derepressible Na+-coupled phosphate transporter inSaccharomyces cerevisiae.Mol Gen Genet,1998,258 628-638)。并通過SigmaPlotlO.O計算發(fā)現(xiàn)該磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Km為189 μ M，最大吸收速率 為 0. 91noml Pi (mg yeast cells · min廣1 (圖 4)。由此我們認(rèn)為 ORYsa ;Phtl ;4 為雙親和 磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體，這與報告基因GUS的鑒定結(jié)果(圖2) —致。為了簡單起見，本發(fā)明中ORYsa ；Phtl ；4有時標(biāo)注為0sPT4。
權(quán)利要求
1.水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa；Phtl ；4在開發(fā)水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份、可放 心食用的轉(zhuǎn)基因水稻品種中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa； Phtl ；4的核苷酸序列登錄號為AF536964，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa； Phtl ；4編碼區(qū)擴(kuò)增的特異上、下游引物序列分別為=SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa； Phtl ；4啟動子區(qū)域擴(kuò)增的特異上、下游引物序列分別為=SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6。
5.水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa;Phtl ；4在提高土壤中有效磷利用效率方面的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa； Phtl ；4的核苷酸序列登錄號為AF536964，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0. 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa； Phtl ；4編碼區(qū)擴(kuò)增的特異上下游引物序列分別為=SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa； Phtl ；4啟動子區(qū)域擴(kuò)增的特異上下游引物序列分別為=SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6。
9.水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa；Phtl ；4在開發(fā)水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份同時提 高土壤中有效磷利用效率的水稻品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa；Pht1；4的應(yīng)用。水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ORYsa；Pht1；4根部特異表達(dá)，為水稻中第一次發(fā)現(xiàn)的根部特異表達(dá)基因。該基因可在開發(fā)水稻籽粒中沒有轉(zhuǎn)基因成份放心食用同時提高土壤中有效磷利用效率的水稻品種中應(yīng)用。
文檔編號C12N15/82GK102115754SQ20101059199
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者吳娜, 孫淑斌, 徐國華, 范曉榮 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)