專利名稱：一種病毒樣顆粒手足口病疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒樣顆粒手足口病疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFffl))是亞太地區(qū)近年出現(xiàn)的一種兒童傳染病，又名發(fā)疹性水泡性口腔炎，以手、腳和口腔粘膜疤疹或破潰成潰瘍?yōu)橹饕R床特征，其病原體是幾種腸道病毒。1957年，本病最先被報(bào)告流行在1957年的新西蘭，第二年分離出柯薩奇病毒， 1959年提出HFMD的命名。此后有多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都報(bào)告HFMD的發(fā)生和流行，如美國(guó)、英國(guó)、澳大利亞、日本、新加坡、匈牙利、保加利亞等。在中國(guó)大陸，1981年上海首先報(bào)道手足口病的發(fā)生，其后，個(gè)別城市也曾發(fā)現(xiàn)并報(bào)告該病的局部流行；1983年和1986年天津出現(xiàn)了兩次大規(guī)模的爆發(fā)流行，主要的病原體為柯薩奇A組16型病毒。2007年以來(lái)，手足口病在中國(guó)大陸大爆發(fā)，引起200多萬(wàn)兒童感染， 500多人死亡。自2009年起至今，新一輪爆發(fā)一直在中國(guó)大陸蔓延。手足口病的病原體包括數(shù)種腸道病毒屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬成員，常見的病毒型別是柯薩奇A組16型(Coxsakie A16，CoxA16)和腸道病毒71型(enterovirus71， EV71)。此外，柯薩奇A組2、4、5、7、9、10型以及B組1_5型等型別病毒所致的HFMD也時(shí)有報(bào)道。這些病毒可交替或同時(shí)出現(xiàn)，所以在一次流行中可發(fā)現(xiàn)有兩種或兩種以上病原同時(shí)存在的現(xiàn)象。感染EV71和C0X.A16所引起的臨床癥狀難于區(qū)別。感染EV71常常并發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥，包括病毒性腦膜炎，腦炎，以及類似小兒麻痹的癱瘓，引起的肺水腫、肺出血經(jīng)常導(dǎo)致嬰幼兒的快速死亡。Cox A16是引起心肌炎、心包炎、心肌病及其它嚴(yán)重疾病的重要病原。手足口病從感染到出現(xiàn)癥狀通常為3-6天。病人常在口中出現(xiàn)瘡，手掌、腳底出現(xiàn)皮膚紅疹。有些病例，主要是小于3歲的嬰幼兒，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，短期發(fā)燒后突然惡化，并快速死亡。在流行中觀察到，C0XA16和EV71引起的流行不同，CoxA16引起的流行可發(fā)生在四季，流行季節(jié)長(zhǎng)，春末夏初出現(xiàn)高峰，而EV71流行時(shí)則集中在夏季，CoxAie多在嬰幼兒中流行，而EV71還會(huì)流行于較大兒童或成人，且所致臨床經(jīng)過(guò)較重，常有中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥， 如腦膜炎、腦炎等，而CoxAie所致癥狀典型，且并發(fā)癥少，預(yù)后良好。EV71病毒顆粒呈球形，無(wú)包膜和突起，衣殼為正20面體對(duì)稱，直徑大約在Mnm 30nm,由60個(gè)相同的亞單位構(gòu)成，每個(gè)亞單位均包含VPl VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白拼裝成五聚體樣結(jié)構(gòu)，其中VP4包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接，VPl VP3暴露在病毒顆粒表面，因而抗原決定簇基本上位于VPl VP3上。目前尚無(wú)有效的疫苗或藥物可防治手足口病。病毒樣顆粒(VLP)是由病毒衣殼蛋白組成的不含病毒核酸的病毒粒子空殼。由于VLP表面的病毒抗原和多肽表位與真正的病毒幾乎沒(méi)有區(qū)別，因此能引起強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且不具有潛在的副作用，是目前認(rèn)為最有潛力的疫苗研究方向。乙肝病毒VLP疫苗 (Recombivax HB，Merck)和乳頭瘤病毒 VLP 疫苗(Gardisi 1，Merck)已經(jīng)上市。YPD液體培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基。其具體組成可為酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，其余為水；各百分含量均為質(zhì)量百分含量。若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于制備病毒樣顆粒的重組酵母菌。本發(fā)明所提供的用于制備病毒樣顆粒的重組酵母菌，按照包括如下步驟的方法制備得到將構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)酵母菌，得到重組酵母菌。上述重組酵母菌中，所述編碼基因是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)酵母菌中的；所述重組表達(dá)載體按照如下方法得到將所述編碼基因插入酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到所述重組表達(dá)載體。上述任一所述重組酵母菌中，所述酵母表達(dá)載體為pGAPh-A。上述任一所述重組酵母菌中，所述出發(fā)酵母菌為SMDl 168。上述任一所述重組酵母菌中，所述病毒樣顆粒為引起手足口病的病毒的病毒樣顆粒。上述任一所述重組酵母菌中，所述引起手足口病的病毒為EV71 ；所述構(gòu)建EV71病毒的病毒樣顆粒所需的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO :1和SEQ ID NO 3所示；所述重組表達(dá)載體為如下1)和2)所示1)所述重組表達(dá)載體按照如下方法得到將所述SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因插入所述酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到的重組表達(dá)載體；2)所述重組表達(dá)載體按照如下方法得到將所述SEQ ID NO :3所示蛋白的編碼基因插入所述酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到的重組表達(dá)載體；上述任一所述重組酵母菌中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；所述SEQ ID NO 3所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備病毒樣顆粒的方法。本發(fā)明所提供的制備病毒樣顆粒的方法，包括如下步驟培養(yǎng)上述任一所述重組酵母菌，所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因在所述重組酵母菌中表達(dá)，得到所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白進(jìn)行自組裝，得到病毒樣顆粒。上述制備方法中，所述培養(yǎng)的溫度為27°C -33°C，具體為27°C、30°C或33°C。上述任一所述制備方法中，所述培養(yǎng)的pH值為4. 5-5. 5，具體為4. 5或5. 0或 5. 5 ；上述任一所述制備方法中，所述溶氧為50% -70%，具體為50%或60%或70% ；上述任一所述制備方法中，所述培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基按照如下方法配制將 YPD液體培養(yǎng)基和博萊霉素混合，得到所述培養(yǎng)基；YPD液體培養(yǎng)基和博萊霉素的配比為 Iml (100μ g_500y g)，具體為 Iml 100 μ g 或 Iml 200 μ g 或 Iml 500 μ g。由上述任一所述方法制備得到的病毒樣顆粒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種手足口病疫苗。本發(fā)明所提供的手足口病疫苗，其活性成分為上述任一所述病毒樣顆粒。上述疫苗中包括佐劑。上述疫苗中，所述病毒樣顆粒和佐劑的配比為0. OOlg 0. 5g-0. 005g 0. 25g，具體為 0. OOlg 0.5g、0.003g 0.15g 或 0.005g 0. 25g ；上述疫苗中，所述佐劑為AL(OH)3佐劑。上述任一所述病毒樣顆粒在制備手足口病疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中包括佐劑。上述應(yīng)用中，所述病毒樣顆粒和佐劑的配比為0. OOlg 0. 5g-0. 005g 0. 25g，具體為 0. OOlg 0.5g、0.003g 0.15g 或 0.005g 0. 25g ；上述應(yīng)用中，所述佐劑為AL (OH) 3佐劑。本發(fā)明的制備病毒樣顆粒的方法，能夠制備出具有免疫功能的病毒樣顆粒，將其作為疫苗可獲得高效價(jià)的血清，且本發(fā)明方法所需條件簡(jiǎn)單、操作容易、成本低。因此本發(fā)明方法在疫苗的制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為重組病毒基因在原核生物載體鑒定示意圖。圖2為重組病毒基因在真核生物載體的構(gòu)建示意圖。圖3為重組病毒融合于真核表達(dá)系統(tǒng)的鑒定示意圖。圖4為為工程菌表達(dá)的VLP電鏡照片鑒定表達(dá)結(jié)果。圖 5 為 westenbolting 鑒定圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。病毒EV71的毒株⑶FS-3/⑶/CHN/2008在文獻(xiàn)“張欣鄧小玲管大偉鄭煥英，2008年廣東省腸道病毒71型分離株全基因組核苷酸序列分析.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志.2009 年4期”中公開過(guò)，公眾可從顧睞博(北京)科技有限公司獲得。人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞RD細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，)，產(chǎn)品目錄號(hào)為TCHu45。重組禽類成髓纖維病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物。內(nèi)切酶 PmlI、SacII、EcoRI、XbaI、BspHI 均購(gòu)自 NEB 公司。pGAPZa-A 質(zhì)粒購(gòu)自 Invitrogen 公司。
SMDl 168感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自hvitrogen公司。實(shí)施例1、制備病毒樣顆粒VLP的方法以腸道病毒71型(EV71)病毒的VLP為例，說(shuō)明本發(fā)明方法的具體構(gòu)思及步驟。一、制備重組酵母菌
構(gòu)建流程如圖2.UPl基因，3⑶基因克隆及重組載體的構(gòu)建以病毒EV71的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，用如下引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到Pl基因和3⑶基因。P 1-上游引物(Pml I) 5，-TATCTACACGTGATGGGTTCGCAGGTG-3，；P 1-下游引物(&icll)5，-TATCGTCCGCGGTAAAGAGTAGTGA-3，；3CD-上游引物(EcoRI) 5，-AGCAGAATTCATGGCCCGAGTCTT-3，；3CD-下游引物(XbaI) 5，-GCCGTCTAGATAAAATAACTCGAGCCAAT-3，Pl基因重組載體構(gòu)建將Pl基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用RiilI和SacII進(jìn)行酶切，回收目的Pl基因產(chǎn)物；用PmlI和McII酶切PGAPh-A質(zhì)粒，回收載體大片段；將目的Pl基因產(chǎn)物和載體大片段連接，得到重組載體Pl-pGAPZa-A。3⑶基因重組載體構(gòu)建將3⑶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRI和)(baI進(jìn)行酶切，回收目的3⑶基因產(chǎn)物；用EcoRI和^CbaI酶切pGAPh-A質(zhì)粒，回收載體大片段；將目的3⑶ 基因產(chǎn)物和載體大片段連接，得到重組載體3⑶-pGAPh-A。自連對(duì)照載體用SacII和RiilI酶切pGAPZ α Α,回收載體大片段，將回收的載體大片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物即為自連對(duì)照載體。將上述三種重組載體分別轉(zhuǎn)化Dffia感受態(tài)細(xì)胞，用抗生素kocin+LB (25 μ g/ml) 平板篩選陽(yáng)性克隆；挑取陽(yáng)性克隆，用Ze0Cin+LB(25yg/ml)培養(yǎng)，得到的菌液分別進(jìn)行 PCR篩選鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。PCR鑒定所用的引物對(duì)為Pl-上游引物/Pl-下游引物和3⑶-上游引物/3⑶-下游引物。PCR鑒定結(jié)果如圖1所示(A為Pl-pGAPh-A，B為3CD-pGAPh-A)。測(cè)序結(jié)果在pGAPZa-A的PmlI和SacII酶切位點(diǎn)間插入了 SEQ ID NO 2所示Pl 基因序列，表明構(gòu)建的重組載體Pl-pGAPh-A正確。在pGAPh-A的EcoRI和)(bal酶切位點(diǎn)間插入了 SEQ ID NO 4所示3⑶基因序列，表明構(gòu)建的重組載體3⑶-pGAPh-A正確。SEQ ID NO 2所示Pl基因序列編碼的蛋白如SEQ ID NO :1所示.SEQ ID NO 4所示Pl基因序列編碼的蛋白如SEQ ID NO 3所示.2、重組酵母菌的構(gòu)建用BspHI分別單酶切Pl-pGAPh-A和3CD-pGAPh_A，使其分別線性化。將線性化的重組載體一起通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化SMD1168感受態(tài)細(xì)胞，得到重組酵母菌。將重組酵母菌接種于kOCin+YPD(100y g/ml)固體培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選，得到抗性重組酵母菌。提取抗性重組酵母菌的基因組DNA，以2μ1 DNA為模板，PCR檢測(cè)是否含有Pl基因和3⑶基因。PCR鑒定所用的引物對(duì)為Pl-上游引物/Pl-下游引物和3⑶-上游引物/3CD-下游引物。Pl 基因 PCR 陰性對(duì)照pGAPh-A。Pl 基因 PCR 陽(yáng)性對(duì)照Pl-pGAP^i-A。3CDPCR 陰性對(duì)照 pGAPh-A。3CD PCR 陽(yáng)性對(duì)照 3CD-pGAPh-A。PCR鑒定結(jié)果如圖3所示(1-6號(hào)為重組菌中Pl基因檢測(cè)；7 =Pl基因PCR陰性對(duì)照；8 =Pl基因PCR陽(yáng)性對(duì)照；9-14號(hào)為重組菌中3CD基因檢測(cè)；15 :3CD PCR陰性對(duì)照；16 3CD PCR陽(yáng)性對(duì)照；17 :DGL5000)。PCR擴(kuò)增得到的Pl基因的理論長(zhǎng)度為2586bp ；PCR擴(kuò)增得到的3⑶基因的理論長(zhǎng)度為1935bp。既得到Pl基因又得到3⑶基因的重組菌為陽(yáng)性重組酵母菌。3、表達(dá)挑取陽(yáng)性重組酵母菌接種于IOml ZeocindOO μ g/ml)+YPD培養(yǎng)液中，在IOOml三角瓶50轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)Mh。Zeocin (100 μ g/ml) +YPD培養(yǎng)液配制將YPD培養(yǎng)液和博萊霉素(Zeocin)混合， YPD培養(yǎng)液和博萊霉素(Zeocin)的配比為Iml 100 μ g。合并菌液50ml，5000rpm離心lOmin，取上清，28000rpm離心4h，棄上清，收集沉淀， 即得到病毒樣顆粒(VLP)。4 鑒定(1)電鏡沉淀用PBS溶解，取樣電鏡觀察。電鏡觀察結(jié)果如圖4所示。結(jié)果可觀察到病毒樣顆粒(VLP)。(2)Wfestern blot 鑒定蛋白表達(dá)常規(guī)方法電泳；電泳后轉(zhuǎn)膜至0. 45umPVDF膜；加入5%脫脂奶粉4°C封閉過(guò)夜；吸取7μ 1兔抗EV71多克隆抗體(Abbiotec，USA)。，用21ml 5%脫脂奶粉1 3000 倍稀釋，浸沒(méi)PVDF膜；室溫反應(yīng)1. 5h ；洗膜后，吸取7 μ 1辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的鼠抗兔IgG(天根生物技術(shù)有限公司)用21ml5%脫脂奶粉1 3000稀釋，浸沒(méi)PVDF膜；室溫， 反應(yīng)2h ；洗膜后，將魯米諾和過(guò)氧化氫混合物加到PVDF膜是那個(gè)，分布均勻，反應(yīng)aiiin ； 將X光片壓在膜上，曝光lmin;定影后清水沖洗。結(jié)果如圖5所示。圖5中，1:預(yù)染蛋白 Marker，2 :EV71VLP。表明得到的蛋白就是EV71的殼蛋白。綜合以上鑒定結(jié)果，表明，得到的顆粒具有與病毒EV71相同的免疫學(xué)特性。二、重組酵母菌表達(dá)得到VLP方法I 1、高表達(dá)條件將重組酵母菌接種于培養(yǎng)基中，在溫度為30 0C、發(fā)酵體系的pH值為5. 0、溶氧60 %的條件下，發(fā)酵時(shí)間60-62小時(shí)；培養(yǎng)基配制將YPD液體培養(yǎng)基和博萊霉素(Zeocin)混合，YPD液體培養(yǎng)基和博萊霉素(Zeocin)的配比為Iml 200 μ g。2、顆粒的純化培養(yǎng)重組酵母菌，獲得菌液(培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作菌液)；將菌液5000g離心，收集上清液；用截留分子量200KD超濾膜將上清液進(jìn)行超濾，取濾液，濃縮倍數(shù)100倍。 然后蔗糖密度梯度離心使用不連續(xù)蔗糖密度梯度(15^,30%,65%蔗糖密度梯度)，10 萬(wàn)g超速離心5小時(shí)后，收集15-35%蔗糖界面上的乳白色條帶，超速離心去除蔗糖并濃縮回收病毒顆粒。離子交換層析采用DEAE sepharose FF介質(zhì)，平衡液為pH6. 5-7. 5、含有 0. 05-0. 15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS0雜蛋白去除可達(dá)99%以上，純化后的VLP病毒原液，即為VLP抗原。
方法II 方法與基本相同，不同的是溫度為27°C，發(fā)酵體系的pH值為4. 5，溶氧為50% ；培養(yǎng)基中YPD液體培養(yǎng)基和博萊霉素(Zeocin)的配比為Iml IOOyg.方法III 方法與基本相同，不同的是溫度為33°C，發(fā)酵體系的PH值為5. 5，溶氧為70% ；培養(yǎng)基中YPD液體培養(yǎng)基和博萊霉素(Zeocin)的配比為Iml 500 μ g.如上三種方法均得到VLP。實(shí)施例2、實(shí)施例1得到的VLP在作為疫苗中的應(yīng)用一、制備疫苗疫苗I 將病毒樣顆粒(VLP)與AL (OH)3K劑混合并溶于PBS緩沖液中，得到疫苗； 其中VLP顆粒蛋白與AL(OH)3K劑的質(zhì)量比為0. OOlg 0. 5g。疫苗II 將病毒樣顆粒(VLP)與AL(OH)3K劑混合并溶于PBS緩沖液中，得到疫苗；其中VLP顆粒蛋白與AL(OH)3K劑的質(zhì)量比為0.003g 0. 15g。疫苗III 將病毒樣顆粒(VLP)與AL(OH)3佐劑混合并溶于PBS緩沖液中，得到疫苗；其中VLP顆粒蛋白與AL(OH)3K劑的質(zhì)量比為0.005g 0. 25g。二、疫苗純度檢測(cè)根據(jù)《中國(guó)藥典(第3版)》及《中國(guó)生物制品規(guī)程》，測(cè)定疫苗成品的外觀，無(wú)菌試驗(yàn)，DNA含量，蛋白質(zhì)含量，pH值等。做了兩批疫苗，疫苗I結(jié)果如表1。疫苗II、疫苗III結(jié)果與疫苗I結(jié)果無(wú)顯著差已升。表1、疫苗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于制備病毒樣顆粒的重組酵母菌，按照包括如下步驟的方法制備得到將構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)酵母菌，得到重組酵母菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于所述編碼基因是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)酵母菌中的；所述重組表達(dá)載體按照如下方法得到將所述編碼基因插入酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到所述重組表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組酵母菌，其特征在于所述酵母表達(dá)載體為 pGAPZa-A ；所述出發(fā)酵母菌為SMDl 168。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的重組酵母菌，其特征在于所述病毒樣顆粒為引起手足口病的病毒的病毒樣顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的重組酵母菌，其特征在于所述引起手足口病的病毒為EV71 ；所述構(gòu)建EV71病毒的病毒樣顆粒所需的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO 1和 SEQ ID NO 3所示；所述重組表達(dá)載體為如下1)和2)所示1)所述重組表達(dá)載體按照如下方法得到將所述SEQID NO :1所示蛋白的編碼基因插入所述酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到的重組表達(dá)載體；2)所述重組表達(dá)載體按照如下方法得到將所述SEQID NO :3所示蛋白的編碼基因插入所述酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到的重組表達(dá)載體；和/或，所述SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 所述SEQ ID NO 3所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQID NO 4所示。
6.一種制備病毒樣顆粒的方法，包括如下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求1-5中任一所述重組酵母菌，所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因在所述重組酵母菌中表達(dá)，得到所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白進(jìn)行自組裝，得到病毒樣顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的溫度為27°C_33°C，具體為 27°C、30°C或33°C ；所述培養(yǎng)的pH值為4. 5-5. 5，具體為4. 5或5. 0或5. 5 ；所述溶氧為 50% -70%，具體為 50%或 60%或 70% ；所述培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基按照如下方法配制將YPD液體培養(yǎng)基和博萊霉素混合， 得到所述培養(yǎng)基；YPD液體培養(yǎng)基和博萊霉素的配比為Iml (100yg-500yg)，具體為 Iml IOOyg 或 Iml 200 μ g 或 Iml 500 μ g。
8.由權(quán)利要求6或7所述方法得到的病毒樣顆粒。
9.一種手足口病疫苗，其活性成分為權(quán)利要求8中所述病毒樣顆粒；或權(quán)利要求8中所述病毒樣顆粒在制備手足口病疫苗中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗或應(yīng)用，其特征在于所述疫苗中包括佐劑；所述病毒樣顆粒和佐劑的配比為0. OOlg 0. 5g-0. 005g 0.25g，具體為0. OOlg 0. 5g、 0. 003g 0.15g 或 0.005g 0. 25g ；和/或，所述佐劑為AL (OH) 3佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種病毒樣顆粒手足口病疫苗及其制備方法。本發(fā)明的制備病毒樣顆粒的方法，包括如下步驟培養(yǎng)重組酵母菌，所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白的編碼基因在所述重組酵母菌中表達(dá)，得到所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白進(jìn)行自組裝，得到病毒樣顆粒。本發(fā)明的制備病毒樣顆粒的方法，能夠制備出具有免疫功能的病毒樣顆粒，將其作為疫苗可獲得高效價(jià)的血清，且本發(fā)明方法所需條件簡(jiǎn)單、操作容易、成本低。因此本發(fā)明方法在疫苗的制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/85GK102533572SQ20101059137
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者張定梅, 楊東虎, 陸家海, 陸杰, 馬占軍 申請(qǐng)人:顧睞博(北京)科技有限公司