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Wt1疫苗的制作方法

文檔序號(hào):8490851閱讀:512來源:國(guó)知局
Wt1疫苗的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年12月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N〇.61/737,094的優(yōu)先權(quán),其 全部?jī)?nèi)容在此通過引用并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及維爾姆斯腫瘤(Wilm's tumor) (WTl)免疫原和編碼所述免疫原的核酸 分子。本發(fā)明還涉及包含此類WTl免疫原和/或核酸分子的疫苗。本發(fā)明還涉及使用所述 疫苗誘發(fā)免疫應(yīng)答以及預(yù)防和/或治療具有表達(dá)WTl的腫瘤的受試者的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 癌癥仍然是美國(guó)和世界范圍內(nèi)死亡的主要原因。癌癥疫苗市場(chǎng)正在迅速增長(zhǎng)。淋 巴瘤疫苗占約0. 5%的市場(chǎng)份額。有效的腫瘤疫苗可用于以阻止腫瘤生長(zhǎng)和/或可用作對(duì) 晚期癌癥患者的標(biāo)準(zhǔn)治療的更有效的、毒性更低的替代治療。與癌癥相關(guān)的抗原并因此為 抗腫瘤疫苗的靶是WTl。
[0005] 維爾姆斯腫瘤抑制基因I(WTl)被確定為腎臟胚胎惡性腫瘤的原因,影響約 1/10, 000的嬰兒。其以散發(fā)性和遺傳性形式發(fā)生。WTl的失活導(dǎo)致維爾姆斯腫瘤和 Denys-Drash綜合征(DDS)的發(fā)生。結(jié)果是腎病以及可能的生殖器異常。已發(fā)現(xiàn)WTl蛋白 與許多細(xì)胞因子(包括主要腫瘤調(diào)控基因P53)相互作用,所述p53也是腫瘤抑制轉(zhuǎn)錄因 子。
[0006] WTl基因在許多腫瘤類型中表達(dá)并且已經(jīng)更廣泛地參與許多癌癥。例如,WTl蛋白 被定位在75%的間皮瘤的細(xì)胞核(全世界每年14, 200例病例,在美國(guó)發(fā)病率最高)中和 93%的卵巢漿液性癌(2010年全世界190, 000例卵巢癌病例)中。此外,WTl已參與胰腺 癌、白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、頭頸癌以及良性間皮癌和宮頸癌及卵巢 癌等。WTl是作為癌癥治療的方法的基因療法或免疫療法的靶。
[0007] WTl編碼在C末端上含有4個(gè)鋅指基序并且在N末端上含有富含脯氨酸/谷氨酰 胺的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。其在泌尿生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育中起到不可或缺的作用。 然而,其在成人中是不太必需的,從而表明其作為免疫療法的靶。因在兩個(gè)編碼外顯子上的 選擇性剪接而產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄變體已得到很好地表征。利用整個(gè)閱讀框架最大化CTL覆蓋 將被認(rèn)為是有利的。
[0008] 由于WTl抗原的保守性,因此大多數(shù)產(chǎn)生針對(duì)該基因靶的強(qiáng)免疫的努力未獲成 功。先前已使用DAN疫苗技術(shù)、痘病毒疫苗技術(shù)、腺病毒疫苗技術(shù)、肽疫苗技術(shù)和基于蛋白 質(zhì)的疫苗技術(shù)研宄了疫苗。被研宄的疫苗使用真實(shí)的基因結(jié)構(gòu),即天然的"正常"基因。在 這些研宄中僅實(shí)現(xiàn)低水平或無功能的T細(xì)胞免疫。
[0009] 對(duì)于更有效的WTl免疫原的開發(fā)存在幾個(gè)主要問題。由于WTl抗原與宿主WTl的 相似性,因此產(chǎn)生強(qiáng)抑制子T細(xì)胞應(yīng)答,從而阻斷免疫誘導(dǎo)。此外,該基因本身在RNA水平被 顯著加工,以便產(chǎn)生多個(gè)具有未知值和可能競(jìng)爭(zhēng)值的經(jīng)切割的轉(zhuǎn)錄物。此外,被遞送的WTl 的表達(dá)很低,從而導(dǎo)致較差的免疫。
[0010] 用于治療和預(yù)防癌癥的疫苗受到極大的關(guān)注?,F(xiàn)有靶向WTl的疫苗受到體內(nèi)很差 的抗原表達(dá)限制。因此,在本領(lǐng)域仍然需要開發(fā)適用于表達(dá)WTl的腫瘤的安全有效的疫苗, 從而提供此類癌癥的治療和提尚所述癌癥的存活率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 概述
[0012] 本發(fā)明涉及包含一種或多種核酸序列的經(jīng)分離的核酸分子,所述核酸序列選自由 以下組成的組:編碼SEQ ID NO:2的核酸序列、編碼包含SEQ ID NO:2的長(zhǎng)度的至少90%的 片段的核酸序列、編碼與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的蛋白質(zhì)的核酸序列、編碼包 含與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度的至少90%的片段的核酸序列、 編碼SEQ ID N0:4的核酸序列、編碼包含SEQ ID N0:4的長(zhǎng)度的至少90%的片段的核酸序 列、編碼與SEQ ID N0:4具有至少98%的同一性的蛋白質(zhì)的核酸序列,以及編碼包含與SEQ ID N0:4具有至少98%的同一性的蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度的至少90%的片段的核酸序列。
[0013] 本發(fā)明還涉及包含一種或多種核酸序列的經(jīng)分離的核酸分子,所述核酸序列選自 由以下組成的組:SEQ ID NO: 1、包含SEQ ID NO: 1的長(zhǎng)度的至少90%的片段、與SEQ ID NO: 1具有至少98%的同一性的核酸序列、包含與SEQ ID NO: 1具有至少98%的同一性的核 酸序列的長(zhǎng)度的至少90%的片段、SEQ ID N0:3、包含SEQ ID N0:3的長(zhǎng)度的至少90%的片 段、與SEQ ID NO: 3具有至少98%的同一性的核酸序列,以及包含與SEQ ID NO: 3具有至少 98 %的同一性的核酸序列的長(zhǎng)度的至少90 %的片段。
[0014] 可將上述核酸分子摻入進(jìn)質(zhì)?;虿《据d體中。本發(fā)明還涉及包含一種或多種上述 核酸分子的組合物。本發(fā)明還涉及包含一種或多種上述核酸分子的疫苗。
[0015] 本發(fā)明還涉及治療具有表達(dá)WTl的腫瘤的個(gè)體的方法,所述方法包括施用有效地 減緩表達(dá)WT1的腫瘤的生長(zhǎng)、減小或消除所述腫瘤的量的上述疫苗。
[0016] 本發(fā)明還涉及預(yù)防個(gè)體的表達(dá)WTl的腫瘤的方法,所述方法包括施用有效地抑制 表達(dá)WTl的腫瘤的形成或生長(zhǎng)的量的上述疫苗。
[0017] 本發(fā)明還涉及包含氨基酸序列的蛋白質(zhì),所述氨基酸序列選自由以下組成的組: SEQ ID NO: 2、包含SEQ ID NO: 2的長(zhǎng)度的至少90%的片段、與SEQ ID NO: 2具有至少98% 的同一性的氨基酸序列、包含與SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的氨基酸序列的長(zhǎng)度 的至少90%的片段、SEQ ID N0:4、包含SEQ ID N0:4的長(zhǎng)度的至少90%的片段、與SEQ ID NO: 4具有至少98%的同一性的氨基酸序列,以及包含與SEQ ID NO: 4具有至少98%的同一 性的氨基酸序列的長(zhǎng)度的至少90%的片段。
[0018] 本發(fā)明還涉及包含核酸分子的疫苗。所述核酸分子可包含在SEQ ID NO: 1中所示 的核酸序列的完整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性的核酸序列。所述核酸分子可包含在 SEQ ID N0:3中所示的核酸序列的完整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性的核酸序列。所述 疫苗還可包含肽。所述肽可包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整長(zhǎng)度上具有至 少約90%的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完 整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性的氨基酸序列。
[0019] 所述核酸分子可包含表達(dá)載體。所述疫苗還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。所述 疫苗還可包含佐劑。
[0020] 本發(fā)明還涉及包含核酸分子的疫苗。所述核酸分子可編碼包含在SEQ ID NO:2中 所示的氨基酸序列的完整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性的氨基酸序列的肽。所述核酸分 子可編碼包含在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性 的氨基酸序列的肽。所述疫苗還可包含肽。所述肽可包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸 序列的完整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ ID N0:4 中所示的氨基酸序列的完整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性的氨基酸序列。
[0021] 所述核酸分子可包含表達(dá)載體。所述疫苗還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。所述 疫苗還可包含佐劑。
[0022] 本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列的核酸分子。
[0023] 本發(fā)明還涉及包含SEQ ID N0:3中所示的核酸序列的核酸分子。
[0024] 本發(fā)明還涉及包含SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的肽。
[0025] 本發(fā)明還涉及包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的肽。
[0026] 本發(fā)明還涉及包含抗原的疫苗,其中所述抗原可由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3 編碼。所述抗原可由SEQ ID NO: 1編碼。所述抗原可由SEQ ID NO: 3編碼。所述抗原可包 含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。所述抗原可包含SEQ ID NO: 2中所 示的氨基酸序列。所述抗原可包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列。
[0027] 本發(fā)明還涉及包含肽的疫苗。所述肽可包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列 的完整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ ID N0:4中所 示的氨基酸序列的完整長(zhǎng)度上具有至少約90%的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列。所述肽可包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列。
【附圖說明】
[0028] 圖1顯示標(biāo)繪免疫組對(duì)比每IO6個(gè)脾細(xì)胞的斑形成單位(SFU)的圖。
[0029] 圖2顯示標(biāo)繪免疫組對(duì)比每IO6個(gè)脾細(xì)胞的SFU的圖。
[0030] 圖3顯示免疫印跡。
[0031] 圖4顯示ConWTl-L和ConWTl-S的示意圖。
[0032] 圖5顯示ConWTl-L與ConWTl的各自氨基酸序列的比對(duì)。
[0033] 圖6在(A)中顯示編碼ConWTl-L的核苷酸序列;和⑶ConWTl-L的氨基酸序列。
[0034] 圖7在(A)中顯示編碼ConWTl-S的核苷酸序列;和⑶ConWTl-S的氨基酸序列。
[0035] 圖8顯示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的染色。
[0036] 圖9顯示免疫印跡。
[0037] 圖10顯示說明免疫方案的示意圖。
[0038] 圖11顯示標(biāo)繪免疫組對(duì)比每IO6個(gè)脾細(xì)胞的SFU的圖。
[0039] 圖12顯示標(biāo)繪免疫組對(duì)比每IO6個(gè)脾細(xì)胞的SFU的圖。
[0040] 圖13顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的染色。
[0041] 圖14顯示免疫印跡。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明涉及包含WTl抗原的疫苗。WTl在許多腫瘤中表達(dá)。因此,所述疫苗提供對(duì) 癌癥或基于癌癥的表達(dá)WTl的腫瘤的治療。
[0043] WTl抗原可以是從來自不同物種的WTl的序列衍生的共有WTl抗原,從而,所述共 有WTl抗原是獨(dú)特的。所述共有WTl抗原也是獨(dú)特的,因?yàn)樗鲣\指被修飾或被一起去除。 修飾可包括配位鋅結(jié)構(gòu)的半胱氨酸和組氨酸殘基的取代。
[0044] 令人驚訝地,當(dāng)所述共有WTl抗原具有經(jīng)修飾的鋅指或無鋅指時(shí),誘發(fā)與WTl反應(yīng) 的顯著的免疫應(yīng)答。誘發(fā)的免疫應(yīng)答包括體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,其中相對(duì)于或相較于被包 含天然WTl或針對(duì)表達(dá)優(yōu)化的WTl的疫苗誘發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答,所述細(xì)胞免疫應(yīng)答被誘發(fā) 增強(qiáng)約400倍。
[0045] 1 ?定義
[0046] 除非另有定義,否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 理解的含義相同的含義。在沖突的情況下,以本文件(包括定義)為準(zhǔn)。下文中描述了優(yōu) 選的方法和材料,盡管可在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中使用與本文中描述的那些方法和材料類 似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過引 用整體并入。本文中公開的材料、方法以及實(shí)施例僅僅是說明性的并非意在限制。
[0047] 如本文中所用,術(shù)語"包含/包括"、"包括"、"具有"、"有"、"可以"、"含有"及其變 型意欲為不排除另外的行為或結(jié)構(gòu)的可能性的開放式過渡短語、術(shù)語或詞語。除非上下文 另有明確說明,否則單數(shù)形式"一個(gè)(a) "、"和(and)"以及"該(the)"包括復(fù)數(shù)參考物。本 公開還涵蓋"包含/包括"本文中提出的實(shí)施方案或組件、"由所述實(shí)施方案或組件組成"和 "基本上由所述實(shí)施方案或組件組成"的其它實(shí)施方案,無論是否明確地顯示。
[0048] 如本文中所用的"佐劑"可意指添加至本文中描述的DNA質(zhì)粒疫苗以增強(qiáng)一種或 多種由DNA質(zhì)粒和下文中描述的編碼核酸序列編碼的抗原的抗原性的任何分子。
[0049] "抗體"可意指種類IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段的抗體、其片段或其衍生物, 包括Fab、F(ab')2、Fd和單鏈抗體、雙抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物。抗體可 以是從哺乳動(dòng)物的血清樣品分離的抗體、多克隆抗體、親和純化的抗體或其混合物,所述抗 體展現(xiàn)足夠的對(duì)期望的表位或來源于其的序列的結(jié)合特異性。
[0050] "抗原"是指:具有包括SEQ ID NO:2的突變的WTl氨基酸序列的蛋白質(zhì);具有本 文中所示的長(zhǎng)度的其片段、變體,即具有與如本文中所示的SEQ ID NO:2具有同一性的序列 的蛋白質(zhì)、具有本文中所示的長(zhǎng)度的變體的片段、SEQ ID N0:4;具有本文中所示的長(zhǎng)度的 其片段、變體,即具有與如本文中所示的SEQ ID N0:4具有同一性的序列的蛋白質(zhì)、具有本 文中所示的長(zhǎng)度的變體的片段及其組合??乖扇芜x地包含信號(hào)肽諸如來自其它蛋白質(zhì)的 那些信號(hào)肽。
[0051] 如本文中所用,"編碼序列"或"編碼核酸"可指包含編碼本文中所示的抗原的核苷 酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列還可包括有效地連接于能夠在施用了核酸的個(gè) 體或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控元件(包括啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào))的起始和 終止信號(hào)。編碼序列還可包括編碼信號(hào)肽的序列。
[0052] 如本文中所用,"互補(bǔ)"或"互補(bǔ)的"可意指可核酸,可意指核酸分子的核苷酸或核 苷酸類似物之間的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如,A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基 配對(duì)。
[0053] 如本文中所用,"共有"或"共有序列"可意指基于多個(gè)亞型的特定抗原的比對(duì)的 分析構(gòu)建的合成核酸序列或?qū)?yīng)的多肽序列。所述序列可用于誘發(fā)針對(duì)多個(gè)亞型、血清型 或株系的特定抗原的廣泛免疫。合成抗原諸如融合蛋白可經(jīng)操作成為共有序列(或共有抗 原)。
[0054] 如本文中所用,"恒定電流"定義由組織或限定所述組織的細(xì)胞在整個(gè)遞送至相同 組織的電脈沖的持續(xù)過程中接收或經(jīng)歷的電流。從本文中描述的電穿孔裝置遞送電脈沖。 該電流在電脈沖的整個(gè)過程中在所述組織中維持恒定的安培度,因?yàn)楸疚闹刑峁┑碾姶┛?裝置具有反饋元件,優(yōu)選地具有瞬時(shí)反饋。反饋元件可測(cè)量整個(gè)脈沖持續(xù)過程中組織(或 細(xì)胞)的電阻(resistance),并使電穿孔裝置改變其電能輸出(例如,提高電壓),這樣相 同組織中的電流在整個(gè)電脈沖(大約數(shù)微秒)中以及在脈沖間維持恒定。在一些實(shí)施方案 中,反饋元件包括控制器。
[0055] 如本文中所用,"電流反饋"或"反饋"可互換使用,并且可意指提供的電穿孔裝置 的主動(dòng)響應(yīng),其包括測(cè)量組織中電極之間的電流和相應(yīng)地改變由EP裝置遞送的能量輸出, 以將電流維持在恒定水平。該恒定水平由用戶在開始脈沖序列或電處理之前預(yù)先設(shè)定。反 饋可由電穿孔組件例如電穿孔裝置的控制器來實(shí)現(xiàn),因?yàn)槠渲械碾娐纺軌蜻B續(xù)監(jiān)測(cè)組織中 電極之間的電流并將該監(jiān)測(cè)的電流(或組織內(nèi)的電流)與預(yù)設(shè)電流相比較,以及連續(xù)進(jìn)行 能量輸出調(diào)整以將監(jiān)測(cè)的電流維持在預(yù)設(shè)水平。反饋回路可以是瞬時(shí)的,因?yàn)槠錇槟M閉 環(huán)反饋。
[0056] 如本文中所用的"分散電流"可意指從本文中描述的電穿孔裝置的各種針電極陣 列遞送的電流的模式,其中所述模式使待電穿孔的組織的任何區(qū)域上的電穿孔相關(guān)熱應(yīng)激 的發(fā)生降至最低或優(yōu)選消除。
[0057] 如本文中可互換使用的"電穿孔"、"電_透化"或"電動(dòng)增強(qiáng)"("EP")可指使用 跨膜電場(chǎng)脈沖來誘發(fā)生物膜中的微觀通路(孔);它們的存在允許生物分子諸如質(zhì)粒、寡核 苷酸、SiRNA、藥物、離子和水從細(xì)胞膜的一側(cè)通過進(jìn)入另一側(cè)。
[0058] 如本文中所用,"反饋機(jī)制"可指通過軟件或硬件(或固件)進(jìn)行的過程,該過程接 收期望的組織的阻抗(在遞送能量脈沖之前,期間和/或之后)并將其與現(xiàn)有值(優(yōu)選地 當(dāng)前)相比較,隨后調(diào)整被遞送的能量的脈沖以達(dá)到預(yù)設(shè)值??赏ㄟ^模擬閉環(huán)電路進(jìn)行反 饋機(jī)制。
[0059] "片段"可意指能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答的抗原的多肽片段。在具有或不具 有信號(hào)肽和/或位置1上的甲硫氨酸的每一種情況下,抗原的片段可與全長(zhǎng)100%相同,除 從N和/或C末端失去至少一個(gè)氨基酸外。片段可包含20%或更多、25%或更多、30%或 更多、35%或更多、40%或更多、45%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或 更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91 %或更多、92%或 更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或 更多百分比的特定全長(zhǎng)抗原的長(zhǎng)度,不包括任何添加的異源信號(hào)肽。片段可包含多肽的片 段,所述多肽的片段與抗原具有95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高或99% 或更高同一性,并且額外地包含當(dāng)計(jì)算百分比同一性時(shí)未被包括的N末端甲硫氨酸或異源 信號(hào)肽。片段還可包含N末端甲硫氨酸和/或信號(hào)肽,諸如免疫球蛋白信號(hào)肽,例如IgE或 IgG信號(hào)肽??蓪末端甲硫氨酸和/或信號(hào)肽連接于抗原的片段。
[0060] 在具有或不具有編碼信號(hào)肽和/或位置1上的甲硫氨酸的序列的每一種情況下, 編碼抗原的核酸序列的片段可與全長(zhǎng)100%相同,除從5'和/或3'末端失去至少一個(gè)核苷 酸外。片段可包含20%或更多、25%或更多、30%或更多、35%或更多、40%或更多、45%或 更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或 更多、85%或更多、90%或更多、91 %或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或 更多、96 %或更多、97 %或更多、98 %或更多、99 %或更多百分比的特定全長(zhǎng)編碼序列的長(zhǎng) 度,不包括任何添加的異源信號(hào)肽。片段可包含編碼多肽的片段,所述多肽與抗原具有95% 或
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