[0195] 此外，流體的自動注射幫助自動監(jiān)測和記錄注射的流體的實際劑量。如果需要，該 數(shù)據(jù)可由控制單元存儲以用于存檔。
[0196] 應(yīng)理解，注射速率可以是線性的或非線性的，并且可在已將針插入通過待治療的 受試者的皮膚后以及當(dāng)它們被進(jìn)一步插入進(jìn)身體組織時進(jìn)行注射。
[0197] 可利用本發(fā)明的設(shè)備向其中注射流體的適當(dāng)?shù)慕M織包括腫瘤組織、皮膚或肝組 織，還可以是肌肉組織。
[0198] 所述設(shè)備還包含用于將針引導(dǎo)插入身體組織的針插入裝置。流體注射速率受針插 入的速率控制。這具有可控制針插入和流體注射以便插入的速率可匹配所需注射速率的有 利方面。其還使得所述設(shè)備更容易被用戶操作。如果需要，可提供用于自動地將針插入身 體組織的裝置。
[0199] 用戶可選擇開始注射流體的時間。然而，理想地，當(dāng)針尖已到達(dá)肌肉組織時開始注 射，并且所述設(shè)備可包括用于感應(yīng)針已插入對于開始流體的注射是足夠的深度的裝置。這 意味著當(dāng)針已到達(dá)所需深度（該深度通常為肌肉組織開始時的深度）時可提醒自動地開始 注射流體。肌肉開始時的深度可以例如被采用來作為預(yù)設(shè)針插入深度，諸如被認(rèn)為對于針 穿過皮膚層是足夠的4mm的值。
[0200] 所述傳感裝置可包含超聲探針。所述傳感裝置可包含用于感應(yīng)阻抗或電阻的變化 的裝置。在該情況下，所述裝置可能不這樣記錄針在身體組織中的深度，而是被適配成感應(yīng) 當(dāng)針從不同類型的體身組織移動至肌肉中時阻抗或電阻的變化。這些備選裝置的任一種提 供了感應(yīng)注射可開始的相對準(zhǔn)確和簡單的操作裝置。如果需要，還可記錄針插入的深度，并 且可將所述深度用于控制流體的注射以便在記錄針插入的深度的同時，確定待注射的流體 的體積。
[0201] 所述裝置還可包含：用于支持針的基座；和用于在其中接受基座的殼體，其中所 述基座相對于殼體是可移動的，以便當(dāng)基座相對于殼體位于第一向后位置時將針在殼體內(nèi) 收回，以及當(dāng)基座位于殼體內(nèi)的第二向前位置時針伸出殼體。這對于用戶是有利的，因為可 將所述殼體在患者的皮膚上排成一列，隨后可通過相對于基座移動殼體將針插入患者的皮 膚。
[0202] 如上所述，期望實現(xiàn)速率受控的流體注射，以便當(dāng)將針插入皮膚時，流體在針的長 度上均勻分布。所述流體遞送裝置可包含被適配成以受控速率注射流體的活塞驅(qū)動裝置。 活塞驅(qū)動裝置可以例如通過伺服馬達(dá)來驅(qū)動。然而，活塞驅(qū)動裝置可通過相對于殼體在軸 向方向上移動的基座來驅(qū)動。應(yīng)理解，可提供用于流體遞送的備選裝置。因此，例如，可提 供可被擠壓以以受控或非受控速率進(jìn)行流體遞送的封閉容器來替代注射器和活塞系統(tǒng)。
[0203] 上述設(shè)備可用于任何類型的注射。然而設(shè)想其在電穿孔領(lǐng)域中是特別有用的，因 此其還可包含用于對針施加電壓的裝置。這使得針不僅能用于注射而且還可在電穿孔過程 中用作電極。這是特別有利的，因為這意味著電場被施加至與注射流體相同的區(qū)域。歷來 存在關(guān)于電穿孔的問題，因為極難精確地將電極與先前注射的流體對齊，所以用戶意欲在 更大面積上注射比所需的體積更大的體積的流體，和在更高的區(qū)域上施加電場以試圖保證 注射物質(zhì)與電場之間的重疊。通過使用本發(fā)明，可減小注射的流體體積和施用的電場的尺 寸，同時實現(xiàn)電場與流體之間的良好擬合。
[0204] 4.治療和/或預(yù)防的方法
[0205] 本文中還提供了通過對有此需要的受試者施用疫苗來治療有此需要的受試者的 的疾病、保護(hù)其免受疾病侵害和/或預(yù)防所述疾病的方法。所述疾病可以是癌癥，例如，維 爾姆斯腫瘤、從維爾姆斯腫瘤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移癌，以及表達(dá)WTl的癌癥或腫瘤。可如上在遞送方 法中所述的受試者施用疫苗。向受試者施用疫苗可誘發(fā)或引發(fā)受試者的免疫應(yīng)答。具體地， 向受試者施用疫苗可誘發(fā)或引發(fā)受試者的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0206] 具體地，所述方法可治療具有維爾姆斯腫瘤、從維爾姆斯腫瘤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移癌和/ 或表達(dá)WTl的腫瘤或癌癥的受試者，因為所述疫苗減緩維爾姆斯腫瘤、從維爾姆斯腫瘤產(chǎn) 生的轉(zhuǎn)移癌和/或表達(dá)WTl的腫瘤或癌癥的生長、減少和消除所述癌癥。所述方法還可預(yù) 防受試者的維爾姆斯腫瘤、從維爾姆斯腫瘤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移癌和/或表達(dá)WTl的腫瘤或癌癥， 因為所述疫苗抑制維爾姆斯腫瘤、從維爾姆斯腫瘤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移癌和/或表達(dá)WTl的腫瘤或 癌癥的形成和生長。如上所述，所述疫苗誘發(fā)或引發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。該誘發(fā)的 體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答可靶向維爾姆斯腫瘤、從維爾姆斯腫瘤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移癌和/或表達(dá) WTl的腫瘤或癌癥，從而減緩被施以所述疫苗的受試者的任何維爾姆斯腫瘤、從維爾姆斯腫 瘤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移癌和/或表達(dá)WTl的腫瘤或癌癥的生長，減少和消除所述癌癥。由所述疫苗 誘發(fā)的該體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答還可抑制被施以疫苗的受試者的任何維爾姆斯腫瘤、從 維爾姆斯腫瘤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移癌和/或表達(dá)WTl的腫瘤或癌癥的形成和生長。
[0207] 疫苗劑量可以為I y g至IOmg活性組分/kg體重/時間，以及可以為20 y g至IOmg 組分/kg 體重 / 時間。可以每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治療的疫苗的劑量數(shù)可 以為 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10。
[0208] 本發(fā)明具有通過下列非限定性實施例說明的多個方面。
[0209] 5.實施例
[0210] 本發(fā)明將在下面的實施例中進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例，雖然指示了本發(fā)明 的優(yōu)選實施方案，但僅是以說明性方式給出的。根據(jù)上面的討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行 各種改變和改進(jìn)，以使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，根據(jù)前述描述，除了本文中顯示和描 述的那些改進(jìn)之外的本發(fā)明的各種改進(jìn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將顯而易見。此類改進(jìn)也 意欲落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0211] 如本文實施例中所述采用逐步法來產(chǎn)生WTl免疫原。通過幾個逐步修飾來修飾 WTl基因。首先，修飾WTlRNA結(jié)構(gòu)以便其產(chǎn)生單一全長轉(zhuǎn)錄物。其次，修飾密碼子使用以改 變5'末端上的RNA結(jié)構(gòu)，從而提高體內(nèi)表達(dá)。最后，將基因的鋅指結(jié)構(gòu)域突變以修飾WTl 活性和刪除鋅指結(jié)合位點的部分。
[0212] 實施例1
[0213] 優(yōu)化的 WT-I
[0214] 開發(fā)產(chǎn)生WTl免疫原的逐步法。設(shè)計對RNA結(jié)構(gòu)的第一變化，所述變化導(dǎo)致僅單 一全長長轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，從而產(chǎn)生具有更加可控的表型的免疫原。序列還含有經(jīng)修飾的密碼 子使用選擇和在5'末端經(jīng)改變的RNA結(jié)構(gòu)以提高體內(nèi)表達(dá)。因此，WTl免疫原被優(yōu)化用于 表達(dá)。產(chǎn)生編碼該改進(jìn)的免疫原的表達(dá)盒的質(zhì)粒，并在動物中測試所述質(zhì)粒的免疫潛能及 產(chǎn)生T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答的能力。該質(zhì)粒疫苗被配制來用于通過電穿孔進(jìn)行增強(qiáng)的體內(nèi)遞 送，并且特定條件被用于體內(nèi)遞送。
[0215] 將編碼該免疫原的質(zhì)粒（被稱為 WTl-pVAXl、WTl-pVAX2、WTl-pVAX3、WTl-pVAX4 和WTl-pVAX5)與代表由本領(lǐng)域研宄的標(biāo)準(zhǔn)疫苗的WTl疫苗（也稱為WTl-p⑶NAl、 WTl-pCDNA2、WTl-pCDNA3、WTl-pCDNA4 和 WTl-pCDNA5)相比較。
[0216] 進(jìn)行小鼠研宄。用經(jīng)修飾的WT1疫苗（g卩，載體WTI-pVAXI、WTI-pVAX2、WTI-pVAX3、 WTl-pVAX4和WTl-pVAX5)接種小鼠，并且所述小鼠經(jīng)歷比用包含天然WTl的標(biāo)準(zhǔn)WTl疫苗 (艮P，WTl-pCDNAl、WTl-pCDNA2、WTl-pCDNA3、WTl-pCDNA4 和 WTl-pCDNA5)接種的小鼠產(chǎn)生 的抗-WTlT細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答更佳的抗-WTlT細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答。
[0217] 用相同量的WT-I質(zhì)粒，即新型WTl-pVax疫苗（g卩，載體WTl-pVAXl、WTl-pVAX2、 WTl-pVAX3、WTl-pVAX4和 WTl-pVAX5)或原始WT-I 質(zhì)粒疫苗（即，WTl-pCDNAl、WTl-pCDNA2、 WTl-pCDNA3、WTl-pCDNA4 和 WTl-pCDNA5)免疫動物（即，BalB/C 小鼠）3 次。T 細(xì)胞測定 (即，干擾素_ y (IFN-y ELISpot測定）的結(jié)果示于圖1和2中。很清楚，新型設(shè)計的WT-I 疫苗（即，載體 WTl-pVAXl、WTl-pVAX2、WTl-pVAX3、WTl-pVAX4 和 WTl-pVAX5)在產(chǎn)生 T 細(xì) 胞應(yīng)答上約為 WT-I 原始疫苗（即，WTl-pCDNAl、WTl-pCDNA2、WTl-pCDNA3、WTl-pCDNA4 和 WTl-pCDNA5)的4倍。如圖1和2中顯示的，對于標(biāo)準(zhǔn)疫苗僅觀察到低水平的T細(xì)胞免疫或 無功能的T細(xì)胞免疫，這與先前已獲得的數(shù)據(jù)相符。
[0218] 還檢查了該新型DNA疫苗誘發(fā)抗體應(yīng)答的能力。通過從在WTl-p⑶NA或WTl-pVAX 疫苗中免疫的動物收集血清進(jìn)行這些研宄。使用WTl-pCDNA疫苗未觀察到血清轉(zhuǎn)換或抗體 應(yīng)答的誘發(fā)（數(shù)據(jù)未顯示）。相反地，WTl-pVAX免疫原誘導(dǎo)具有正確特異性和分子量的強(qiáng) 蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)性，從而顯示強(qiáng)勁的WTl血清轉(zhuǎn)換和強(qiáng)抗體應(yīng)答（圖3)。這些數(shù)據(jù)共同地 強(qiáng)有力支持該疫苗免疫基因通過WTl免疫原的遞送變化和改進(jìn)的設(shè)計產(chǎn)生的改善。
[0219] 這些數(shù)據(jù)還顯示免疫原的構(gòu)象性質(zhì)得以維持，因為這些含有優(yōu)化的WTl免疫原的 疫苗明確地與腫瘤細(xì)胞中的天然基因序列反應(yīng)。
[0220] 通過修飾編碼序列以通過兩種方式破壞其天然結(jié)構(gòu)來進(jìn)一步靶向免疫原序列， (1)靶向鋅指區(qū)域和誘導(dǎo)修飾WTl活性的突變，以及（2)從重要的Zn指結(jié)合位點刪除序列。 這些變化在下文中概述于實施例2和3中。
[0221] 實施例2
[0222] 共有 WTl
[0223] 如上所述，優(yōu)化的WTl免疫原（即，如實施例1中所述優(yōu)化WTl基因）誘發(fā)體液和 細(xì)胞免疫應(yīng)答。為了進(jìn)一步靶向或修飾WTl免疫原序列，產(chǎn)生共有WTl免疫原。
[0224] 具體地，將來自多個物種的WTl序列彼此比較。如下面表1中所示，WTl是高度保 守的。因此，將來自多個物種的WTl序列用于產(chǎn)生WTl共有序列，其中WTl共有序列與人WTl 共享約95%的同一性。所得的共有WTl免疫原（也被稱為ConWTl)與人WTl共享95. 9% 的同一性，并且具有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列（圖5)。
[0225] 表1 :物種之間的WT1的同一性。
[0226]
【主權(quán)項】
1. 一種包含一種或多種核酸序列的經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸序列選自由以下組成 的組：編碼SEQ ID N0:2的核酸序列、編碼包含SEQ ID N0:2的長度的至少90%的片段的核 酸序列、編碼與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的蛋白質(zhì)的核酸序列、編碼包含與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的蛋白質(zhì)的長度的至少90%的片段的核酸序列、編碼SEQ ID N0:4的核酸序列、編碼包含SEQ ID N0:4的長度的至少90%的片段的核酸序列、編碼與 SEQ ID N0:4具有至少98%的同一性的蛋白質(zhì)的核酸序列，以及編碼包含與SEQ ID N0:4 具有至少98%的同一性的蛋白質(zhì)的長度的至少90%的片段的核酸序列。
2. -種包含一種或多種核酸序列的經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸序列選自由以下組成 的組：SEQ ID NO: 1、包含SEQ ID NO: 1的長度的至少90%的片段、與SEQ ID NO: 1具有至 少98%的同一性的核酸序列、包含與SEQ ID NO: 1具有至少98%的同一性的核酸序列的長 度的至少90%的片段、SEQ ID N0:3、包含SEQ ID N0:3的長度的至少90%的片段、與SEQ ID NO:3具有至少98%的同一性的核酸序列，以及包含與SEQ ID NO:3具有至少98%的同 一性的核酸序列的長度的至少90%的片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸分子，其中將所述分子摻入進(jìn)質(zhì)?；虿《据d體中。
4. 一種包含權(quán)利要求1中所示的一種或多種核酸分子的組合物。
5. -種包含權(quán)利要求2中所示的一種或多種核酸分子的組合物。
6. -種包含權(quán)利要求1中所不的一種或多種核酸分子的疫苗。
7. -種包含權(quán)利要求2中所不的一種或多種核酸分子的疫苗。
8. -種治療具有表達(dá)WTl的腫瘤的個體的方法，其包括施用有效地減緩表達(dá)WTl的腫 瘤的生長、減小或消除所述腫瘤的量的根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的疫苗。
9. 一種預(yù)防個體的表達(dá)WTl的腫瘤的方法，其包括施用有效地抑制表達(dá)WTl的腫瘤的 形成或生長的量的據(jù)權(quán)利要求6或7所述的疫苗。
10. -種包含氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列選自由以下組成的組：SEQ ID NO:2、包含SEQ ID NO:2的長度的至少90%的片段、與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一 性的氨基酸序列、包含與SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的氨基酸序列的長度的至少 90%的片段、SEQ ID N0:4、包含SEQ ID N0:4的長度的至少90%的片段、與SEQ ID N0:4具 有至少98%的同一性的氨基酸序列，以及包含與SEQ ID NO: 4具有至少98%的同一性的氨 基酸序列的長度的至少90%的片段。
11. 一種包含核酸分子的疫苗，其中： (a) 所述核酸分子包含在SEQ ID N0:1中所示的核酸序列的完整長度上具有至少約 90%的同一性的核酸序列；或 (b) 所述核酸分子包含在SEQ ID N0:3中所示的核酸序列的完整長度上具有至少約 90 %的同一性的核酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗，其還包含： (a) 包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約90%的同一性 的氨基酸序列的肽；或 (b) 包含在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約90%的同一性 的氨基酸序列的肽。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗，其中所述核酸分子包含表達(dá)載體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗，其還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗，其還包含佐劑。
16. -種包含核酸分子的疫苗，其中： (a) 所述核酸分子編碼包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至 少約90%的同一性的氨基酸序列的肽；或 (b) 所述核酸分子編碼包含在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至 少約90%的同一性的氨基酸序列的肽。
17. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的疫苗，其還包含： (a) 包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約90%的同一性 的氨基酸序列的肽；或 (b) 包含在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約90%的同一性 的氨基酸序列的肽。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述核酸分子包含表達(dá)載體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其還包含佐劑。
21. -種核酸分子，其包含SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列。
22. -種核酸分子，其包含SEQ ID N0:3中所示的核酸序列。
23. -種肽，其包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
24. -種肽，其包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
25. -種包含抗原的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3編碼。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO: 1編碼。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID N0:3編碼。
28. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中 所示的氨基酸序列。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序 列。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序 列。
31. -種包含肽的疫苗，其中： (a) 所述肽包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約90%的 同一性的氨基酸序列；或 (b) 所述肽包含在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約90%的 同一性的氨基酸序列。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的疫苗，其中所述肽包含SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的疫苗，其中所述肽包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
【專利摘要】本文中公開了包含一種或多種編碼突變的WT1抗原的核酸序列的核酸分子。公開了包含一種或多種編碼突變的WT1抗原的核酸序列的載體、組合物和疫苗。公開了治療具有表達(dá)WT1的腫瘤的個體的方法和預(yù)防表達(dá)WT1的腫瘤的方法。公開了突變的WT1抗原。
【IPC分類】C12N15-64, A61K39-38, C12P19-34, A61K39-00
【公開號】CN104812401
【申請?zhí)枴緾N201380061939
【發(fā)明人】大衛(wèi)·B·韋納, 嚴(yán)健, 朱厄爾·沃爾特斯
【申請人】賓夕法尼亞大學(xué)理事會, 艾諾奧醫(yī)藥品有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2013年12月13日
【公告號】CA2888648A1, WO2014093886A1, WO2014093897A1