專利名稱：白藜蘆醇及其衍生物的醫(yī)藥新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及白藜蘆醇衍生物(RV01，RV02, RV32)的醫(yī)藥新用 途，具體地說(shuō)是涉及其在制備防治酗酒相關(guān)的人外周免疫疾病的保健食品及藥品方面的用 途。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，化學(xué)名為3，5，4'-三羥基-反-均二苯代乙烯 (3,5,4' -trihydroxysitlbene)。分子式為C14H1203，分子量228. 25，無(wú)色針狀晶體，難溶 于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等極性較強(qiáng)的溶劑。白藜蘆醇是許多植物中存在的一種 活性非黃酮類多酚化合物，天然的白藜蘆醇還有順、反式兩種結(jié)構(gòu)，這兩種結(jié)構(gòu)可各自與葡 萄糖結(jié)合，形成順式或反式白藜蘆醇苷，它們與白藜蘆醇的生物學(xué)活性有關(guān)。自1940年該 成分被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直受到醫(yī)藥界的重視，迄今為止的研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗 心血管疾病、抗氧化、抗菌、抗炎、抑制血小板聚集等作用，它已成為科學(xué)家們高度重視的天 然活性成分，具有很大的藥用價(jià)值和市場(chǎng)前景。隨著對(duì)白藜蘆醇研究的深入，有關(guān)白藜蘆醇 衍生物也陸續(xù)有些報(bào)道，其中主要是一些白藜蘆醇的甲基化和羥基類衍生物。白藜蘆醇的 衍生物具有與白藜蘆醇相似的藥理活性，有些衍生物的活性和選擇性都強(qiáng)于白藜蘆醇，而 且衍生物的穩(wěn)定性也往往好于白藜蘆醇。提示其良好的藥用前景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。乙醇(Ethanol)是人們?nèi)粘Ｉ钪锌梢詮V泛接觸的化學(xué)物質(zhì)，它是酒精類飲料的 主要成分，也是常用的有機(jī)溶劑。隨著經(jīng)濟(jì)文化的發(fā)展、飲食習(xí)慣的存在以及飲食結(jié)構(gòu)的變 化，乙醇的生產(chǎn)和消費(fèi)也顯著增加，隨之而來(lái)的是因乙醇的濫用而導(dǎo)致的毒性作用。隨著研 究的開(kāi)展及深入，乙醇的毒害作用逐漸被人們了解，它可經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道吸收，在機(jī) 體內(nèi)代謝成乙醛同時(shí)產(chǎn)生各種有害物質(zhì)，引起心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng) 及外周免疫系統(tǒng)的損害，例如胃癌，食管癌，免疫功能低下等。國(guó)際癌癥研究署已經(jīng)將酒精 劃分為人類的一類致癌物質(zhì)。淋巴細(xì)胞是一種最易從人體得到的真核細(xì)胞，乙醇在淋巴細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的毒性作用 可以從一定程度上反映乙醇對(duì)人體其他器官及細(xì)胞的毒性作用。淋巴細(xì)胞是一種具有特異 性免疫功能的白細(xì)胞，即T細(xì)胞和B細(xì)胞。它們?cè)诳乖碳は驴稍龃?、分裂繁殖，并分別執(zhí) 行細(xì)胞免疫和體液免疫的功能。從而改變了淋巴細(xì)胞是終末細(xì)胞的概念，確定了淋巴細(xì)胞 的特異性免疫功能。淋巴細(xì)胞按其發(fā)生過(guò)程和功能至少可以分為兩大類一類有賴于胸腺 的存在，稱為胸腺依賴淋巴細(xì)胞，簡(jiǎn)稱T細(xì)胞；另一類在鳥類依賴于腔上囊的存在，稱為囊 依賴淋巴細(xì)胞，簡(jiǎn)稱B細(xì)胞。人類的B細(xì)胞，是在骨髓中分化的。T細(xì)胞接受抗原刺激變成 致敏細(xì)胞后乃分化繁殖成具有免疫活性的細(xì)胞。T細(xì)胞隨血液或淋巴液流動(dòng)到達(dá)抗原所在 地，通過(guò)與抗原的直接接觸，才分泌出免疫活性物質(zhì)，發(fā)揮其免疫作用，如排斥移植來(lái)的異 體組織、破壞腫瘤細(xì)胞、抑制病毒與細(xì)胞繁殖等，故稱之為細(xì)胞免疫。B細(xì)胞被抗原激活后， 可轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞，并分裂、分化為漿細(xì)胞。由于淋巴細(xì)胞具有上述重要的免疫功能，因此 淋巴細(xì)胞是外周免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它們擔(dān)負(fù)起了人體第一道也是最為重要的免疫屏障。更重要的是，乙醇在被攝入人體后90%以上經(jīng)胃直接吸收入血液，并隨血液循環(huán)到達(dá) 包括肝臟在內(nèi)的全身各處。乙醇在被肝臟代謝完全前，會(huì)始終存在于血液中即乙醇會(huì)始終 作用淋巴細(xì)胞，從而對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生毒性。這種毒性能夠嚴(yán)重影響淋巴細(xì)胞DNA功能，并降 低淋巴細(xì)胞表面免疫受體的表達(dá)及主要免疫指標(biāo)，導(dǎo)致外周免疫缺陷病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容是提供一種白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02, RV32)在制備防治酗 酒相關(guān)疾病保健食品及藥品方面的用途。本發(fā)明是通過(guò)如下方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的白藜蘆醇衍生物為RVOl (E)-542-(喹啉-4-基)乙烯基)_1，3_苯 二醇、RV02 (E)-4-(3，5-二甲氧基苯乙烯基)喹啉、RV32 (E)-4-(3，5-二甲氧基苯乙烯
基)苯酚。三種白藜蘆醇衍生物能夠用于制備治療外周免疫功能低下疾病的保健食品及藥 品。所述外周免疫功能低下疾病是指與酗酒相關(guān)的外周免疫疾病。所述的白藜蘆醇衍生物和藥學(xué)或保健品上可接受的載體混合制成可接受的片劑、 膠囊、注射液、沖劑、口服液、果汁、碳酸飲料和酒。并可以時(shí)間及劑量依賴性的抑制酗酒狀 態(tài)下乙醇對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞DNA的損傷，增強(qiáng)人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)DNA的修復(fù)作用，恢復(fù) 人外周血淋巴細(xì)胞DNA的完整性，保證人外周血淋巴細(xì)胞免疫功能的正常。


圖1為白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02, RV32)對(duì)乙醇誘導(dǎo)的人外周血淋巴細(xì)胞 DNA損傷的影響·ρ < 0. 001與空白組相比，***ρ < 0. 001給藥組與模型組相比·圖2為白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02, RV32)對(duì)羥自由基清除能力的考察***ρ < 0. 001與空白組相比·圖3為白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02, RV32)對(duì)乙醇代謝酶ADH1B，ALDffimRNA 表達(dá)的影響***ρ < 0. 001與空白組相比·
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、以人外周血淋巴細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行白藜蘆醇及其衍生物(RV01， RV02, RV32)對(duì)于細(xì)胞成活率的影響1.1 材料人淋巴細(xì)胞分離液中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所。白藜蘆醇(Res)及 三種衍生物(RV01，RV02, RV32)由沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院藥化教研室合成和提供；經(jīng) HPLC檢測(cè)，以上化合物純度均在99%以上。無(wú)水乙醇天津市北方化玻購(gòu)銷中心。低熔點(diǎn) 瓊脂糖華美工程有限公司。正常熔點(diǎn)瓊脂糖華美生物工程公司。乙二胺四乙酸二鈉天 津市博迪化工有限公司。1.2 方法
細(xì)胞分為空白組，乙醇(IOOmM)組，白藜蘆醇及三種衍生物(RV01，RV02, RV32)陰 性對(duì)照組(5 μ M，25 μ Μ, 50 μ Μ)，白藜蘆醇及三種衍生物(RV01，RV02, RV32)保護(hù)組(5 μ Μ, 25μΜ，50μΜ)+乙醇(IOOmM)組。細(xì)胞先給于白藜蘆醇及三種衍生物(RV01，RV02, RV32) 作用l，6，12J4h，然后給予終濃度為IOOmM的乙醇共同作用細(xì)胞池。單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)制片第一層取出載玻片，滴加100 μ 1正常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠溶液，附蓋玻片，盡 量避免產(chǎn)生氣泡，然后4°C固化10-15min。第二層取出已經(jīng)鋪好第一層膠體的載玻片，揭 去蓋玻片，刮去第一層凝膠，將細(xì)胞懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖37°C按1 1的比例混合，在載玻 片上滴加100 μ 1含有細(xì)胞的LMA，蓋蓋玻片，置4°C下固化20min。移去蓋玻片，將載玻片浸 入新鮮配制的4°C預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中l(wèi)h。DNA堿解旋將載玻片取出，置于水平電泳槽中， 加入新鮮配制的堿性電泳緩沖液，約覆過(guò)載玻片膠面0. 25cm左右，放置30min。電泳在電 壓11V，電流300mA下，電泳20min。中和與染色電泳后取出載玻片，用0. 4mol/L tris-HCl 中和5min/每次，共三次。再將載玻片浸入無(wú)水乙醇中固定Ih后，取出晾干。每個(gè)載玻片 上滴加50 μ L溴化乙啶(EB)水溶液，蓋蓋玻片染色。閱片在熒光顯微鏡下，DNA被染成紅 色。每個(gè)樣本隨機(jī)觀察50個(gè)細(xì)胞，使用LUCIA軟件分析。1. 3 結(jié)果結(jié)果如圖1所示，白藜蘆醇及其三種衍生物(RV01，RV02, RV32) 25 μ M預(yù)先處理細(xì) 胞，后給予乙醇從他起均體現(xiàn)顯著性的DNA保護(hù)作用。RV02體現(xiàn)了最強(qiáng)的DNA保護(hù)作用， 其次是RV01，RV32及Res。各化合物均體現(xiàn)了較好的劑量依賴性。此結(jié)果表明，白藜蘆醇 及其三種衍生物(RV01，RV02，RV3》是一種有效的抗酗酒引起的外周免疫性疾病的新化合 物，本發(fā)明拓寬了白藜蘆醇及其三種衍生物(RV01，RV02, RV32)的醫(yī)藥應(yīng)用。實(shí)施例2、白 藜蘆醇及其三種衍生物(RV01，RV02，RV3》對(duì)i^nton體系產(chǎn)生的羥自由基的清除活性的考 察2. 1 材料乙二胺四乙酸二鈉天津市博迪化工有限公司。磷酸氫二鈉沈陽(yáng)市試劑三廠。磷 酸二氫鉀天津市博迪化工有限公司。白藜蘆醇(Res)及三種衍生物(RV01，RV02, RV32) 由沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院藥化教研室合成和提供；經(jīng)HPLC檢測(cè)，以上化合物純度均在 99%以上。2. 2 方法羥基自由基的產(chǎn)生在IOmL的反應(yīng)溶液中，含pH 5,9KH2P04-Na2HP04(0. 067mol/ L) 2mL, DMSO (1. Omol/L)，F(xiàn)e2+-EDTA (0. 9mmol/L)，H2O2 (2. Ommo 1/L)，混合溶液于 37°C水浴反 應(yīng)15min。在上述溶液中加入0. 5mLDNPH于60°C水浴反應(yīng)20min.取出后，流水冷卻，再加 入2mL Κ0Η，溶液最終pH為于390nm測(cè)定吸光值。結(jié)果采用Mean士SEM表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用 ANOVA結(jié)合Dunnett，s t-test進(jìn)行組間比較。2. 3 結(jié)果應(yīng)用!^nton反應(yīng)考察白藜蘆醇及其三種衍生物對(duì)羥自由基的清除活性將有助于 揭示該三種衍生物對(duì)DNA的保護(hù)作用的機(jī)制及與Res的差異。如圖2所示，F(xiàn)enton體系在 啟動(dòng)15min后羥自由基水平達(dá)峰并在30min內(nèi)保持穩(wěn)定。Res的三種衍生物分別體現(xiàn)了不 同于Res的羥自由基清除活性。Res體現(xiàn)了最強(qiáng)的羥自由基清除活性，其次是RVOl及RV32。然而RV02卻沒(méi)有體現(xiàn)任何羥自由基的清除活性。該結(jié)果顯示白藜蘆醇及其衍生物的DNA 保護(hù)作用可能部分是通過(guò)清除羥自由基來(lái)實(shí)現(xiàn)的。實(shí)施例3、白藜蘆醇及其三種衍生物對(duì)胞內(nèi)DNA修復(fù)通路(BER)核心酶的激活作用3. 1 材料受試藥白藜蘆醇(Res)及三種衍生物(RV01，RV02, RV32)由沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥 工程學(xué)院藥化教研室合成和提供；經(jīng)HPLC檢測(cè)，以上化合物純度均在99%以上。Trizol Sigma。氯仿天津博迪化學(xué)試劑公司。DEPC :Sigma。反轉(zhuǎn)錄試劑盒寶信生物公司。引物 沈陽(yáng)聯(lián)星公司。一抗CellSignal公司。二抗北京中杉金橋生物公司。3. 2 方法RT-PCR 分析法，Western blotting 方法，白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02，RV32) 給藥終濃度為5，25，50μπιΟ1/1，作用時(shí)程為Mh。3. 3 結(jié)果如圖3所示，白藜蘆醇及其三種衍生物單獨(dú)處理細(xì)胞及預(yù)處理細(xì)胞均能上調(diào)細(xì)胞 的OGGl及XRCClmRNA和蛋白表達(dá)水平并具有一定的時(shí)間依賴性。四者激活OGGl及XRCCl 表達(dá)的能力由弱到強(qiáng)的順序?yàn)榘邹继J醇< RV32 < RVOl < RV02。
權(quán)利要求
1.白藜蘆醇及其衍生物在制備治療外周免疫功能低下疾病的保健食品及藥品中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的白藜蘆醇衍生物為￠)-5- -(喹 啉-4-基)乙烯基)-1，3_苯二醇、(E)-4-(3，5-二甲氧基苯乙烯基)喹啉和(E)-4-(3，5-二 甲氧基苯乙烯基)苯酚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述外周免疫功能低下疾病是指與酗酒 相關(guān)的外周免疫疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于白藜蘆醇衍生物時(shí)間及劑量依賴性的抑 制酗酒狀態(tài)下乙醇對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞DNA的損傷，增強(qiáng)人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)DNA的修復(fù) 作用，恢復(fù)人外周血淋巴細(xì)胞DNA的完整性，保證人外周血淋巴細(xì)胞免疫功能的正常。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白藜蘆醇衍生物的用途，其特征在于所述的白藜蘆醇及其 衍生物和藥學(xué)或保健品上可接受的載體混合制成可接受的片劑、膠囊、注射液、沖劑、口服 液、果汁、碳酸飲料和葡萄酒。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供了白藜蘆醇及其衍生物(RV01，RV02，RV32)在制備抗酗酒引起的外周免疫功能低下保健食品及藥品方面的新用途。本發(fā)明研究了白藜蘆醇及其衍生物對(duì)酗酒狀態(tài)下乙醇誘導(dǎo)的人外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用。首次發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇及其衍生物可以激活人外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)的BER修復(fù)通路中的核心酶的表達(dá)，提高細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，從而保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而保證外周淋巴細(xì)胞即外周免疫系統(tǒng)的正常功能。
文檔編號(hào)A23L1/29GK102125537SQ20101059162
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者吳春福, 楊靜玉, 王立輝, 王芳, 陳國(guó)良 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)