專利名稱：：PI4KBsiRNA及其在制備抑制SARS-CoV感染的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及PI4KBsiRNA、表達針對PI4KB的siRNA的表達載體、包含該表達載體的宿主細胞、活性成分為所述針對PI4KB的siRNA或所述表達載體的組合物。本發(fā)明還涉及一種用于預防和/或治療SARS-CoV感染的試劑盒，其含有所述針對PI4KB的siRNA或所述表達載體。本發(fā)明還涉及所述針對PI4KB的siRNA或所述表達載體在制備預防和/或治療SARS-CoV感染的藥物中的用途以及PI4KB作為SARS-CoV感染的治療靶點的用途。
背景技術：
：導致嚴重急性呼吸綜合征(SARQ世界性爆發(fā)流行的病原體是一種新型的冠狀病毒SARS冠狀病毒(SARS-CoV)[1]。SARS最早在2002-2003冬季爆發(fā)于亞洲，迅速蔓延至世界多個國家。截止到2003年7月31日，大規(guī)模流行的末期，全世界沈個國家診斷為SARS的8096名病例中，有774人死亡[2]，致死率達到近10%。SARS冠狀病毒是一種有包膜的RNA病毒，為單鏈正義RNA。其基因組全長四吐，包括13到15個開放閱讀框(ORF)。編碼4個主要結構蛋白，即Spike(S)、Envelope(E)、Membrane(M)、Nucleocapsid(N)蛋白。其中最為重要的是SARS-CoV的刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)，它主要介導病毒與宿主細胞受體的結合，并介導病毒與宿主細胞膜的融合[3]。Spike蛋白作為I型病毒膜蛋白，與很多有包膜病毒的跨膜糖蛋白類似。SARSSpike蛋白已經(jīng)被證實可以誘導VeroE6細胞凋亡。SARS-CoV受體的發(fā)現(xiàn)對于研究該致命性病毒進入宿主細胞具有劃時代的意義。2003年，Li[4]進行的S蛋白Sl亞基與VeroE6細胞的體外免疫共沉淀實驗首次證實了ACE2(血管緊張素轉換酶2、是SARS-CoV的功能性受體。而這進一步被SARS-CoV的體外重組S蛋白以及ACE2基因敲除小鼠模型的體內實驗所證實[5]。2004年，DC-SIGN以及與其同源性的分子L-SIGN也被證實是SARS-CoV的受體。不過，與ACE2這個主要受體相比，其介導病毒進入細胞的效率比較低W，7]。目前，已有大量研究報道了SARS-CoV進入宿主細胞的方式。首先有學者提出SARS-CoV是通過直接膜融合方式進入細胞[8，9，10]。后來Yang等人[11]報道SARS-CoV進入細胞是PH依賴性，升高胞內酸性小體pH的藥物可以阻斷SARS-CoV進入細胞。SimmonsG等人[12]發(fā)現(xiàn)一種pH依賴的蛋白酶內體蛋白酶-組織蛋白酶L(Cath印sinL)的抑制劑能夠抑制SARS-CoV的進入。這些都提示SARS-CoV可以通過內吞方式進入宿主細胞。Wang等人[13]進一步發(fā)現(xiàn)SARS-CoV可以通過內吞進入宿主細胞，并且病毒侵入宿主細胞VeroE6的過程不依賴于網(wǎng)格蛋白(clathrin)與胞膜窖(caveolea)結構。脂筏，這種細胞表面重要的脂質微區(qū)在病毒進入細胞的過程中起重要作用?；趯ARS-CoV的進入以及進入后在宿主細胞內生活周期的大量研究，目前針對SARS-CoV感染的抑制劑也應運而生。主要分為針對病毒進入的抑制劑和針對細胞內生活周期的抑制劑。針對SARS-CoV進入的抑制劑主要有1.以ACE2受體作為靶點包括可溶性ACE2，ACE2抗體以及針對ACE2催化活性的小分子抑制劑，如NAAE[14，15]。由于ACE2被證實在SARS-CoV感染中可以起到保護肺臟的作用，因此，ACE2受體抑制劑作為抗病毒的策略需要慎重考慮[16，17]。2.針對Spike蛋白的單克隆抗體，如S3.1[18]，CR3022聯(lián)合CR3014[19，20]。3.針對Spike蛋白S2結構域的膜融合抑制劑，如七肽重復序列抑制劑[21,22],環(huán)狀序列抑制劑[23]。4.小分子抑制劑，如VE607D4]，Cath印sinL(CTSL)抑制劑，如MDL28170。由于Bosch等人[25]發(fā)現(xiàn)CTSL可以在位于Sl和S2結構域之間的T678處切割SARS-CoVSpike蛋白，由此激活了Spike蛋白的膜融合功能。CTSL可以作為抑制SARS-CoV進入的新靶點。針對SARS-CoV細胞內生活周期的抑制劑主要有1.以SARS-CoV蛋白酶作為靶點，如針對3CLpro的CSl1，Cinanserin等[26，27]。2.以E蛋白作為靶點，如Cinnamoylguanidine.[28]3.針對SARS-CoV的RNAi，如針對SARS-CoVORFIa的siRNA[29]。4.干擾素[30]。目前，SARS-CoV與宿主相互作用機制的研究仍然在繼續(xù)。研究者試圖尋找更多新的有效的治療靶點。如泛素蛋白酶系統(tǒng)(UPS)，其在調節(jié)細胞內蛋白分選和降解中起到關鍵作用。通過研究UPS在冠狀病毒感染周期中不同步驟的作用發(fā)現(xiàn)，UPS與病毒進入，RNA合成以及后續(xù)蛋白表達密切相關[31]，提示這也可能成為治療的靶點。已有研究表明，SARS-CoV在大多數(shù)受到感染的VeroE6細胞凋亡后建立起持續(xù)感染。抑制劑LY^4002可以抑制持續(xù)性感染的建立。PII信號通路(包括AKT)在建立SARS病毒的持續(xù)感染中發(fā)揮著重要作用。PII/Akt信號通路的活化對于在VeroE6細胞死亡之前建立起的SARS-CoV的持續(xù)感染是必要的[32，33]。PI4K(磷脂酰肌醇4磷酸激酶)與病毒的關系近來逐漸開始出現(xiàn)在報道中。已知的四種ΡΙ4Κ(ΡΙ4Κ_ΙΙα，ΡΙ4Κ-ΙΙβ，ΡΙ4Κ-ΙΙΙα和ΡΙ4Κ_ΙΙΙβ)具有相同的功能磷酸化PI提供ΡΙ4Ρ。由于其在細胞中的定位不同，因此導致不同的生物結果。ΡΙ4ΚΒ別名為ΡΙ4Κ92，Ptdlns4-kinaseβ，PI4K-IIIβ。其GeneBank登錄號為ΝΜ_002651。位于染色體lq21。在酵母的同源物是Piklp，分子量為92kDa，抑制劑LY^4002的IC50為lOOuM，Wortmannin的IC50為50_300nM，哺乳動物PI4KB定位于高爾基體[34，35]和細胞核內。在MDCK細胞中，PI4KB調節(jié)高爾基體到細胞漿膜的運輸，并且調節(jié)高爾基體內對流感病毒血凝素的傳輸和皰疹性口腔炎病毒(VSV)G蛋白的基底膜側運輸[36]。激酶失活形式的PI4KB可以抑制VSV-G蛋白在非極化細胞中從高爾基體到細胞漿膜的運輸[37]。募集PI4KB到高爾基體被小GTP結合蛋白Arf-I調節(jié)，但PI4KB也與NCS-I相互作用并被其調節(jié)[38，39]。證據(jù)表明，PI4KB對調節(jié)胞外分泌非常重要NCS-I通過升高胰腺β細胞在小泡中的儲備以促進葡萄糖誘導的胰島素分泌，這一過程需要ΡΙ4ΚΒ的參與WO]。ΡΙ4ΚΑ別名為ΡΙ4Κ230，Ptdlns4-kinaseα,ΡΙ4ΚΙΙΙα。其GeneBank登錄號為ΝΜ_058004ο位于染色體22qll.21。在酵母的同源物是Mt4p，分子量為230kDa，抑制劑LY294002的IC50為lOOuM，Wortmannin的IC50為50_300nM，哺乳動物PI4KA主要位于哺乳動物內質網(wǎng)[34]和中心粒周高爾基體以及細胞核內Wl]。已有足夠的證據(jù)顯示PI4KA在脊椎動物細胞漿膜上起作用。其他兩種ΡΙ4Κ，ΡΙ4Κ-ΙΙα和ΡΙ4Κ-ΙΙβ定位于細胞漿膜，內體膜和高爾基體。調節(jié)內吞和細胞內的適配器蛋白AP-I貨物運輸W2]。PI4K與病毒的關系目前僅僅集中在對HCV的研究中。為發(fā)現(xiàn)具有潛力的治療靶點，Maud等人W3]對HCV感染細胞的進入途徑進行了研究。采用與細胞膜交通和重塑相關的siRNA文庫對HCV假病毒感染Huh-7.5.1細胞進行篩查。結果發(fā)現(xiàn)，采用siRNA技術敲除ΡΙ4Κ-ΙΙΙα和ΡΙ4Κ-ΙΙΙβ，不僅可以部分保護細胞免受HCV的感染而且使病毒復制得到抑制。而敲除ΡΙ4Κ-ΙΙα和ΡΙ4Κ-ΙΙβ均不能起到相應的作用。Huh_7.5.1細胞對HCV的易感性需要ΡΙ4Κ-ΙΙΙα和ΡΙ4Κ-ΙΙΙβ的充分表達。該研究為ΡΙ4Κ-ΙΙΙα和ΡΙ4Κ_ΙΙΙβ成為HCV治療的潛在靶點奠定了基礎。ΡΙ4Κ-ΙΙΙβ與病毒復制的作用機制也進一步得到探討。很多RNA病毒進行細胞內膜體重塑以產生特異位點進行RNA復制。2010年5月發(fā)表在Cell上的W4]研究揭示了RNA病毒如何利用細胞分泌路徑中的多種因子產生出復制特異的小體(organelles)，這些小體不同于宿主細胞自身的蛋白和磷脂組分。病毒特異蛋白調節(jié)被ArflGTP酶和鳥嘌呤核苷酸交換因子GBFl募集來的效應因子，進而優(yōu)先募集PI4K-IIIβ至膜衣蛋白，提供ΡΙ4Ρ磷脂富集的小體。ΡΙ4Ρ富集的磷脂微環(huán)境對于腸病毒和黃病毒RNA的復制是必要的。抑制ΡΙ4Κ-ΙΙΙβ干擾了這一過程。研究證明，ΡΙ4Κ-ΙΙΙβ作為細胞內蛋白起到了關鍵的作用。目前尚無ΡΙ4Κ與SARS-CoV關系的報道。已有HCV的研究結果啟發(fā)我們探討ΡΙ4Κ-ΙΙΙα和ΡΙ4Κ-ΙΙΙβ與SARS-CoV感染進入的關系。二者與SARS-CoV的感染進入是否有一定的關系？選擇什么樣的系統(tǒng)對這個問題進行研究？由于假病毒通常被用以模仿真正的病毒進入宿主細胞進行研究，例如HCW45，46]，Ebola和Marburg病毒W(wǎng)7]，ARS-CoV[13]。這是一個研究病毒生命周期中早期事件非常有力的工具。VeroE6細胞表達ACE2受體，是SARS-CoV的自然宿主細胞。在研究中被用以作為SARS-CoV感染的細胞模型。因此，本研究擬采用具有感染力的SARS假病毒感染VeroE6細胞這一有力的系統(tǒng)進行研究。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。近來RNAi研究取得了突破性進展，被《Science》雜志評為2001年的十大科學進展之一，并名列2002年十大科學進展之首。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。設計通常為一RNA短鏈，21-23nt。該技術在病毒進入感染的研究中也得到廣泛應用。因此，如果能用RNA干擾技術研究清楚PI4K與SARS-CoV的關系，將會為SARS提供一種有前景的治療途徑。
發(fā)明內容因此，本發(fā)明的技術問題在于獲得PI4K與SARS-CoV的相互作用關系。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種針對PI4KB的siRNA。本領域技術人員公知針對PI4KB的siRNA的獲取方法，優(yōu)選地，所述獲取方法為全化學合成或重組表達。優(yōu)選地，所述針對PI4KB的siRNA選自siRNAl正義鏈1(5‘-3')5'CAAGGAGCCUGGAGUACAAdTdT3‘(SEQIDNo.2)，反義鏈1(3‘-5')3'dTdTGUUCCUCGGACCUCAU⑶U5‘(SEQIDNo.3)；siRNA2正義鏈2(5‘-3')5'GGAUCAAGCCAUACAAGAUdTdT3‘(SEQIDNo.5)，反義鏈2(3‘-5')3'dTdTCCUA⑶UCGGUAU⑶UCUA5‘(SEQIDNo.6)；siRNA3正義鏈3(5‘-3')5'GCACCGAGAGUAUUGAUAAdTdT3‘(SEQIDNo.8)，反義鏈3(3‘-5')3'dTdTC⑶GGCUCUCAUAACUAUU5‘(SEQIDNo.9)。3、最優(yōu)選地，所述siRNA為siRNA2正義鏈2(5‘-3')5'GGAUCAAGCCAUACAAGAUdTdT3‘(SEQIDNo.5)，反義鏈2(3‘-5')3'dTdTCCUA⑶UCGGUAU⑶UCUA5‘(SEQIDNo.6)。本發(fā)明的第二方面涉及一種表達如上所述的針對PI4KB的siRNA的表達載體，優(yōu)選地，所述表達載體為原核表達載體或真核表達載體，更優(yōu)選地，所述表達載體為真核表達載體，最優(yōu)選地，所述真核表達載體為腺病毒表達載體。本發(fā)明的第三方面涉及一種含有如上所述的表達載體的宿主細胞，優(yōu)選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，更優(yōu)選地，所述宿主細胞為真核細胞，更優(yōu)選地，所述宿主細胞為哺乳動物細胞，最優(yōu)選地，所述細胞為VeroE6細胞。本發(fā)明的第四方面涉及一種活性成分為如上所述的針對PI4KB的siRNA或如上所述的表達載體的組合物。本領域技術人員公知，在制備所述組合物時，考慮到siRNA或表達載體本身的性質以及所要應用的目的，其還可以另外包含抑制RNA降解的試劑、pH調節(jié)劑、賦形劑等藥學上可接受的輔料。本發(fā)明的第五方面涉及一種用于預防和/或治療SARS-CoV感染的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有如上所述的針對PI4KB的siRNA或如上所述的表達載體。本領域技術人員公知，在制備所述試劑盒時，考慮到siRNA或表達載體本身的性質以及所要應用的目的，其還可以另外包含抑制RNA降解的試劑、pH調節(jié)劑、賦形劑等藥學上可接受的輔料。本發(fā)明的第六方面涉及如上所述的針對PI4KB的siRNA或如上所述的表達載體在制備預防和/或治療SARS-CoV感染的藥物中的用途。本發(fā)明的第七方面涉及一種PI4KB作為SARS-CoV感染的治療靶點的用途。優(yōu)選地，所述治療靶點選自靴序列1:5，CAAGGAGCCTGGAGTACAA3，(SEQIDNo.1)靴序列2:5'GGATCAAGCCATACAAGAT3，(SEQIDNo.4)，或靴序歹Ij3:5，GCACCGAGAGTATTGATAA3，(SEQIDNo.7)。換言之，本研究基于對SARSSpike蛋白在細胞凋亡中的作用及其凋亡機制的初步的研究，從發(fā)現(xiàn)LY^4002可以抑制SARS假病毒感染VeroE6細胞入手，設計針對PI4KA和PI4KB的siRNA。當然，本領域技術人員公知，針對HULC基因可以設計多種siRNA序列，只要這樣的siRNA序列可以有效的敲除HULCRNA的表達。這樣的siRNA序列也落入本發(fā)明的保護范圍。通過導入上述的相應siRNA后對VeroE6細胞所受SARS假病毒以及VSVG假病毒的感染情況進行觀察。研究發(fā)現(xiàn)，在受到有效干擾的VeroE6細胞中，VSVG假病毒的感染程度沒有明顯變化。而SARS假病毒感染的程度明顯不同干擾VeroE6宿主細胞的PI4KA對SARS假病毒的感染無影響，而干擾宿主細胞的PI4KB則可以顯著抑制SARS假病毒的感染，結果具有顯著的統(tǒng)計學意義。本研究首次發(fā)現(xiàn)了PI4KBsiRNA可以抑制SARS-CoV的感染，為研究PI4KB與SARS-CoV的關系揭開了新的一頁，雖然機制尚待進一步的探討，但這對發(fā)現(xiàn)具有潛力的治療靶點具有重要的意義。圖la、圖lb:VeroE6轉染對照siRNA，PI4KAsiRNA以及PI4KBsiRNA48小時后SARS假病毒感染和VSVG假病毒感染的熒光顯微鏡圖VeroE6細胞轉染對照siRNA(左)、PI4KAsiRNA(中)、PI4KBsiRNA(右)后感染SARS假病毒(圖la)或VSVG假病毒(圖lb)。48小時后細胞固定，在100倍熒光顯微鏡下觀察表達綠色熒光蛋白的細胞比例(綠色)。相應細胞核用HoeChst33342進行染色(藍色)。圖2熒光計數(shù)統(tǒng)計假病毒感染的結果圖VeroE6細胞轉染對照siRNA，PI4KAsiRNA和PI4KBsiRNA后，感染SARS假病毒或VSVG假病毒。48小時后將準備熒光觀察的細胞先用4%多聚甲醛進行固定，之后用Hoechst33342染核10分鐘。在NikonEclipseTE2000-U倒置熒光顯微鏡下進行觀察拍照(同圖1)。圖像采用Imageproplus軟件進行統(tǒng)計分析GFP(綠色熒光蛋白)陽性細胞比例，即假病毒感染比例。每個樣本分析的細胞數(shù)不少于2000個。圖3檢測假病毒感染的綠色熒光蛋白表達量的Western圖VeroE6細胞轉染對照siRNA，PI4KAsiRNA和PI4KBsiRNA后感染假病毒，48小時后收獲細胞的裂解液。利用綠色熒光蛋白抗體(EGFP)進行蛋白免疫印記檢測。GFP表達量代表相對的假病毒感染強度。其中陰性對照是對照siRNA轉染的VeroE6細胞，而空白對照是沒有假病毒感染的親本VeroE6細胞。圖4a、圖4b:VeroE6轉染siRNA48小時后RT-PCR檢測目的基因(PI4KA、P14KB)抑制效率結果圖A為PI4KB的結果，B為PI4KA的結果。VeroE6轉染相應siRNA48小時后，提取總細胞RNA。利用特異性引物檢測相應基因的表達水平。其中陰性對照是轉染對照siRNA的VeroE6細胞，而空白則是沒有經(jīng)過siRNA轉染的親本VeroE6細胞。具體實施例方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領域技術人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。實施例實施例1、研究材料及細胞培養(yǎng)1.1本發(fā)明所用主要研究材料如下VeroE6,HEK293T細胞購自協(xié)和基礎所細胞中心；細胞培養(yǎng)基DMEM，胎牛血清購自hvitrogen公司；Iipofectamine2000,lipofectamineRNAiMAX，Opti-ΜΕΜ購自invitrogen公司Hoechst33342購自sigma公司4%多聚甲醛購自聯(lián)科生物技術有限公司actin、GFP抗體購自SantaCruz公司MTT試劑購自Promega公司siRNA由廣州銳博生物技術有限公司合成1.2細胞培養(yǎng)VeroE6，HEK293T用DMEM(含10%胎牛血清)進行傳代。37°C，5%CO2孵箱培養(yǎng)。實施例2、假病毒的包裝將大小均勻，狀態(tài)良好的HEK293T細胞約5XIO6分到IOcm培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。24小時后，進行質粒轉染。對于SARS假病毒，PQCXIX、gag/pol、S-ht2三種質粒(PQCXIX購自ClontechCat.No.631515，gag/pol,s_ht2由MichaelFarzan實驗室(哈佛醫(yī)學院AIDS研究中心)提供，gag/pol以小鼠白血病病毒的gag/pol為基礎。s_ht2是將SARS病毒的Spike基因插入到pcDNA3.1載體中構建而成)。按照112的比例進行轉染，每個培養(yǎng)皿三種質粒總量是10ug。對于VSVG假病毒，PQCXIX,gag/pol、VSVG三種質粒(其中VSVG質粒系將VSVG基因插入到pcDNA3.1載體中構建而成)。按照112的比例進行轉染，每個培養(yǎng)皿三種質?？偭渴?0ug。轉染6小時細胞進行換液。48小時后，收獲細胞上清，0.45μm濾膜過濾。之后用BeckmanSW41轉子，45，000轉/分鐘，4°C離心2小時。將離心到管底部的病毒用少量DMEM重懸，-80°C保存。實施例3、siRNA轉染以及定量PCR檢測基因抑制效率在本研究中所選用的PI4KB的三個RNA干擾靶標及其對應的siRNA詳情如下PI4KB01靶序列CAAGGAGCCTGGAGTACAA(SEQIDNo.1)正義鏈(5‘-3')5‘CAAGGAGCCUGGAGUACAAdTdT3‘(SEQIDNo.2)反義鏈(3‘-5')3‘dTdTGUUCCUCGGACCUCAU⑶U5‘(SEQIDNo.3)PI4KB02靶序列GGATCAAGCCATACAAGAT(SEQIDNo.4)正義鏈(5‘-3')5‘GGAUCAAGCCAUACAAGAUdTdT3‘(SEQIDNo.5)反義鏈(3‘-5')3‘dTdTCCUA⑶UCGGUAU⑶UCUA5‘(SEQIDNo.6)PI4KB03靶序列GCACCGAGAGTATTGATAA(SEQIDNo.7)正義鏈(5'-3')5'GCACCGAGAGUAUUGAUAAdTdT3'(SEQIDNo.8)反義鏈(3‘-5')3'dTdTC⑶GGCUCUCAUAACUAUU5‘(SEQIDNo.9)在本研究中所選用的PI4KA的RNA干擾靶標及其對應的siRNA詳情如下靶序列:GGATAAAGCTATTCAGAAA(SEQIDNo.10)正義鏈(5'-3')5，GGAUAAAGCUAUUCAGAAAdTdT3，(SEQIDNo.11)反義鏈(3'-5')3，dTdTTTTCTGAATAGCTTTATCC5，(SEQIDNo.12)具體實驗步驟如下(1)將大小均勻，狀態(tài)良好的VeroE6細胞約5XIO4分到M孔板，M小時后進行轉染。轉染時按照lipofectamineRNAiMAX轉染說明書進行。大體上每孔siRNA終濃度為50nM,lipofectamineRNAiMAX加入Iul。轉染6小時后去掉細胞上清，加入新鮮DMEM培養(yǎng)8M小時。之后將細胞分到96孔板中，進行假病毒感染實驗。感染48小時后進行熒光觀察。(2)RNA提取及定量PCRTrizol試劑、SuperscriptII逆轉錄酶購自invitrogen公司儀器=RealtimeABI的7500染料sybr-rochefaststartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)，耗材ABI光學96孔反應板(N8010560)，光學貼膜(4360954)或者8連管。在SiRNA轉染細胞48小時后，細胞內總RNA用trizol試劑進行提取。利用SuperscriptII逆轉錄酶將RNA逆轉錄成cDNA。定量PCR的檢測在ABI7500儀器上進行。GAPDH基因作為內參。具體步驟1)引物稀釋PI4KA正向引物TCCGCAGCACTATCATCAAC反向引物CCTCAAAGTAGCAGAACATTACCP14KB正向引物CCAACTATGACAACGATGATGAG反向引物ACAGGCTCCTTGCTCTCC2)樣本稀釋提取后的RNA稀釋一倍3)體系配置總需要的孔數(shù)為樣本數(shù)*待測基因數(shù)*復孔數(shù)(3個)。每孔體系為20ul，包括IOulSYBR,Iul模板，正反向引物各lul，水7ul。配制的時候，按照每個樣品所需的量進行(除引物之外的成分)，每個基因配制3.3個孔所需的量也就是66ul。這樣保證同一樣本內的均一性。計算好所需的量之后，將除引物外的溶液分至EP管內，小心加好混好的引物對。4)用移液器混好后瞬離，小心加入專用96孔板。帶PE手套覆蓋好光學貼膜，用卡片刮平并小心撕去紙邊。5)96孔板離心機2000轉2分鐘。6)打開ABI7500SDSsoftware，設置為相對定量ddct模式。設定待測基因名稱、布局。延伸時間0.348，體系20111。運行完畢之后，再測定熔解曲線。以判斷引物特異性。7)分析結果。結果如圖如和圖4b所示，VeroE6轉染相應siRNA48小時后，提取總細胞RNA。利用特異性引物檢測相應基因的表達水平。其中陰性對照是轉染對照siRNA的VeroE6細胞，而空白則是沒有經(jīng)過siRNA轉染的親本VeroE6細胞。RT-PCR結果說明實驗所用的siRNA均可以有效抑制目的基因的表達。相應基因PI4KA和PI4KB01，PI4KB02,PI4KB03的mRNA水平下降明顯。實施例4、假病毒感染轉染siRNA細胞的熒光觀察及比例統(tǒng)計如圖1所示，VeroE6細胞采用上述實施例3的方法進行相應siRNA(即對照siRNA、PI4KAsiRNA、P14KBsiRNA)轉染后感染方法2制備的SARS假病毒(圖la)或VSVG假病毒(圖lb)。48小時后將準備熒光觀察的細胞先用4%多聚甲醛進行固定，之后用H0echst33342染核10分鐘。在100倍熒光顯微鏡下觀察表達綠色熒光蛋白的細胞比例(綠色)。相應細胞核Hoechst33342染色呈藍色。該熒光定性結果證實，VeroE6轉染對照siRNA及PI4KAsiRNA后對于SARS假病毒的進入影響不大，而在轉染PI4KBsiRNA后，SARS假病毒的熒光比例明顯下降。而VSVG假病毒的熒光比例不受PI4KBsiRNA的影響。如圖2所示，利用NikonEclipseTE2000-U倒置熒光顯微鏡進行觀察拍照，圖像用Imageproplus軟件進行分析，每個樣本分析的細胞數(shù)不少于2000個。統(tǒng)計感染細胞的熒光比例結果定量證實了SARS假病毒感染受到轉染PI4KBsiRNA的抑制，具有顯著的統(tǒng)計學意義。而VSVG假病毒未受到影響。**P<0.001。實施例5、蛋白免疫印跡檢測方法(WesternBlotting)將經(jīng)過假病毒感染的細胞用PBS洗3次，之后用細胞裂解液裂解(含蛋白酶抑制劑)。SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到醋酸纖維素膜上，2%雞卵清封閉。一抗GFP抗體11000稀釋，二抗辣根過氧化物酶標記的抗體結合后，加入底物顯色。結果如圖3所示，VeroE6細胞轉染對照siRNA，PI4KAsiRNA和PI4KBsiRNA后感染假病毒，48小時后收獲細胞的裂解液。利用綠色熒光蛋白抗體(EGFP)進行蛋白免疫印記檢測。GFP表達量代表假病毒感染強度。其中陰性對照是對照siRNA轉染的VeroE6細胞，而空白對照是沒有假病毒感染的親本VeroE6細胞。Western結果顯示在轉染PI4KBsiRNA后，SARS假病毒進入VeroE6的總GFP表達量明顯下降，而VSVG假病毒則受影響不大。參考文獻1.Abdel-GhafarAN,ChotpitayasunondhΤ,GaoΖ,etal.UpdateonavianinfluenzaA(H5N1)virusinfectioninhumans.NEnglJMed2008；358:261-73.)(HuiDS.ReviewofclinicalsymptomsandspectruminhumanswithinfluenzaA/H5N1infection.Respirology2008;13Suppll:S10_3.2.http://www,who,int/csr/sars/country/table20040421/en/index,html3.ThanhTT,vanDoornHR,deJongMD.HumanH5N1influenza:currentinsightintopathogenesis.IntJBiochemCellBiol2008；40:2671-2674.4.W.Li,Μ.J.Moore,N.Vasilieva,J.Sui,S.K.ffong,M.A.Berne,M.Somasundaran,J.L.Sullivan,K.Luzuriaga,T.C.Greenough,H.Choe,M.Farzan,Angiotensin-convertingenzyme2isafunctionalreceptorfortheSARScoronavirus[J],Nature,2003,426450-454.5.K.Kuba,Y.Imai,S.Rao,H.Gao,F.Guo,B.Guan,Y.Huan,P.Yang,Y.Zhang,W.Deng,L.Bao,B.Zhang,G.Liu,Z.Wang,M.Chappell,Y.Liu,D.Zheng,A.Leibbrandt,T.ffada,A.S.Slutsky,D.Liu,C.Qin,C.Jiang,J.M.Penninger,Acrucialroleofangiotensinconvertingenzyme2(ACE2)inSARScoronavirus-inducedlunginjury[J],Nat.Med.，2005，11:875-879.6.A.Marzi,T.Gramberg,G.Simmons,P.Moller,A.J.Rennekamp,M.Krumbiegel,M.Geier,J.Eisemann,N.Turza,B.Saunier,A.Steinkasserer,S.Becker,P.Bates,H.Hofmann,S.PohImann,DC-SIGNandDC-SIGNRinteractwiththeglycoproteinofMarburgvirusandtheSproteinofthesevereacuterespiratorysyndromecoronavirus[J]，J.Virol.2004，78:12090-12095.7.S.A.Jeffers,S.M.Tusell,L.Gillim-Ross,E.M.Hemmila,J.E.Achenbach,G.J.Babcock，W.D.ThomasJr,L.B.Thackray,Μ.D.Young，R.J.Mason，D.M.Ambrosino，D.E.Wentworth,J.C.Demartini,K.V.Holmes,CD209L(L-SIGN)isareceptorforsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus[J]，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2004，10115748-15753.8.NgML，TanSH,SeeEE，OoiEE，LingAE.EarlyeventsofSARScoronavirusinfectioninverocells.JMedVirol2003；71:323-331.9.QinfenZ，JinmingCiXiaojunH，etal·ThelifecycleofSARScoronavirusinVeroE6cells.JMedVirol2004；73:332-337.10.SimmonsG，ReevesJD,RennekampAJ,AmbergSM,PieferAJ,BatesP.Characterizationofsevereacuterespiratorysyndromeassociatedcoronavirus(SARS-CoV)spikeglycoprotein-mediatedviralentry.ProcNatlAcadSciUSA2004；101:4240-4245.11.YangZY,HuangY，GaneshL，etal.pH-dependententryofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirusismediatedbythespikeglycoproteinandenhancedbydendriticcelltransferthroughDC-SIGN.JVirol2004；78:5642-5650.12.SimmonsG，GosaliaDN,RennekampAJ,ReevesJD,DiamondSL，BatesP.InhibitorsofcathepsinLpreventsevereacuterespiratorysyndromecoronavirusentry[J].ProcNatlAcadSciUSA2005；102:11876-11881.13.HongliangWang，PengYang，KangtaiLiu,FengGuo,YanliZhang,GongyiZhang，ChengyuJiang.SARScoronavirusentryintohostcellsthroughanovelclathrin—andcaveolae-independentendocyticpathway.CellResearch，2008，18，290-301.14.FarzanMR，LiWiMooreMJ,inventors；TheBrighamandWomen*sHospital，Inc.,assignee.Angiotensin-convertingenzyme-2asareceptorfortheSARScoronavirus.US20050282154；2005.15.HuentelmanMJjZubcevicJiHernandezP,etal.Structure-baseddiscoveryofanovelangiotensin-convertingenzyme2inhibitor.Hypertension2004；44(6)903-906.16.ImaiY，KubaK，PenningerJM.Thediscoveryofangiotensin-convertingenzyme2anditsroleinacutelunginjuryinmice.ExpPhysiol2008；93(5)543-548.17.ImaiY，KubaK，RaoS，etal.Angiotensin-convertingenzyme2protectsfromsevereacutelungfailure.Nature2005；436(7047):112-116.18.TraggiaiE，BeckerS，SubbaraoK，etal.AnefficientmethodtomakehumanmonoclonalantibodiesfrommemoryBcells:potentneutralizationofSARScoronavirus.NatMed2004；10(8):871-875.19.TerMeulenJH,DeKruifCA,VanDenBrinkEN,GoudsmitJ,inventors；Crucell,assignee.BindingmoleculesagainstSARS-coronavirusandusesthereof.US20060121580；2006.20.TerMeulenJH,VanDenBrinkEN,DeKruifCA,GoudsmitJ,invento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用途。9.一種PI4KB作為SARS-CoV感染的治療靶點的用途。10.根據(jù)權利要求9所述的PI4KB作為SARS-CoV感染的治療靶點的用途，其特征在于所述治療靶點選自靶序列15'CAAGGAGCCTGGAGTACAA3’(SEQIDNo.1)靴序列2:5'GGATCAAGCCATACAAGAT3，(SEQIDNo.4)，或靴序歹Ij3:5，GCACCGAGAGTATTGATAA3，(SEQIDNo.7)。全文摘要本發(fā)明涉及PI4KBsiRNA及其在制備抑制SARS-CoV感染的藥物中的用途。特別地，本發(fā)明涉及針對PI4KB的siRNA、表達針對PI4KB的siRNA的表達載體、包含該表達載體的宿主細胞、活性成分為所述針對PI4KB的siRNA或所述表達載體的組合物。本發(fā)明還涉及一種用于預防和/或治療SARS-CoV感染的試劑盒，其含有所述針對PI4KB的siRNA或所述表達載體。本發(fā)明還涉及所述針對PI4KB的siRNA或所述表達載體在制備預防和/或治療SARS-CoV感染的藥物中的用途以及PI4KB作為SARS-CoV感染的治療靶點的用途。本發(fā)明為SARS-CoV的感染提供了一種有治療前景的作用靶點及一類有治療前景的藥物候選物。文檔編號C12N15/63GK102453712SQ201010511650公開日2012年5月16日申請日期2010年10月19日優(yōu)先權日2010年10月19日發(fā)明者楊寧,馬萍申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所