專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)植物根際促生菌促生效果的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)植物根際促生菌促生效果的方法。
背景技術(shù)：
植物根際促生菌(Plant growth-promoting Rhizobacteria，PGPR)泛指存在于植 物根際，葉圍或與植物關(guān)系密切的其他生境中的，所有能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌。PGH 菌主要 是通過(guò)和植物根系間的相互作用關(guān)系來(lái)改變土壤和植物體的微生態(tài)環(huán)境，從而達(dá)到促進(jìn)植 物生長(zhǎng)的目的，其作用機(jī)制主要分為以下三種一是直接給植物提供植物激素等促生物質(zhì) (如IAA，嗜鐵素，溶磷物質(zhì))和固氮作用，增強(qiáng)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用；二是通過(guò)與根 際病原菌搶占生態(tài)位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，來(lái)達(dá)到抑菌的效果；三是誘導(dǎo)植物的生理生化變化 和抗病性等。同時(shí)，PGH 在根際的定殖一定程度上促進(jìn)了菌根真菌的生長(zhǎng)；對(duì)受污染的土 壤也有一定的生物修復(fù)功能。自從二十世紀(jì)七十年代末，Kloepper和coworkers第一次使用PGPR這個(gè)術(shù)語(yǔ)以 來(lái)，對(duì)于PGPR的研究以一種飛快的速率增加著，發(fā)展到如今已成為國(guó)際上的熱門(mén)課題。由 于化肥、農(nóng)藥對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，化肥生產(chǎn)成本高漲、能源緊缺，澳大利亞、加拿大、美國(guó)、 歐共體組織和日本等國(guó)，都開(kāi)展了 PGPR的專(zhuān)項(xiàng)研究。并且，已在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增加作物產(chǎn) 量，生物防治，生物修復(fù)方面積累了大量的材料。枯草芽孢桿菌Arl3是最早成功應(yīng)用和商 業(yè)化生產(chǎn)的PGPR，用Ar 13處理種子，可以提高胡蘿卜產(chǎn)量48%，燕麥產(chǎn)量33%和花生產(chǎn)量 37%。中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所研究的PGPR——海洋放線(xiàn)菌MB297于2000年獲得 農(nóng)業(yè)部產(chǎn)品認(rèn)證并開(kāi)始商品化生產(chǎn)與銷(xiāo)售，在重茬大豆上應(yīng)用已達(dá)2. 0X104hm2，增產(chǎn)15% 左右。這表明PGH 研究已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)微生物研究的熱點(diǎn)之一，PGH 制劑的廣泛應(yīng)用對(duì) 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和環(huán)境保護(hù)具有重大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。PGH 廣泛存在于多種植物根際中，其發(fā)揮作用的前提是與植物間建立一種密切的 互作關(guān)系。因此，在研究非生防PGH 和植物間互作關(guān)系的實(shí)驗(yàn)中，從大量的微生物菌株中 篩選獲得優(yōu)良促生性狀的菌株是工作基礎(chǔ)，需要做大量的篩選工作，如何在短時(shí)間內(nèi)篩選 獲得促生效果極佳的促生菌株是科研單位和企業(yè)面臨的難題之一?，F(xiàn)有的植物促生檢測(cè)方 法可分為短期的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，溫室檢測(cè)和長(zhǎng)期的大田檢測(cè)兩個(gè)階段進(jìn)行。短期檢測(cè)方法因 為快捷，影響因素少往往是實(shí)驗(yàn)中首先選用的檢測(cè)手段。通常采用無(wú)土栽培，大體分為以下 五種方式(1)幼苗生長(zhǎng)法。挑選大小一致的植物種子分別播入鋪有兩層濾紙/蛭石/紗布 的培養(yǎng)皿中，加入適宜濃度的菌液/藥劑，在人工氣候箱在培養(yǎng)一周后測(cè)定莖長(zhǎng)，根長(zhǎng)，干 鮮重。(2)蘿卜/黃瓜子葉擴(kuò)張法。蘿卜/黃瓜種子催芽后，挑選大小一致的子葉放入鋪有 兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適宜濃度的菌液/試劑，用人工氣候箱培育，測(cè)定子葉鮮重。(3) 黃瓜子葉生根法。黃瓜種子催芽并光照培養(yǎng)3天后，挑選大小一致的子葉放入鋪有兩層濾 紙/蛭石/紗布的培養(yǎng)皿中，加入適宜濃度的菌液/藥劑，人工氣候箱培養(yǎng)，測(cè)定每對(duì)子葉 的生根數(shù)量。(4)綠豆下胚軸生根法。將綠豆種子催芽后，光照培養(yǎng)10d，挑選生長(zhǎng)整齊的 綠豆幼苗，在子葉節(jié)下3cm處切去下胚軸和主根，將帶有子葉和3cm長(zhǎng)的下胚軸的幼苗切段放入裝有適宜濃度的菌液/試劑的小瓶中，在人工氣候箱中培養(yǎng)，觀察根的生長(zhǎng)狀況并測(cè) 定每株生根數(shù)。(5)沙培。將植物種子催芽后，種到裝有無(wú)菌沙的試管或培養(yǎng)皿中，再澆入 適宜濃度的菌液/試劑以接種，在人工氣候箱中培養(yǎng)1-2周測(cè)量植株莖長(zhǎng)，根長(zhǎng)。(6)水培。 將植物種子催芽，育苗后，放入裝有營(yíng)養(yǎng)液的專(zhuān)門(mén)容器和培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察整株植物 的生長(zhǎng)狀況，測(cè)定莖長(zhǎng)，根長(zhǎng)，干鮮重等。其中，方法(2)，(3)，(4)檢測(cè)數(shù)據(jù)太少，培養(yǎng)時(shí)間 太長(zhǎng)。方法(1)和(5)是現(xiàn)在比較常用的兩種檢測(cè)方式，但方法(1)中的根在培養(yǎng)皿中不 能直立伸長(zhǎng)，影響根系的測(cè)量和觀察效果。用方法(5)可以完整的取到植物的莖和根，利于 觀察和測(cè)量；但取根操作麻煩，并且期間需要澆水，會(huì)影響到菌在植物根部的定殖。如果采 用(6)水培，則菌不易定殖在植物根系上，不能說(shuō)明菌和植物間的關(guān)系，且成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種快速，高效檢測(cè)植物根際促生菌(PGPR)促生效果的方法。 彌補(bǔ)傳統(tǒng)短期檢測(cè)方法中的不足，以縮短整體實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，提高促生菌株篩選效率。本發(fā)明提供的快速檢測(cè)植物根際促生菌促生效果的方法，包括如下步驟1)制備根際促生菌的菌液，將催芽后的種子置于菌液中浸泡2 4個(gè)小時(shí)；2)將步驟1)中浸泡過(guò)菌液的種子放入用菌液浸濕的雙層濾紙中間，將濾紙包裹 成筒狀放入盛有營(yíng)養(yǎng)液的試管中；3)再放入人工氣候箱培養(yǎng)3 4天，測(cè)量莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和干鮮重。其中，所述的制備的根際促生菌菌液濃度為107 108CFU/ml，優(yōu)選為107CFU/ml。其中，將催芽后的種子置于菌液中浸泡的時(shí)間優(yōu)選為3小時(shí)。其中，放入濾紙中的種子優(yōu)選的數(shù)量為3 4顆。其中，所述的營(yíng)養(yǎng)液的用量?jī)?yōu)選為試管體積的1/3，優(yōu)選的營(yíng)養(yǎng)液為Hoagland營(yíng) 養(yǎng)液，所述種子優(yōu)選為作物種子，更為優(yōu)選的是綠豆、玉米、小麥。其中，所述步驟3)放入人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為4天。按照本發(fā)明中的方法檢測(cè)PGPR菌CNA9和MOB 13對(duì)綠豆的促生效果，實(shí)驗(yàn)室 結(jié)果顯示，莖長(zhǎng)比清水對(duì)照分別伸長(zhǎng)了 19. 67%和18. 62%，根長(zhǎng)分別伸長(zhǎng)了 38.91%和 43. 61%。按照本發(fā)明的方法將CNA9菌株接種到玉米植株上，避光培養(yǎng)4天后，其根長(zhǎng)和干 重，鮮重分別增加了 15. 4%，28. 8%和21. 5%。通過(guò)溫室培養(yǎng)的方式接種CAN9菌株，玉米在根長(zhǎng)和干重，鮮重分別增加了 16. 6%，32. 9%和 32. 5%。試管苗實(shí)驗(yàn)和溫室實(shí)驗(yàn)的促生效果基本一致，證明本方法可以替代溫室促生效果 測(cè)定，而且本發(fā)明的方法能大大節(jié)省時(shí)間和降低材料成本，提高了促生菌的篩選效率。


圖1為不同接種方式對(duì)綠豆促生效果的影響。圖2為系列濃度梯度菌液對(duì)綠豆促生效果的影響。圖3為不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)綠豆根長(zhǎng)的影響。
圖4為不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)綠豆莖長(zhǎng)的影響。圖5為不同菌液搖培時(shí)間對(duì)綠豆促生效果的影響。圖6為兩種菌株的短期促生效果。圖7為溫室實(shí)驗(yàn)中菌株對(duì)玉米植株的促生效果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1材料與設(shè)備供試植物綠豆(綠珍珠，購(gòu)自山西博大種苗有限公司)；玉米(農(nóng)大108)，可市售獲得。#t i式 M tt :CNA9 (Arthrobacter globiformis) , CGMCC No. 4217, MOB13(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，CGMCC No. 2763。供試藥劑70%酒精；SolutionI :lOmM 磷酸；Solution II :lmLO. 5M FeCl3 溶于 50mL 35% HC104供試培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g/L，酵母提取物5. 0g/L,NaCl 10. 0g/L, (瓊脂 15. 0g/L)，蒸餾水1000mL, pH 7. 0-7. 2。121°C 高壓滅菌 30min供試材料濾紙，大試管，試管架，人工氣候箱，手提式壓力蒸汽消毒器，生化培養(yǎng) 箱，電子天平，數(shù)碼相機(jī)，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，紫外與可見(jiàn)光分光光度計(jì)。實(shí)施例2選取健全的綠豆種子，浸入70%酒精中消毒30s，用無(wú)菌水沖洗3遍，將種子用兩 層紗布包好放入大培養(yǎng)皿中，清水浸濕，使紗布表面形成一層水膜。放入28°C培養(yǎng)箱中，培 養(yǎng)18h左右待種子露白。將CNA9菌株平板劃線(xiàn)活化后，接種到LB培養(yǎng)基中搖培3天，將菌 液濃度調(diào)整到107CFU/mL。將發(fā)芽的種子進(jìn)行如下浸種，浸紙，浸種+浸紙三種方式處理，并以清水處理作為 對(duì)照。1)選取露白程度一致的綠豆種子若干，放入菌液中浸種3小時(shí)。將20CmX30Cm的 雙層濾紙卷成筒狀，插入裝有菌液的大試管中，待菌液將濾紙完全浸濕。將浸種后的綠豆種 子放入浸紙后的兩層濾紙之間，再將濾紙卷回筒狀，插到裝有1/3體積Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的 大試管中，每個(gè)試管卷入3顆種子，每組3管重復(fù)。放入人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)(26°C，相對(duì)濕度 為 80% )。2)選取露白程度一致的綠豆種子若干，放入菌液中浸種3小時(shí)。將20CmX30Cm的 雙層濾紙卷成筒狀，插入裝有清水的大試管中，待菌液將濾紙完全浸濕。將浸種后的綠豆種 子放入浸紙后的兩層濾紙之間，再將濾紙卷回筒狀，插到裝有1/3體積Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的 大試管中，每個(gè)試管卷入3顆種子，每組3管重復(fù)。3)選取露白程度一致的綠豆種子若干，放入清水浸種3小時(shí)。將20cmX 30cm的雙 層濾紙卷成筒狀，插入裝有菌液的大試管中，待菌液將濾紙完全浸濕。將浸種后的綠豆種子 放入浸紙后的兩層濾紙之間，再將濾紙卷回筒狀，插到裝有1/3體積Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的大 試管中，每個(gè)試管卷入3顆種子，每組3管重復(fù)。
4)選取露白程度一致的綠豆種子若干，放入清水浸種3小時(shí)。將20CmX30Cm的雙 層濾紙卷成筒狀，插入裝有清水的大試管中，待菌液將濾紙完全浸濕。將浸種后的綠豆種子 放入浸紙后的兩層濾紙之間，再將濾紙卷回筒狀，插到裝有1/3體積Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的大 試管中，每個(gè)試管卷入3顆種子，每組3管重復(fù)。將接種好的試管苗放入人工氣候箱內(nèi)避光培養(yǎng)4天(26°C，相對(duì)濕度為80% )。收 獲后，測(cè)量莖高，根長(zhǎng)，通過(guò)變異系數(shù)來(lái)比較不同接種方法的精密度。結(jié)果如圖1和表1所示，用浸種和浸紙結(jié)合的方法處理綠豆，數(shù)據(jù)的變異系數(shù)最 小，表示這一處理下各個(gè)數(shù)據(jù)變異程度最小，試驗(yàn)精密度高。所以選擇浸種+浸紙的接種方 式。表1不同接種方式對(duì)綠豆促生效果的影響
接種方式莖長(zhǎng)(cm)變異系數(shù) 根長(zhǎng)(cm) 變異系數(shù)
清水10.4 + 0.390.1110.7 + 0.690.18
浸種10.8 ±0.620.1611.7 + 1.20.28
浸紙9.46 + 0.760.2313.0 + 1.00.22
浸種+浸紙12.0 ± 0.29_0_07_13.4±0.51_0.11實(shí)施例3將搖培3 天后的 CNA9 菌液稀釋到 101CI，109，108，107，106，105，104，103，102，lO'CFU/ mL共10個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)清水做空白對(duì)照。按浸種和浸紙的方式將發(fā)芽的綠豆種子接種 上不同濃度的菌液(方法同實(shí)施例2)。放入人工氣候箱內(nèi)避光培養(yǎng)4天(26°C，相對(duì)濕度 為80%)。收獲后，測(cè)量莖高，根長(zhǎng)。結(jié)果如圖2和表2所示。結(jié)果表明，在高濃度菌液中，綠豆植株在的莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)都表現(xiàn)出抑制效果， 而107 108CFU/mL濃度菌液對(duì)綠豆莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)促進(jìn)作用最顯著，其中最適接種濃度為 107CFU/mL。表2系列濃度梯度菌液對(duì)綠豆促生效果的影響
權(quán)利要求
一種檢測(cè)植物根際促生菌促生效果的方法，包括如下步驟1)制備根際促生菌的菌液，將催芽后的種子置于菌液中浸泡2～4個(gè)小時(shí)；2)將步驟1)中浸泡過(guò)菌液的種子放入用菌液浸濕的雙層濾紙中間，將濾紙包裹成筒狀放入盛有營(yíng)養(yǎng)液的試管中；3)再放入人工氣候箱培養(yǎng)3～4天，測(cè)量莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和干鮮重。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的根際促生菌菌液濃度為107 108CFU/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的根際促生菌菌液濃度為107CFU/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的種子在菌液中浸泡的時(shí) 間為3小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的放入濾紙中的種子為3 4顆。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的營(yíng)養(yǎng)液的用量為試管體 積的1/3。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的營(yíng)養(yǎng)液為Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)的時(shí) 間為4天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的種子為作物種子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的種子選自綠豆、玉米、小麥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)植物促生效果的方法，包括如下步驟1)制備根際促生菌的菌液，將催芽后的種子置于菌液中浸泡2～4個(gè)小時(shí)；2)將步驟1)中的浸泡過(guò)菌液的種子放入用菌液浸濕的雙層濾紙中間，將濾紙包裹成筒狀放入盛有營(yíng)養(yǎng)液的試管中；3)在放入人工氣候箱培養(yǎng)3～4天，測(cè)量莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和干鮮重。該方法可以應(yīng)用與植物促生菌的快速篩選，植物促生物質(zhì)促生效果快速測(cè)定等，將植物促生菌的篩選工作由溫室的一個(gè)月時(shí)間縮減到一周，對(duì)新型生物菌肥的研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要作用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101984067SQ20101051168
公開(kāi)日2011年3月9日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者位婉, 吳文良, 周華寧, 孟凡喬, 焦子偉, 郭巖彬 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)