專利名稱：一種制備β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法及所用的表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種制備β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法及所用的表達(dá)載體、融合蛋白等。
背景技術(shù)：
β -內(nèi)酰胺類抗生素(包括青霉素和頭孢菌素)在臨床上用于治療多種細(xì)菌感染疾病，但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用以及某種程度上的濫用，耐藥菌在不斷地產(chǎn)生，它們對(duì)許多 β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥，從而使這類藥物對(duì)耐藥菌感染的疾病無效。微生物來源的β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑棒酸(Clavulanic acid)及其β -內(nèi)酰胺砜類化合物舒巴坦(Sulhctam) 和他佐巴坦(Tazobactam)，均在七十年代至八十年代被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)是有效的β -內(nèi)酰胺酶抑制劑，且作為“自殺者”與內(nèi)酰胺抗生素合并用藥，可達(dá)到抑制內(nèi)酰胺酶活力、增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺抗生素療效的目的。然而，這些小分子化合物對(duì)一些細(xì)菌產(chǎn)生的由染色體介導(dǎo)的I型β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用都很小。近來人們從帶棒鏈霉菌(Sti^ptomyces clavuligerus)中分離到一種β -內(nèi)酰胺酶抑制蛋白(β -lactamase inhibitory protein，BLIP)，可以特異性的抑制β -內(nèi)酰胺酶的活性，隨后又有BLIP-I、BLIP-II被發(fā)現(xiàn)。但是β -內(nèi)酰胺酶抑制蛋白BLIP分子量比較大，有165個(gè)氨基酸組成，并不適合開發(fā)成為臨床使用的藥物。BLIP與β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)合具有幾個(gè)關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明人曾經(jīng)根據(jù)關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成了隨機(jī)寡核苷酸庫， 從中篩選到對(duì)肽31 1504-01，體外作用表明具有抑制內(nèi)酰胺酶的活性，適合用于作為基因工程表達(dá)藥物，但是該對(duì)肽31 1504-01的抑制內(nèi)酰胺酶的活性并不高。經(jīng)過氨基酸替換得到對(duì)β -內(nèi)酰胺酶抑制活性更高的多肽Ρ1_Α(已經(jīng)申請(qǐng)中國發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?200910054340. 1。Pl-A 為 SIPIS04-01-N-Y50A-36，其是序列為 AMADIGSQFMFRFTIHCSVTAAG DAYCYHGANGTSF的36肽)。但是該多肽Pl-A的生產(chǎn)和純化的難度以及成本都比較高，這制約了進(jìn)一步的研究和以后的產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的制備β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法存在純化難度大，成本高的不足，提供一種新的制備內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法，該方法可以大大降低內(nèi)酰胺酶抑制多肽的制備純化難度和成本。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和反復(fù)的試驗(yàn)，驚喜的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽Pl-A融合蛋白表達(dá)后需要經(jīng)腸激酶酶切除去His tag,該酶切效果并不理想，而且重組腸激酶的價(jià)格也比較高，這是造成多肽Pl-A純化的難度和成本都比較高的原因。而煙草蝕斑病毒(Tobacco etch virus，TEV)蛋白酶是另-種常用于切割融合蛋白的蛋白酶，對(duì)識(shí)別位點(diǎn)具有高特異性并在寬的溫度范圍里具有切割活性。因此，本發(fā)明人嘗試用TEV蛋白酶酶切位點(diǎn)替換腸激酶酶切位點(diǎn)來表達(dá)和純化β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白，首先構(gòu)建了含有TEV蛋白酶識(shí)別序列的Pl-A表達(dá)載體，然后利用TEV蛋白酶切策略純化多肽P1-A，同時(shí)，研究多肽Pl-A的分離純化工藝，制備純化的β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽最終達(dá)到了具有抑制肺炎克雷伯氏菌的效果，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的第一方面是一種制備內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法，包括以下步驟1)構(gòu)建一種表達(dá)β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的重組表達(dá)載體，該 β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白；2)用步驟1)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得轉(zhuǎn)化子；3)培養(yǎng)步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體，表達(dá)所述的His tag融合蛋白；4)用金屬螯合親和層析法從步驟幻所得的培養(yǎng)物中純化獲得His tag融合蛋白；5)用TEV蛋白酶酶切步驟4)純化得到的His tag融合蛋白；和6)用凝膠柱層析法從步驟幻得到的酶切物中分離純化獲得β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽。本發(fā)明中，步驟1)為構(gòu)建一種表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的重組表達(dá)載體，該β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白。其中，所述的載體是本領(lǐng)域的常用表達(dá)載體。本發(fā)明優(yōu)選質(zhì)粒pET3h，且其含有位于His tag序列和多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site，MCS)之間的TEV蛋白酶切割位點(diǎn)序列，以及在多克隆位點(diǎn)中插入了 β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的編碼序列。所述的β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽可以是本領(lǐng)域現(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽，如 SIPIS04-01、SIPIS04-01-N-TO0A-36、SIPIS04-01-N-TO0G-36、SIPIS04-01-N，本發(fā)明優(yōu)選的β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽是SIPIS04-01-N-Y50A-36，其編碼序列優(yōu)選如序列表中SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列(GGATCCTTCCGCTTTACCATTCACTGTTCTGTTACCGCAGCTGGCGATGCTTA CTGCTACCACGGTGCGAACGGTACTTCCTTC)。所述的TEV蛋白酶切割位點(diǎn)基因序列優(yōu)選如序列表中SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列(GAAAACCTGTACTTCCAGGGA)。TEV切割的氨基酸序列如序列表中 SEQID NO. 6 所示的序列(Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 丨 Gly)。本發(fā)明中，所述的β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的氨基酸序列優(yōu)選如序列表中SEQ ID NO. 2所示的序列。該β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的編碼序列優(yōu)選序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。所述的重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。本發(fā)明中，步驟幻為用步驟1)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得轉(zhuǎn)化子。 其中，所述的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域的常用宿主細(xì)胞，只要可以用于轉(zhuǎn)化和表達(dá)步驟1)中的表達(dá)載體即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌DH5CI。所述的轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。本發(fā)明中，步驟3)為培養(yǎng)步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體，表達(dá)所述的His tag融合蛋白。 其中，所述的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)方法以及重組蛋白的表達(dá)方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。本發(fā)明在宿主細(xì)胞為大腸桿菌的情況下，優(yōu)選用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)所述的His tag融合蛋白。本發(fā)明中，步驟4)為用金屬螯合親和層析法從步驟幻所得的培養(yǎng)物中純化獲得 His tag融合蛋白。其中，所述的金屬螯合親和層析法是純化His tag融合蛋白的常規(guī)方法，一般是鎳(Ni)柱層析。本發(fā)明中，表達(dá)的內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His-tag融合蛋白一部分以可溶性蛋白的形式存在，一部分以包含體的形式存在，因此，本發(fā)明可以選擇用金屬螯合親和層析帶有His-tag的可溶性蛋白的純化方法，也可以選擇用金屬螯合親和層析一步純化和復(fù)性包含體蛋白的純化方法。上述兩者都是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，本發(fā)明優(yōu)選后
者ο本發(fā)明中，步驟5)為用TEV蛋白酶酶切步驟4)純化得到的His tag融合蛋白。 其中，所述的TEV蛋白酶是本領(lǐng)域常規(guī)的TEV蛋白酶，可以是商品酶，可以是天然的TEV蛋白酶，也可以是經(jīng)過基因工程改造后的重組蛋白酶。所述的TEV蛋白酶的酶切方法也是本領(lǐng)域常規(guī)。本發(fā)明中，步驟6)為用凝膠柱層析法從步驟幻得到的酶切物中分離純化獲得內(nèi)酰胺酶抑制多肽。其中，所述的凝膠柱層析法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，是一種按分子量大小分離物質(zhì)的層析方法。本發(fā)明優(yōu)選Superdex凝膠柱，更優(yōu)選Superdex peptide 10/300GL 預(yù)裝柱(GE 公司)。洗脫液優(yōu)選含有 0. 15mol/L NaCl 的 0. lmol/L PBS, ρΗ7· 4。 該分離純化獲得內(nèi)酰胺酶抑制多肽(目標(biāo)多肽)較佳的的氨基酸序列為如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示的序歹Ij (GS FRFTIHCSVTAAGD A YC Y HGANGTSF)。本發(fā)明的第二方面是一種制備β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的方法，包括以下步驟1)構(gòu)建一種表達(dá)β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的重組表達(dá)載體，該 β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白；2)用步驟1)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得轉(zhuǎn)化子；和3)培養(yǎng)步驟2)所述的轉(zhuǎn)化體，表達(dá)所述的His tag融合蛋白。本發(fā)明的第三方面是一種表達(dá)β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的重組表達(dá)載體，該β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV 蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白。本發(fā)明的第四方面是一種β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白，該β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白。本發(fā)明的第五方面是一種DNA分子，其編碼β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白，是下列之一1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1所示；2)其編碼如序列表中SEQ ID NO. 2示的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的第六方面是一種轉(zhuǎn)化體，其含有如上所述的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的第七方面是如上所述的β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白在制備治療或預(yù)防細(xì)菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中，上述的本發(fā)明的第二至第七方面具有和本發(fā)明的第一方面一樣的常規(guī)方案和優(yōu)選方案。上述優(yōu)選方案在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明除特別說明之外，所用的百分比都是質(zhì)量百分比。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明制備純化內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法，表達(dá)的內(nèi)酰胺酶抑制多肽His tag融合蛋白親和層析分離出來后，用TEV蛋白酶酶切除去His tag純化標(biāo)簽。其中，TEV蛋白酶的酶切效果理想，并且所用的TEV蛋白酶的價(jià)格相對(duì)較低。因此內(nèi)酰胺酶抑制多肽的純化難度以及成本都大大降低，這促進(jìn)了 內(nèi)酰胺酶抑制多肽的進(jìn)一步的研究和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是Pl-A表達(dá)載體模型。圖2是質(zhì)粒pYG590的構(gòu)建示意圖。圖3是Pl-A基因表達(dá)載體pYG 590的PCR驗(yàn)證。1_3為以pYG590為模板擴(kuò)增的 Pl-A基因。圖4是pYG590/E. coli DE3誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE試驗(yàn)。1 菌體誘導(dǎo)前；2 菌體誘導(dǎo)后；3 菌體破壁離心后沉淀；4 純化洗脫液(NTA-200)。圖5是Pl-A-TEV融合蛋白的純化。1、5 手動(dòng)純化一次過柱；2_4，6 使用AKTA層析儀二次過柱。 圖6是TEV酶以及Pl-A-TEV融合蛋白的純化。1 :P1_A_TEV融合蛋白洗脫液 (NTA-200) ；2 TEV 純化洗脫液(NTA-100) ；3 TEV 純化洗脫液(NTA-200)。圖7是TEV酶切Pl-A-TEV融合蛋白圖。1-3為酶切液。圖8是酶切液凝膠過濾過程紫外檢測。曲線顯示的是^Onm的紫外吸收值(mAu)。圖9是酶切液凝膠過濾后洗脫液電泳。1-12 為自出峰后依次收集的洗脫液。圖10是改進(jìn)緩沖液后的酶切液凝膠過濾后洗脫液電泳。1-9 為大峰過后依次收集的洗脫液。圖11是小肽的純化工藝示意圖。圖12是體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn)流程圖。圖13是Pl-A-TEV融合蛋白及多肽P1-A對(duì)肺炎克雷伯氏菌的體內(nèi)抑制試驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。實(shí)施例1表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)l)pYG590 的構(gòu)建TEV酶特異性地識(shí)別Glu-Asn-Lys-Tyr-Phe-Gln-Gly氨基酸序列并在Gln-Gly之間進(jìn)行切割，新載體的構(gòu)建思路為將TEV酶的識(shí)別位點(diǎn)的編碼序列與多肽Pl-A基因相連然后克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，示意圖見圖1。設(shè)計(jì)分別帶有內(nèi)切酶BamHI和Sal I的限制性酶切位點(diǎn)的引物I^rimer5和 Primer6(見表1)。以pYG567 (參見中國專利申請(qǐng)200910054340. 1)為模板擴(kuò)增多肽Pl-A 基因。擴(kuò)增產(chǎn)物用BamHI和MlI進(jìn)行雙酶切，然后與同樣經(jīng)過雙酶切的pET3h-TEV質(zhì)粒(pET32a-TEV質(zhì)粒是本發(fā)明人在pET3h中克隆了 7個(gè)氨基酸序列的TEV識(shí)別位點(diǎn)，其制備方法是合成含 TEV 切割位點(diǎn)的序列 ccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtg ccgcgcggcagccatatgtctgaaaacctgtacttccagggatcc,兩端帶的醇切位點(diǎn)為 NcoI 和 BamHI, 雙酶切后插入到PET3M中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET3h-TEV)用1M-Ligase在16°C連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒PYG590，質(zhì)粒構(gòu)建圖見圖2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒用引物ft~imer5和ft~imer6通過PCR(見圖幻驗(yàn)證以及測序驗(yàn)證與設(shè)計(jì)相符。該重組表達(dá)載體增加了 TEV蛋白酶(31KDa)切割位點(diǎn)，便于高效率、高特異性的去除融合Trx. tag，該表達(dá)載體保留PET32載體啟動(dòng)所需的所有元件，同時(shí)利用rTEV蛋白酶具有的高剪切活性和特異性，去除掉tag的目的蛋白，因不與Ni-NTA純化柱(Cat. No. :SP1020, Solarbio)結(jié)合而流出，從而得到較高純度不含融合tag的目的蛋白，有利于后續(xù)的純化步驟。表1.引物序列
引物名稱序列用途Primer55，— gcggatccttccgctttaccattcactgttc—3，克隆Pl-A單拷貝基因至含有TEV 識(shí)別序列的載體Primer65，— acgcgtcgactagagaaagaggtgccattagcgcacc 一 3，2) Pl-A的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將構(gòu)建的表達(dá)載體pYG590轉(zhuǎn)化E. coli DE3，將含有重組表達(dá)載體pYG590的 E. coli DE3菌株接入含有100 μ g/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。按接種量將過夜培養(yǎng)的PYG567/DE3轉(zhuǎn)接入裝有IOOmlLB培養(yǎng)基(含Amp 100 μ g/ml)的250ml搖瓶，37°C，220rpm培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6后，加入IPTG (終濃度為0. 8mmol/L)誘導(dǎo)3h。將誘導(dǎo)前后菌體、細(xì)胞破壁后的殘留碎片以及純化洗脫液用SDS-PAGE電泳檢測顯示菌體誘導(dǎo)后出現(xiàn)大小約MKDa的融合蛋白，與設(shè)計(jì)相符。誘導(dǎo)表達(dá)的Pl-A-TEV融合蛋白的純化方法用天然金屬螯合親和層析帶有 His-tag的可溶性蛋白純化方法(1) 250ml誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)物離心獲得的細(xì)胞，用IOml NTA-O重懸，置于冰浴中超聲波破壁IOmin (500W，工作5s，間歇5s)。細(xì)胞破壁液于10，000r/min4°C離心25min (Hitachi Himac CR 21G型冷凍高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)子R12A)，取上清置于IOOml燒杯中。(2)加入aiil Ni-NTA樹脂(購自上海申能博彩公司)混懸液(含50 % V/V樹脂， 保存于20% V/V乙醇溶液中)，置于冰上(或在4°C冰箱中)用脫色搖床120r/min振蕩lh。(3)裝入層析柱，移去層析柱底端的帽子，上清液通過NTA柱，收集流出液用于電泳分析。(4)依次用 IOml NTA-O, IOml NTA_20，3ml NTA-60 以及 3ml NTA-80 洗滌層析柱， 洗去未結(jié)合的雜蛋白。(5)用NTA-200洗脫目的蛋白，分4次洗脫，每次Iml。(6)柱子的再生，先用IOml NTA-500沖洗柱子，再用IOml 20% (V/V)乙醇沖洗柱子，最后蓋上柱子底端的帽子，用0. 5ml 20%乙醇溶液重懸樹脂，4°C保存。樹脂可重復(fù)使用3 5次。應(yīng)用天然金屬螯合親和層析純化帶有His-tag標(biāo)簽的可溶性蛋白的方法可以純化到該融合蛋白，但是應(yīng)用該法每升培養(yǎng)液純化獲得Pl-A-TEV可溶性融合蛋白的量僅為 :3mg，而電泳顯示細(xì)胞破壁后的殘留物中目的蛋白的條帶很濃，這些結(jié)果說明pYG590經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的Pl-A-TEV融合蛋白僅有一部分具有可溶性，大部分以包含體的形式存在，電泳檢測圖見圖4。3) Pl-A-TEV融合蛋白包含體的純化由于大部分的Pl-A-TEV融合蛋白以包含體的形式存在，于是按照金屬螯合親和層析一步純化和復(fù)性包含體蛋白的方法純化目的蛋白，方法如下(1) 250ml誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)物離心獲得的細(xì)胞，用IOml NTA-O重懸，置于冰浴中超聲波破壁IOmin (500W,工作k，間歇5s)。細(xì)胞破壁液于8，000r/min4°C離心20min (Himac CR 21G型冷凍高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)子R12A，下同)，棄上清。取上清置于IOOml燒杯中。(2)用IOml UNTA-20重懸殘留物，置于冰浴中超聲波破壁IOmin (500W,工作5s，間歇5s)。細(xì)胞破壁液于室溫下放置30mins，然后10，000r/min離心25min，取上清置于燒杯中。(3)加入anl Ni-NTA樹脂混懸液(含50% V/V樹脂，保存于20% V/V乙醇中)， 置于脫色搖床上室溫120r/min振蕩孵育lh。(4)裝入層析柱，移去層析柱底端的帽子，上清液通過NTA柱，收集流出液用于電泳分析。(5)加入IOml UNTA-20洗去未結(jié)合的雜蛋白。(6)依次用8ml體積比分別為1 Ul 3、1 7的UNTA-20 NTA-20溶液沖洗，然后用8ml NTA-20沖洗，以逐步降低尿素的濃度使蛋白得到復(fù)性。(7)用細(xì)1 NTA-200洗脫目的蛋白，分4次洗脫，每次Iml。(8)樹脂的再生，先用IOml UNTA-500沖洗，再用IOml 20% (V/V)乙醇沖洗，最后蓋上層析柱底端的帽子，用0.5ml 20%乙醇重懸樹脂，4°C保存。樹脂可重復(fù)使用3 5次。SDS-PAGE電泳檢測顯示洗脫液中具有較濃的目的蛋白條帶。手動(dòng)純化的洗脫液透析后利用AKTA層析儀(GE health,緩沖液為0. 15mol/L氯化鈉，上樣量為包含體復(fù)性純化洗脫液，洗脫流速0. 8ml/min)進(jìn)行再一次親和洗脫也得到了 Pl-A-TEV融合蛋白，并且純度進(jìn)一步提高，見圖5。利用包含體復(fù)性法純化Pl-A-TEV融合蛋白，蛋白得率可以達(dá)到每升菌液15mg，而且相對(duì)于純化可溶性的Pl-A-TEV融合蛋白，復(fù)性法獲得的目的蛋白純度更高，蛋白電泳上顯示雜蛋白更少。4) TEV酶表達(dá)純化煙草蝕斑病毒(TEV)酶是另一種常用于切割融合蛋白的蛋白酶，它具有7個(gè)氨基酸識(shí)別位點(diǎn)，高特異性，為內(nèi)切酶，在寬的溫度范圍里具有活性。利用本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的TEV ^pRK793/E. coli DE3 (Joseph Ε.，Tropea, Scott Cherry and David S. Waugh. Expression and purification of soIubIeHis-Tagged TEV Protease. . Methods in molecular biology high throughput proteinexpression and purification,2009,498, 297-307)。按照Pl-A誘導(dǎo)表達(dá)以及天然金屬螯合親和層析純化帶有His-tag標(biāo)簽的可溶性蛋白的方法親和純化TEV酶，大小約^KDa,與文獻(xiàn)報(bào)道一致，電泳檢測見圖6。每分鐘每毫克蛋白分解Inmol底物為1U，所得的TEV的酶活為lU/mg。實(shí)施例2小肽的分離純化1)TEV酶酶切Pl-A-TEV融合蛋白將純化后的Pl-A-TEV融合蛋白用IOKDa的超濾管超濾(Amicon UltralOK device,MILLIP0RE公司)適當(dāng)濃縮至1. Omg/ml以上，使用實(shí)施例1新純化的TEV酶，按照下表2所示體系進(jìn)行酶切反應(yīng)，34°C水浴反應(yīng)1-1. 5h，切割效率可超過50%。表2. TEV酶酶切反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種制備β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法，其特征在于，包括以下步驟1)構(gòu)建一種表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的Histag融合蛋白的重組表達(dá)載體，該 β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白；2)用步驟1)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得轉(zhuǎn)化子；3)培養(yǎng)步驟幻所述的轉(zhuǎn)化體，表達(dá)所述的Histag融合蛋白；4)用金屬螯合親和層析法從步驟幻所得的培養(yǎng)物中純化獲得Histag融合蛋白；5)用TEV蛋白酶酶切步驟4)純化得到的Histag融合蛋白；和6)用凝膠柱層析法從步驟幻得到的酶切物中分離純化獲得內(nèi)酰胺酶抑制多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述的載體是質(zhì)粒ΡΕΤ3Μ，且其含有位于His tag序列和多克隆位點(diǎn)之間的TEV蛋白酶切割位點(diǎn)序列，以及在多克隆位點(diǎn)中插入了 β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的編碼序列。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的編碼序列是如序列表中SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；所述的TEV蛋白酶切割位點(diǎn)序列是如序列表中SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
4.一種制備β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟1)構(gòu)建一種表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的Histag融合蛋白的重組表達(dá)載體，該 β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白；2)用步驟1)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得轉(zhuǎn)化子；和3)培養(yǎng)步驟幻所述的轉(zhuǎn)化體，表達(dá)所述的Histag融合蛋白。
5.一種表達(dá)內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白的重組表達(dá)載體，其特征在于， 該β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白。
6.一種β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白，其特征在于，該β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白是β -內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白。
7.—種DNA分子，其編碼β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的His tag融合蛋白，其特征在于，是下列之一1)其核苷酸序列是序列表中SEQID NO. 1所示；2)其編碼如序列表中SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽。
8.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其含有如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體。
9.一種β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽，其特征在于，其氨基酸序列為如序列表中SEQ ID NO. 3 所示的序列。
10.如權(quán)利要求6或9所述的β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽或β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽Histag 融合蛋白在制備治療或預(yù)防細(xì)菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法及其中所用的表達(dá)載體、融合蛋白等。本發(fā)明制備β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的方法包括以下步驟1)構(gòu)建一種表達(dá)His tag融合蛋白的重組表達(dá)載體，該His tag融合蛋白是β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽-TEV蛋白酶切割位點(diǎn)-His tag的融合蛋白；2)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得轉(zhuǎn)化子；3)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，表達(dá)所述的His tag融合蛋白；4)用金屬螯合親和層析法純化獲得His tag融合蛋白；5)用TEV蛋白酶酶切His tag融合蛋白；和6)用凝膠柱層析法分離純化獲得β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽。本發(fā)明中TEV蛋白酶的酶切效果理想，并且所用的TEV蛋白酶的價(jià)格相對(duì)較低，因此β-內(nèi)酰胺酶抑制多肽的純化難度以及成本都大大降低。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102443593SQ20101050522
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者朱寶泉, 朱春寶, 胡又佳, 許明飛, 謝麗萍 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院