專利名稱：奶乳制品細菌含量電子快速檢測儀及其檢測方法
奶乳制品細菌含量電子快速檢測儀及其檢測方法技術領域
本發(fā)明屬于電子檢測領域，涉及微生物檢測儀器和檢測方法，具體是一種奶乳制 品細菌含量電子快速檢測儀及其檢測方法，應用于奶乳制品細菌含量的快速檢測。技術背景
微生物測量在食品、臨床醫(yī)學和環(huán)境檢測等諸多領域具有非常重要的意義，對微 生物活細胞的快速檢測更是一個令人關注的課題。測量生活飲用品的細菌含量，國際上公 認的有標準平板培育法和顯微鏡直接觀察法。其缺點是測量需要熟練的操作技能，測量時 間長。因此對于要求迅速性和多體的檢測對象，顯然不適宜采用上述兩種方法。
多年來，國內外的微生物學家、物理學家、電子信息和化學科學家充分利用微生物 的熱學、光學、電化學和生物電化學性質，提出了一系列新型微生物快速檢測方法。并根據(jù) 檢測原理和方法將其分為三大類。
第一類為傳統(tǒng)的微生物測定方法。該方法包括上述的標準平板培育法、顯微鏡直 接觀察法、干重法和細菌長度測定法等。其缺點為操作繁瑣、測定時間長。
第二類為非生物電化學方法。該方法的檢測原理是基于微生物及生物過程中的一 些物理性質。最常見的有生物發(fā)光法、粘度法、微量量熱法、免疫熒光測定法、酶聯(lián)免疫吸 附測定法、質譜法和拉曼光譜法等。其缺點是對菌種的選擇性較高，只適用于特定菌種的 測量，技術要求高，所需的測量儀器復雜，設備成本高，操作繁瑣，精確度差，故很難得到實 際的推廣和普遍的應用。如美國Hygiena生產(chǎn)的Pi_102食品細菌快速測定儀，該檢測儀 采用ATP生物發(fā)光法和美國BENTLEY公司最新推出的半自動牛奶細菌計數(shù)儀BactoCoimt IBC-M，該檢測儀采用熒光法檢測
第三類為生物電化學方法。該方法的原理是通過電極測定生物量產(chǎn)生或消耗的電 荷，從而得出要分析的電信號。微生物在滋生代謝過程中，培養(yǎng)基的電化學性質如電流、電 位、電阻和電導等會發(fā)生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化，實現(xiàn)對微生 物的快速測定。常見的有電位分析法、電流分析法、阻抗分析法、方波極普法等。由于生物 電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性好等特點。這 種方法得到了國內外學者的高度注視，在國內外的相關科學技術期刊上已有大量的研究論 文報導。
1979年Matsimaga首次使用燃料電池型電極系統(tǒng)對培養(yǎng)液中的細菌數(shù)目進行了 快速測定，響應時間為15min。1988年Ramsay等人首次利用伏安型細胞傳感器進行了菌數(shù) 濃度的測定，實驗菌種為E. Coli,響應時間為lmin，在對生肉和廢水中微生物濃度的監(jiān)測 上獲得成功。1992年許春向等人研制出可連續(xù)監(jiān)測啤酒發(fā)酵罐中酵母菌總數(shù)的燃料電池型 細胞傳感器，響應時間為5min。2000年，蔡豪斌等用伏安型細胞傳感器對牛奶中的菌數(shù)進 行了檢測，文章《微生物活細胞檢測生物傳感器的研究》發(fā)表在《華夏醫(yī)學》。上述技術均存 在一些弊端，例如測量精度不高，國內尚沒有進入實際應用。
目前國際上更多的國家特別是西歐國家的許多企業(yè)采用色素還原試驗法?！吧剡€原試驗法”的原理是由于細菌增生而耗氧，使試樣牛奶之類的氧化還原電位降低，若把隨 還原而變色的色素預先加在不致防礙細菌生育的試樣內，就能測得試樣中的細菌活性，即 生存的細菌數(shù)目。該方法取定量試樣和一定色素放入試管混合，在熱水浴內放置30分鐘后 取出，在自然光或白晝色有熒光燈光下選取乳白色的背景，按照所給出的色標表進行比色 以測定細菌數(shù)。如果所顯示的色調介于表中所列之間，則讀取接近色標的細菌數(shù)。比色判 斷須在從熱水浴內取出時立刻進行。
色素還原試驗法實質上就是測定按細菌還原能力發(fā)生的色素色調變化。其優(yōu)點 是不需要特殊器具，操作簡便，同時能檢測多體。但仍存在如下缺點(1)由于色素的生色 靈敏度低，因而不能迅速測量。( 在培育時間內各種細菌的增生并非一致，特別是當存在 抗性之類的物質時，這一傾向尤為顯著。( 因為生色不連續(xù)，所以只能不連續(xù)測定。(4) 由于測定者是用目視判斷色調，因而難免因人而異，影響測量精度。( 氧化還原色素只能 用生色性色素。
至今為止，國內各地區(qū)奶乳品生產(chǎn)企業(yè)和相關的質檢部門，在對其鮮奶、酸奶及各 種飲品的細菌含量檢測過程中，一直沿用傳統(tǒng)的平板細菌培育檢測法，而這種方法不僅操 作煩瑣，而且需要耗費大量的人力和物力，更重要的是檢測結果的時間滯后，極大的影響著 這些企業(yè)和質檢部門的經(jīng)濟效益和工作效率。發(fā)明內容
傳統(tǒng)的檢測方法的缺點是測量時間長，測量要求的技術水平高，測量的精度低，不 適合即時檢測，而國外的檢測設備的測量設備雖在精度上有部分改進，但設備價格高，檢測 成本高。為解決這些問題，本發(fā)明根據(jù)生物電化學原理，發(fā)明了奶乳制品細菌含量電子快速 檢測儀，所述電子快速檢測儀的組成包括生物電池盒與電測裝置，其中生物電池盒由恒溫 槽，微生物電池組成；恒溫槽以紫銅管為主體，管壁繞有電熱絲，在控制器的控制下將銅管 內的空氣溫度調節(jié)在25°c，微生物電池安置于恒溫槽內，微生物電池內設置鉬陰極，過氧化 銀陽極，離子交換膜，底物和磷酸緩沖液，所述電測裝置由微電流放大電路、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、 驅動裝置、記錄裝置和顯示裝置構成；微電流放大電路與鉬陰極和過氧化銀陽極連接，將微 生物電池產(chǎn)生的電流放大，放大電流經(jīng)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采集、分析、輸出到顯示裝置，實時顯 示電流值和細菌數(shù)目值的數(shù)值和曲線。
基于檢測儀器，本發(fā)明提供了奶乳制品細菌含量檢測的新方法，將生物電池原理 應用于色素還原試驗法，研究細菌在輔酶催化下氧化還原反應過程和電子發(fā)生過程，基于 細菌的氧化還原反應過程中生成的電子數(shù)與細菌數(shù)量統(tǒng)計上成正比，通過對細菌中氧化還 原作用中生成的電子數(shù)的計測實現(xiàn)細菌數(shù)的測量，具體方法是向底物中加入生物輔酶煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸NAD+和黃素腺嘌呤二核苷酸FAD+兩個平行的氧化還原反應酶，通過煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸NAD+催化底物轉化和黃素腺嘌呤二核苷酸FAD+催化輔酶循環(huán)再生，促進 底物與生成物之間的氧化還原過程；再向底物加入電子激勵劑亞甲蘭，用以減少微生物細 胞中含有的多種酶對底物響應產(chǎn)生的干擾，提高氧化還原反應速度，維持輸出電流的穩(wěn)定， 縮短了檢測時間提高測量精度。
檢測電極采用鉬電極和銀電極，選用運算放大器設計了微電流放大電路和相關的 輔助電路，對放大器輸出結果采用了根據(jù)USB6008數(shù)據(jù)采集卡設計的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，通過編寫程序實現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集、分析、結果輸出顯示和控制。在奶乳制品中細菌含量電子快速檢 測儀的顯示部分，采用C語言在Labwindows/CVI軟件開發(fā)平臺上編寫程序，開發(fā)出數(shù)字和 圖形均可直觀、實時顯示的人機操作界面，實現(xiàn)了電流值和細菌數(shù)目值的數(shù)值型和曲線型顯不。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比較，其有益效果如下
1、本發(fā)明的檢測儀技術指標為
(1)在20分鐘內，能快速測定鮮奶及相關飲料中的細菌含量，測量細菌數(shù)范圍 IO3-IO12,測量精度誤差不超過士 5% .
( 20分鐘內，快速測定酵母菌中的雜菌。測量精度誤差不超過士3% .
(3)通過控制電路或輔酶劑量調節(jié)測量速度。
(4)自動數(shù)字顯示輸出并進行監(jiān)測，適時監(jiān)測電池盒底物溫度進行實時控制，溫度 控制精度士 1%。
本發(fā)明的技術指標和普遍采用的平板細菌培育檢測法相比，提高了檢測速度，簡 化了操作過程，與色素還原法相比較結果更加精確。與目前國外的相關產(chǎn)品相比較，如美國 生產(chǎn)的“NHD食品細菌快速分析儀(72萬元)和丹麥生產(chǎn)制造的”FC牛奶細菌總數(shù)快速分 析儀(140萬)，本裝置價格便宜，測量成本低，速度快等優(yōu)點。


圖1細菌代謝與電子發(fā)生的過程說明圖
圖2亞甲蘭單體氧化還原機理
圖3激勵劑與輸出電壓的實驗曲線圖
圖4生物檢測儀的結構原理圖
圖5微電流放大器電路
圖6人機界面
圖7牛奶中細菌含量的電子快速檢儀試驗樣機
具體實施過程
細菌在分解和合成代謝中能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，在細菌的鑒定及生化反應中有實 際意義。細菌的分解代謝產(chǎn)物因不同種類細菌具備的酶不完全相同。各代謝產(chǎn)物可通過生 化試驗的方法檢測。細菌代謝所需能量，絕大多數(shù)是通過生物氧化作用而獲得的。所謂生 物氧化即在酶的作用下生物細胞內所發(fā)生的系列氧化還原反應。其工作原理是
S+E — SE — P
式中S為底物；E為酶；SE為復合物；P為產(chǎn)物，這類檢測儀應用不同的基礎電極， 通過電流、電壓、電導信號檢測酶促反應的產(chǎn)物。本發(fā)明將生物電池應用于色素還原試驗 法，由于細菌數(shù)量和氧化還原反應過程中產(chǎn)生的電子數(shù)成正比關系，通過對細菌中氧化還 原作用中生成的電子數(shù)的計測實現(xiàn)細菌數(shù)的測量。
氧化還原機理
生物活動的能量主要來源是有機物質糖、蛋白質或脂肪在生物體內的氧化。我們 把糖、蛋白質、脂肪等有機物質在生物活細胞里進行氧化分解，最終生成(X)2和H2O,同時釋 放大量能量的過程稱生物氧化。高等動物通過肺部進行呼吸，吸入氧，排出二氧化碳，吸入氧用來氧化攝入體內的營養(yǎng)物質獲得能量，微生物則以細胞直接進行呼吸，因此生物氧化 又稱組織呼吸、細胞呼吸。生物氧化包括細胞呼吸作用中的一系列氧化還原反應。
糖、蛋白質、脂肪等有機物在生物體內徹底氧化之前，總是先進行分解代謝。它們 的分解代謝途徑是復雜而又不相同的，但它們在徹底氧化為CO2和H2O時，都經(jīng)歷一段相同 的終端氧化過程，也就是狹義的生物氧化，即代謝中間物脫氫生成的還原型輔酶(NADH和 FADH2)中的H經(jīng)電子傳遞鏈(呼吸鏈)傳遞給分子氧生成水，電子傳遞過程伴隨著二磷酸 腺苷(ADP)磷酸化生成三磷酸腺苷(ATP)。
代謝物上的氫原子被細菌體內脫氫酶激活脫落后，經(jīng)過一系列的傳遞體，最后傳 遞給被激活的氧分子而生成水的全部體系稱為電子傳遞鏈)或電子傳遞體系，又稱呼吸 鏈。
在該生物電池盒中本發(fā)明采用了酶耦聯(lián)法，即利用了兩個平行的氧化還原反應酶 系統(tǒng)，即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)以下簡稱NAD+催化底物轉化和黃素腺嘌呤二核苷 酸(FAD+)以下簡稱FAD+催化輔酶循環(huán)再生，NAD+及FAD+是生物氧化體系的重要組成成 分，在傳遞氫原子或電子中有著重要作用。
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+為輔酶，這類酶催化脫氫時，其輔酶NAD+先和酶的活 性中心結合，它與酶脫下的氫結合而還原成NADH。當有受氫體存在時，NADH上的氫可被脫 下而氧化為NAD+。其傳遞氫機制是當其接受代謝物脫下的一對氫原子時，就由氧化劑NAD+ 變?yōu)檫€原型NADH和H+，NAD+結構中吡啶環(huán)接受一個氫原子和一個電子后，氮原子就由五價 變成三價，而H+則游離于介質中。這種轉移是可逆的，如下式所示
AH2+NAD+ — A+NADH+H+
黃素腺嘌呤二核苷酸FAD作為輔基。FAD與酶蛋白結合是較牢固的。這些酶所催 化的反應是將底物脫下的一對氫原子直接傳遞給FAD而形成FADH2。其傳遞氫的機制是FAD 的異咯嗪環(huán)上第1位及第10位兩個氮原子能反復地進行加氫和脫氫反應，因此FAD同NAD+ 的作用一樣，也是遞氫體?，F(xiàn)以SH2代表還原式底物，E-FAD代表具有FAD輔基的酶，其反應 可表示如下
sh2+e-fad — s+e-fadh2
在電子傳遞鏈中的NADH脫氫酶，它的輔基是FAD，它催化的反應是將NADH上的電 子傳遞給電子傳遞鏈的下一個成員——輔酶Q ；
研究中，細菌的代謝與電子發(fā)生的過程如圖1所示
圖1中，加入到底物中的輔酶(1)為NAD+，輔酶⑵為FAD+，均起催化作用。底物 中的氫H+因輔酶(1)的催化作用向NAD+遷移形成NADH。并可還原成NAD+。另外，NADH因 輔酶O)的催化作用而氧化，使FAD+受H。從而FAD+還原為FADH。對上述氧化還原作用反 復使之進行。同時，由輔酶向輔酶輸送H+，最終與同樣運行的氧(0)結合而形成H2O.可是， 此H+在輔酶間的授受，即在氧化還原作用中，還同時存在電子(e_)的授受。如圖1所示，通 過陰極和陽極的受理氧化還原作用中的電子(電子傳遞鏈形成的電流)，就能通過電流值 的變化測定細菌量。
輔酶FAD+由陰極氧化而為
4FADH — 4FAD+4H++4e"(1)
陰極因有電子移動而為負電極。陽極表面產(chǎn)生(1)式的變化，導致陰極和陽極間的電子失衡，電子(e_)便由陰極向陽極移動。陽極表面溶液中的氫離子便由陽極(A^O2)吸 收電子而形成氫離子。用Ag2A作為減極劑，便可將氫原子直接變成水。
其化學式為
Ag202+4H — 2Ag+2H20 (2)
綜合反應式為
4FADH+Ag202 — 4FAD+2Ag+2H20 (3)
電子媒介體激勵機理
試驗證明電子在裸電極與NADH之間傳遞具有很高的超電勢，大約為IV，高電勢常 常引起電極污染，酶失活，副反應如羥基的氧化、產(chǎn)生無活性NAD (P)等問題。解決的方法是 加入電子激勵劑，經(jīng)過研究選用亞甲蘭氧化還原色素作為電子激勵劑。甲蘭單體的氧化還 原機理如圖2所示。輔酶中的電子首先就受到電子激勵劑的激勵，其次，陰極鉬也相繼受到 激勵，這樣能使其氧化反應加快，輸出電流明顯。
電子轉移的難易和速度決定著生物電池盒的性能。一般的氧化還原酶，都含有一 個或幾個氧化還原中心，然而在絕大多數(shù)酶中，氧化還原中心通常處于內部，有的酶外部還 有一層糖蛋白，這種結構阻止了反應中心與電極表面間的電子轉移及還原性輔酶的有效循 環(huán)。在加入電子媒介體后，連在主鏈上的媒介體有較大的活動自由度，這就便利了媒介體在 酶和電極之間的擴散，使媒介體與活性中心及電極表面接觸的幾率明顯提高，從而加快了 電子傳遞速率。
試驗中我們比較了細菌含量在IO5個/ml內，添加電子激勵劑和未加電子激勵劑 時亞甲蘭對電極響應的影響。如圖3所示。其中L為添加電子激勵劑、H為不添加電子激 勵劑的細菌與電極輸出電壓的關系曲線圖。從圖中可以看到在有電子激勵劑時，生物傳感 器對電極的響應比沒有電子激勵劑時的靈敏度高的多。這是因為輔酶中的電子受到電子激 勵劑的激勵，同時也激勵電極降低了氧化電勢的結果。
本發(fā)明的測量裝器包括生物電池盒和電測裝置。生物電池盒如圖4所示由恒溫 槽1和微生物電池4組成；恒溫槽以直徑為10厘米的紫銅管為主體，管壁繞有電熱絲，在控 制器控制調節(jié)銅管內的空氣溫度保持在25 °C，微生物電池4安置于恒溫槽1內，微生物電池 內設置陰極2，陽極3，在陰極和陽極之間設置了陰離子交換膜5，底物6和磷酸緩沖液7，陰 離子交換膜5用于防止電池內的被測底物6與磷酸緩沖液7交融，但可進行陰極與陽極間 的離子交換。陰極采用不受底物影響的貴重金屬鉬，而陽極采用不致引起極化作用的過氧 化銀。磷酸緩沖液通常采用用0. 1克分子濃度單位。生物電池盒形成的電流極其微弱，故 在鉬陰極和過氧化銀陽極輸出端用運算放大器設計制作了微電流放大電路，將微生物電池 產(chǎn)生的電流放大，微電流放大器的電路如圖5，芯片引腳7接-7. 5V電源、引腳11接+7. 5V 電源，芯片引腳4、5通過^Ω的電阻接電池盒的正負極，引腳1、2接電容0. IyF的電容和 公共端引腳8相連，電容C11、C12、C13分別為隔直電容，在電路中起濾波作用，使電路中的 直流電平短路掉。阻值IOOkQ的電阻R3、R23、RM為串聯(lián)負反饋，用以穩(wěn)定輸出電壓，通過 該電路電流大小被放大了 13. 3倍。
所述電測裝置由微電流放大電路、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、驅動裝置、顯示裝置、記錄裝置 構成。電池盒的陰極和陽極輸出的電流經(jīng)過微電流放大電路放大，通過數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)對數(shù) 據(jù)進行處理，通過人機操作界面對電流/電壓值和細菌數(shù)目值進行數(shù)字型和曲線型直觀、實時顯示和控制，其界面如圖6所示。
鮮奶污染細菌含量電子快速檢測儀樣機如圖7所示。
檢測實例
采用該檢測儀分別對銀橋袋裝奶和酵母片的細菌進行了測量，所得數(shù)據(jù)如下
1.牛奶中污染菌與檢測儀輸出電流和電壓數(shù)據(jù)
在微生物電池的陽極區(qū)域加入IOml含菌牛奶，加入生物輔酶煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸NAD+和黃素腺嘌呤二核苷酸FAD+的量各0. 5ml，亞甲蘭為1ml。
牛奶中污染菌檢測儀輸出電流和電壓數(shù)據(jù)如表1 :
表 權利要求
1.一種奶乳制品細菌含量電子快速檢測儀，采用生物電池檢測鮮奶污染細菌含量，其 特征在于該檢測儀包括生物電池盒與電測裝置，所述生物電池盒由恒溫槽(1)，微生物電 池(4)組成；恒溫槽以紫銅管為主體，管壁繞有電熱絲，在控制器控制調節(jié)銅管內的空氣 溫度，微生物電池⑷安置于恒溫槽(1)內，微生物電池內設置鉬陰極0)，過氧化銀陽極 (3)，離子交換膜(5)，底物(6)和磷酸緩沖液(7)，所述電測裝置由微電流放大電路(8)、數(shù) 據(jù)采集系統(tǒng)(9)、驅動裝置(10)、記錄裝置(11)和顯示裝置(1 構成；微電流放大電路(8) 與鉬陰極和過氧化銀陽極連接，將微生物電池產(chǎn)生的電流放大，放大電流經(jīng)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng) (9)采集、分析、輸出到顯示裝置(12)，實時顯示電流值和細菌數(shù)目值的數(shù)值和曲線。
2.根據(jù)權利要求1所述的奶乳制品細菌含量電子快速檢測儀，其特征在于微電流放 大電路⑶由運算放大器與外圍電路構成，外圍電路由電容C11、C12、C13分別為隔直電容， 濾除電路中的直流電平，電阻R3、R23、R24為串聯(lián)負反饋電阻，用以穩(wěn)定輸出電壓，通過微 電流放大電路將電流放大13. 3倍。
3.應用權利要求1所述的奶乳制品細菌含量電子快速檢測儀檢測奶乳制品細菌含量 的方法，其特征在于基于細菌的氧化還原反應過程中生成的電子數(shù)與細菌數(shù)量統(tǒng)計上成 正比，通過對細菌中氧化還原作用中生成的電子數(shù)的計測實現(xiàn)細菌數(shù)的測量，將微生物電 池原理應用于色素還原試驗法，向底物中加入生物輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+和黃素 腺嘌呤二核苷酸FAD+兩個平行的氧化還原反應酶，通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+催化底 物轉化和黃素腺嘌呤二核苷酸FAD+催化輔酶循環(huán)再生，促進底物與生成物之間的氧化還原 過程；再向底物加入電子激勵劑亞甲蘭，用以減少微生物細胞中含有的多種酶對底物響應 產(chǎn)生的干擾，維持輸出電流的穩(wěn)定，提高測量精度。
全文摘要
本發(fā)明涉及奶乳制品細菌含量電子快速檢測儀及其檢測方法，屬于電子檢測領域，用于奶乳制品細菌含量的快速檢測。檢測儀包括生物電池盒與電測裝置，生物電池盒由恒溫槽，微生物電池組成；微生物電池安置于恒溫槽內，微生物電池內設置鉑陰極，過氧化銀陽極，離子交換膜，底物和磷酸緩沖液，微電流放大電路連接兩電極，將微生物電池產(chǎn)生的電流放大，提高測量精度。電測裝置由微電流放大電路，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，驅動裝置，顯示裝置和記錄裝置構成。放大電流經(jīng)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采集、分析、輸出到顯示裝置，實時顯示電流值和細菌數(shù)目值的數(shù)值和曲線。所述檢測方法通過向底物加入生物輔酶NAD+和FAD+及添加電子激勵劑亞甲蘭促進氧化還原反應，維持輸出電流的穩(wěn)定。
文檔編號C12Q1/06GK102031283SQ201010505139
公開日2011年4月27日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權日2010年10月12日
發(fā)明者何曼曼, 候建強, 盧智遠, 周佳社, 岳滿芝, 牛中奇, 魏清清 申請人:西安電子科技大學