專利名稱：抗結(jié)核桿菌esat-6單克隆抗體tbef3及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6) 的單克隆抗體的制備及應用，是利用細胞工程、抗體工程技術(shù)，獲得分泌抗ESAT-6的單克 隆抗體的雜交瘤細胞系，通過同品系的小鼠誘導腹水，制備抗EAST-6的單克隆抗體TBEF3， 鑒定為IgM、κ型，再通過親和純化、電泳、免疫等技術(shù)實現(xiàn)對該抗體的應用。
背景技術(shù)：
結(jié)核早期診斷技術(shù)是一直困擾醫(yī)學診斷領(lǐng)域的一個重要難題。20世紀，因抗生素 研究的發(fā)展和廣泛應用，人類曾成功地控制了結(jié)核病。但是，由于抗藥性不斷出現(xiàn)與積累， 結(jié)核分枝桿菌對于21世紀的人類依然是一個現(xiàn)實威脅。更嚴重的是，近年來，全球人類免 疫缺陷病毒(HIV)和艾滋病(AIDS)的流行已成為全球結(jié)核病發(fā)病率及死亡率第三次回升 的主要原因，同時結(jié)核病也是AIDS病人最常見的機會感染和致死病因。結(jié)核病和艾滋病并 發(fā)的趨勢，使得治療難上加難。診斷是治療的前提，如果能夠早期診斷，結(jié)核病的危害會大 幅度減小。中國作為結(jié)核菌高感染率地區(qū)和HIV感染的快速增長地區(qū)，提高結(jié)核病及HIV/ AIDS合并結(jié)核感染的早期準確診斷水平刻不容緩。傳統(tǒng)的早期診斷手段是結(jié)核菌素皮試。這是基于遲發(fā)型超敏反應原理的一種皮膚 試驗。但是兩個缺陷使得這種診斷方法的意義非常有限。其一該方法不能區(qū)分曾經(jīng)感染 過結(jié)核桿菌的健康者與結(jié)核桿菌正在活動的發(fā)病者；其二 該方法不能區(qū)分結(jié)核桿菌的感 染者與卡介苗的注射者。所以，傳統(tǒng)的早期診斷方法只能提供非常有限的參考信息，確診往 往要等到病人出現(xiàn)結(jié)核病灶之后。而這時候再做治療已經(jīng)晚了，特別是對耐藥結(jié)核桿菌，病 人預后很差。ELISP0T技術(shù)帶來了結(jié)核病早期診斷的革命。其一，由于ELISP0T方法采用結(jié)核 分枝桿菌特異性的多肽，可以避免卡介苗注射者的交叉反應；其二，由于ELISP0T檢測的 是病人當時的細胞免疫水平，可以有效區(qū)別健康的TB攜菌者與發(fā)病的TB活動病人。但是 ELISP0T檢測步驟繁瑣，需要特殊儀器設(shè)備且試劑昂貴，在多數(shù)低收入的結(jié)核高負擔國家和 地區(qū)較難推廣。發(fā)展一種快速、靈敏的結(jié)核早期診斷方法已迫在眉睫。基于以上背景，本項目選定 目前公認的結(jié)核分枝桿菌特異抗原蛋白ESAT-6為靶抗原，利用現(xiàn)代生物信息學和分子生 物學技術(shù)，設(shè)計并合成幾段候選的ESAT-6特異的抗原肽序列，采用融合雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn) 定分泌抗結(jié)核分枝桿菌特異抗原蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系，并大量制備、純化和鑒 定這些單克隆抗體。該單克隆抗體的成功獲得，為建立新型的結(jié)核病診斷方法——基于免 疫學技術(shù)的診斷奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。同時對疾病發(fā)病機理、診斷、預后及療效判定等方面的研究 起到重要作用。本發(fā)明用到雜交瘤細胞技術(shù)。該技術(shù)將免疫小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融 合，以建立分泌均質(zhì)抗體的雜交瘤細胞系，也稱為單克隆抗體技術(shù)。該技術(shù)涉及到動物免 疫、細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞克隆培養(yǎng)和免疫測定等一系列方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的單 克隆抗體，具有 SEQ No. 1 的氨基酸序列Met Thr Glu Gln GlnTrp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala0該單克隆抗體亞型為IgM、κ型，命名為TBEF3，能特異性識別結(jié)核分枝桿 菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的aa 1-14MTEQQWNFAGIEAA抗原肽序列?？菇Y(jié)核分枝 桿菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)的單克隆抗體雜交瘤細胞已由中國典型培養(yǎng)物保藏 中心保藏；地址中國武漢武漢大學；保藏日期2010年8月17日；培養(yǎng)物名稱、株號和符 號(包括基因型)結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)單克隆抗體雜交瘤細胞 TBEF3(IgM、κ 型)，保藏編號為=CCTCC NO :C201080。本發(fā)明的第二個目的是提供抗ESAT-6單克隆抗體的制備方法，通過以下步驟和 技術(shù)方案實現(xiàn)(1)動物的免疫選擇6周齡的BALB/C小鼠，以抗原肽(ESAT-6的第1_14位氨基 酸，14肽MTEQQWNFAGIEAA)對小鼠進行免疫。14肽MTEOQWNFAGIEAA通過固相法合成，在美 國ABI公司的多肽合成儀(431A)上進行，采用Fmoc (9-芴甲氧羰基)方案，合成步驟按照 ABI公司的多肽合成操作手冊進行。經(jīng)高效液相色譜純化，純度> 95%，序列鑒定通過質(zhì)譜 分析。(2)小鼠骨髓瘤細胞的培養(yǎng)培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細胞SP2/0并使之保持良好的生長 狀態(tài)用于細胞融合。(3)細胞融合采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞， 在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞于96孔培養(yǎng)板，含20 % FCS的HAT培養(yǎng)基培 養(yǎng)一天，取(1)中小鼠的脾臟淋巴細胞和(2)中小鼠的骨髓瘤細胞，將上述兩種細胞混合離 心，然后以聚乙二醇(PEG 6000)介導細胞融合，融合后的細胞適當稀釋，接種至飼養(yǎng)細胞 培養(yǎng)板，適當條件培養(yǎng)。(4)雜交瘤細胞的篩選將上述培養(yǎng)物在HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在細胞集落 長到大小合適時，吸取細胞培養(yǎng)上清液做抗體鑒定，篩選陽性克隆。(5)雜交瘤細胞的克隆化以有限稀釋法克隆雜交瘤細胞，將稀釋到一定密度的 細胞接種至96孔板，使每孔只有一個細胞生長。形成細胞集落的孔取培養(yǎng)上清液做酶聯(lián)免 疫吸附實驗(ELISA)，鑒定陽性克隆。重復有限稀釋克隆若干次，直到雜交瘤細胞的陽性孔 率達到100%。將克隆化后的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)做抗體鑒定及理化性狀分析。(6)單抗腹水的誘導在接種雜交瘤細胞前一周，給BALB/C小鼠腹腔注射降植烷 每只0. 5ml，然后每只接種5X IO6陽性雜交瘤細胞，10天后收集腹水離心，測定抗體效價， 并純化單克隆抗體。(7)單克隆抗體的純化利用Protein L親和純化法純化腹水中的單克隆抗體。(8)本發(fā)明得到一個產(chǎn)生抗ESAT-6單克隆抗體的雜交瘤細胞系，即TBEF3，TBEF3 雜交瘤細胞系經(jīng)3次克隆化，持續(xù)培養(yǎng)六月余，分泌抗體穩(wěn)定。該細胞株經(jīng)液氮凍存，復蘇 后生長良好，抗體分泌未見衰退。ELISA間接法測得TBEF3培養(yǎng)上清效價為1 256，腹水 效價分別為1 8192。經(jīng)單克隆抗體免疫球蛋白亞型分析顯示該雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體 類型均為IgM。TBEF3已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號是CCTCC NOC201080。本發(fā)明提供產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞，它是由免疫的BALB/c小鼠脾細胞和 小鼠骨髓瘤細胞SP2/0經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復凍存、復蘇后獲得的小鼠雜交瘤細 胞系TBEF3，能穩(wěn)定分泌抗ESAT-6的單克隆抗體TBEF3。該雜交瘤細胞系已在中國典型培 養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為=CCTCC No. C201080。本發(fā)明的另一個目的是提供該單克隆抗體TBEF3在結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗 原靶蛋白檢測和樣本中的ESAT-6蛋白的表達水平進行定性和定量中的應用，通過下述途 徑實現(xiàn)①以單克隆抗體TBEF3為探針，用SDS-PAGE電泳通過免疫印跡方法(Western Blot)方法，對結(jié)核桿菌及其培養(yǎng)物、各種體液樣本、基因重組及人工合成樣本中的ESAT-6 蛋白的情況進行鑒定。②以單克隆抗體TBEF3為結(jié)合抗體，用免疫沉淀方法來鑒定上①所述試驗樣本中 ESAT-6的表達。③以單克隆抗體TBEF3作為包被抗體或檢測抗體，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)對結(jié)核桿菌培養(yǎng)物、各種體液樣本、基因重組及人工合成樣本中的ESAT-6蛋白的 表達水平進行定性和定量分析。本發(fā)明的優(yōu)點在于提供了一種抗結(jié)核分枝桿菌特異抗原ESAT-6的單克隆抗體， 尚未見文獻報道。制備方法簡單易行，更為重要的是該方法制備的單克隆抗體可以有多種 用途，如對臨床和實驗室的結(jié)核分枝桿菌的細菌培養(yǎng)物、結(jié)核分枝桿菌、臨床體液樣本、基 因重組蛋白中ESAT-6分子表達情況進行定性和定量分析，以及各種研究用途。說明書附1為單克隆抗體TBEF3的免疫球蛋白亞型分析。圖2采用免疫沉淀和western-blot方法檢測重組ESAT-6/CFP-10融合蛋白、結(jié)核 分枝桿菌和其它分枝桿菌及其培養(yǎng)上清液等樣本中ESAT-6蛋白的表達。圖3用單抗作為包被抗體，重組ESAT-6/CFP-10融合蛋白作為標準抗原的酶聯(lián)免 疫吸附試驗標準反應曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1.抗ESAT-6的單克隆抗體的制備方法(1)小鼠的免疫首次免疫，將交聯(lián)KLH的ESAT-6的14肽(序列 aal-14MTEQQWNFAGIEAA)以弗氏完全佐劑乳化，第2、3次以不完全佐劑乳化，每BALB/C小鼠 0. 2ml (含ESAT-6抗原肽200 μ g)，背部皮內(nèi)多點注射，每兩周一次。6周后加強免疫一次， 于3天后進行細胞融合。(2)小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的培養(yǎng)把來自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤細胞株以 含10% FBS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，在含5% CO2飽和濕度的37°C孵箱中培養(yǎng)。融合前一天 傳代以保證融合時細胞進入對數(shù)生長期。(3)細胞融合以BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞，在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞于96孔培養(yǎng)板，含20 % FCS的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，次日取脾臟， 置200目不銹鋼篩網(wǎng)中，剔除脂肪和結(jié)締組織，撕開包膜，分離脾細胞，離心洗滌細胞1 2次后用培養(yǎng)液重懸。收集小鼠SP2/0骨髓瘤細胞，離心，洗滌2次后用培養(yǎng)液重懸，作為 待融合的SP2/0細胞。以1. OX IO8個免疫小鼠脾淋巴細胞與1. OX IO7個小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0混合，在50% PEG6000作用下融合。兩種細胞混合后洗滌一次，離心棄上清，輕彈管 壁懸開細胞(勿加液體)用37°C預溫的50% PEG6000(pH 8. 0) 0. 8ml于60 90秒內(nèi)逐滴 加入細胞沉淀中，其間輕輕振搖離心管，但勿吹打，靜置1分鐘，然后按先慢后快的原則，于 第1分鐘內(nèi)加完Iml無血清RPMI 1640，于第2分鐘內(nèi)加完2ml無血清RPMI 1640，于第3 分鐘內(nèi)加完7ml無血清RPMI 1640，以后1分鐘內(nèi)逐漸加入37°C預溫的無血清RPMI1640培 養(yǎng)基30 40ml。800轉(zhuǎn)/分鐘低速離心5 10分鐘。然后加入20% FCS HAT培養(yǎng)基，分 別接種到加有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板，一般每次融合的細胞鋪4塊板，置37°C 5% 0)2孵 才苜中培養(yǎng)。(4)雜交瘤細胞的篩選每隔4天換1/2培養(yǎng)液(HAT) —次，10天后改用含HT培 養(yǎng)液。融合后的雜交瘤細胞在含HT的選擇性培養(yǎng)液中大約持續(xù)培養(yǎng)兩周。在細胞集落長 到適當大小時(在10倍物鏡下觀察，細胞克隆大小以占滿一個視野為宜)，吸取培養(yǎng)液上 清，適當稀釋后做ELISA，篩選陽性克隆。采用ELISA間接法篩選陽性雜交瘤克隆。主要步 驟①0. OlM pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋ESAT-6/CFP-10重組融合蛋白，以及合成的ESAT-6 特異多肽，濃度200ng/ml，分別于96孔酶標板加入0. Iml/孔包板，4 °C過夜；②0. OlM pH7. 4PBS-Tween 20洗板三次；③用2% BSA-0. OlM pH 7. 2的PBS封閉1小時；④同上洗 板；⑤加入1 5稀釋的雜交瘤培養(yǎng)上清，0.1ml/孔，同時設(shè)陽性對照(免疫小鼠的血清)、 陰性對照(SP2/0培養(yǎng)上清液)和空白對照，室溫反應2小時；⑥洗板；⑦加1 5000稀釋 的羊抗小鼠Ig(G+M)-HRP，0. Iml/孔，室溫反應1小時；⑧洗板；⑨加入底物(TMB)室溫避光 反應5 10分鐘；⑩2M H2S04終止反應；450nm測定其OD值，以P/N彡2. 1為陽性。(5)雜交瘤細胞的克隆化雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)按有限稀釋法進行，選擇抗 體檢測陽性(ESAT-6/CFP-10重組融合蛋白和合成的ESAT-6特異多肽均陽性)的雜交瘤孔 細胞作適當增殖后，準確計數(shù)細胞。用完全1640培養(yǎng)基稀釋成10個/ml的細胞懸液接種 到已有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0. 1ml，7-10天后觀察細胞生長情況，并檢測上清 液中抗體水平，選擇5個抗體滴度最高的，呈單個克隆細胞生長的培養(yǎng)孔，作再次克隆化培 養(yǎng)。此方法可重復多次，直至單克隆孔抗體檢測陽性率為100%。(6)誘生腹水在接種雜交瘤細胞前一周，給BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只 0. 5ml，然后每只接種5. OX 106陽性雜交瘤細胞，10天后收集腹水測定抗體效價。(7)單克隆抗體的純化采用親和純化法(Protein L交聯(lián)的S印harose)純化腹水 中單克隆抗體。①腹水用冷Binding Buffer (結(jié)合緩沖液)稀釋3倍后，于4°C IOOOOrpm 離心15分鐘去除沉淀物。②將預裝有S印harose-Protein L的親和純化柱用10倍柱床體 積的Binding Buffer充分流洗。③將稀釋的腹水上柱，控制流速8 10滴/分鐘。④將 流穿的腹水重復上柱一次。⑤用20倍柱床體積的Binding Buffer充分洗滌，直至流穿液 A280吸光值小于0.01。⑥用Elution Buffer (洗脫緩沖液)洗脫結(jié)合的單克隆抗體，控制 流速8 10滴/分鐘，收集洗脫液于預加有0. Iml的磷酸鉀緩沖液(PH7. 9,0. 5M)的收集 管中，每管收集0. 5ml含抗體的洗脫液，共收集20管以上。⑦于A280nm檢測每管洗脫液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脫液。⑧將收集的洗脫液置于透析卡中，并于0. IM PH7.0的PBS中透析。每隔6小時換液一次，共透析24小時。⑨將透析后的抗體溶液稀釋 (1 100)后，于280nm測蛋白含量。⑩將純化的抗體分裝于小管中，置于低溫冰箱備用。(8)單克隆抗體的亞型鑒定采用Serotec公司的小鼠單克隆抗體免疫球蛋白分 型試劑盒分析。將純化的單抗作適當稀釋后進行檢測，操作嚴格按試劑盒說明書進行。試 驗結(jié)果為TBEF3雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體為IgM、κ型。結(jié)果參見附

圖1。實施例2.用該單克隆抗體進行ESAT-6的鑒定(定性)檢測本發(fā)明制備的抗ESAT-6單克隆抗體可以用來鑒定的(定性檢測)，鑒定方法可以 通過下述兩種方法實現(xiàn)1.免疫印跡法 Western Blotting 重組 ESAT-6 和 ESAT-6/CFP-10 融合蛋白以及 結(jié)核分枝桿菌全蛋白裂解液用該單抗進行Western Blotting檢測，在相應位置呈現(xiàn)目的條 帶，表明檢測到ESAT-6蛋白的表達。具體步驟(I)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學實驗指南》 (科學出版社1998)。采用15%分離膠和5%濃縮膠，電泳條件為電壓150V，溴酚藍染料帶 距離膠底邊1. 5厘米左右終止電泳。(2)電轉(zhuǎn)移方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學實驗指南》(科學出版社 1998)。用電轉(zhuǎn)移方式將其轉(zhuǎn)移至PVDF (0.22 μ m)膜上。(3)免疫印跡電轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，膜在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1小時后，用本 發(fā)明制備的單抗TBEF3作為一抗，室溫孵育2小時或4°C反應過夜，用TBST (TBS加入0. 5% Tween-20)洗滌3次，每次lOmin。以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgM作為二抗，室溫反 應2h，用上述方法洗滌后用ECL作用lmin，于全自動化學發(fā)光成像儀(Bio-Rad VersaDoc 5000MP)曝光成像。2.免疫沉淀法(IP)將重組ESAT-6和ESAT_6/CFP_10融合蛋白、結(jié)核分枝桿菌全 蛋白裂解液、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清液、臨床結(jié)核病人結(jié)核性胸水與該單抗進行免疫沉淀 反應，后經(jīng)western-blot檢測，在相應位置呈現(xiàn)目的條帶，表明檢測到ESAT-6蛋白的表達。 具體步驟①取Iug的重組蛋白或IOOug結(jié)核分枝桿菌裂解蛋白，500ul結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上 清液或臨床結(jié)核病人結(jié)核性胸水加純化的Iug抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3，4°C緩慢搖動2 小時；再加入20微升充分重懸的Protein L Agarose，4°C緩慢搖動過夜。②2500rpm離心5分鐘，小心吸除上清，注意不能吸掉Protein L Agarose。③用0.5-1毫升TBST洗滌沉淀5次。④完成最后一次洗滌后，去除上清，加入40微升IX SDS-PAGE電泳上樣緩沖液重 懸沉淀，瞬時高速離心把樣品離心至管底。⑤100°C或沸水浴處理3-5分鐘，取部分樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時不用的樣 品-20°C保存。⑥電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。⑦轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1小時。⑧加兔抗ESAT-6多抗，室溫反應2小時。
⑨洗膜4次后加抗兔IgG-HRP，室溫反應1小時。⑩洗膜4次后ECL顯色，VersaDoc 5000全自動化學發(fā)光成像儀曝光成像。結(jié)果參見附圖2，其中M:蛋白分子量Marker(15% SDS-PAGE)，1.重組ESAT-6/ CFP-10融合蛋白，2.重組ESAT-6蛋白，3.結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清液，4.結(jié)核性胸水，5.鳥 胞內(nèi)分枝桿菌裂解蛋白，6.堪薩斯分枝桿菌裂解蛋白，7.結(jié)核分枝桿菌裂解蛋白。實施例3、用該單克隆抗體進行ESAT-6分子的定量檢測本發(fā)明制備的抗ESAT-6單克隆抗體可以用來定量檢測重組ESAT-6和ESAT-6/ CFP-10融合蛋白、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清液、各種臨床體液樣本中結(jié)核特異抗原ESAT-6水 平，檢測方法可以通過下述兩種方法實現(xiàn)1.間接 ELISA 法:①將檢測樣本適當稀釋于0. OlM pH9. 6碳酸鹽緩沖液包被液中，同時將重組的 ESAT-6和ESAT-6/CFP-10融合蛋白適當系列濃度稀釋在包被液中，作為定量標準品對照。 在對應的酶標板孔中加入上述各待測樣本和系列濃度的標準品lOOul，室溫孵育2h或4°C 包被過夜。②倒空液體并拍干殘留液體，用0. OlM pH7. 4 PBS-Tween 20洗液洗板三次。③用2% BSA-0. OlM pH 7. 2 的 PBS 封閉 1 小時。④同上洗板3次。⑤加入適當稀釋的抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3，0. Iml/孔，室溫反應2小時。⑥同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgM-HRP，0. Iml/孔，室溫反應1小時。⑦用洗滌液浸泡板5min后，同上洗板4次后，加入底物(TMB)室溫避光反應5 10分鐘。⑧2M H2S04終止反應，450nm測定其OD值。⑨繪制標準反應曲線，根據(jù)標準曲線求的待測樣本中EAST-6的表達水平。2.夾心 ELISA 法①包被用包被緩沖液將另一個ESAT-6的單克隆抗體TBEA8稀釋至1 μ g/mL。在 酶標板反應孔中加0. ImL/孔，4°C過夜。次日棄去孔內(nèi)溶液，用0. 01ΜρΗ7· 4 PBS-Tween 20 洗滌緩沖液洗板3次，每次3min。②封閉用2% BSA-0. OlM pH 7. 2的PBS室溫封閉1小時。③加樣加適當稀釋的待檢樣品和系列濃度稀釋的重組ESAT-6標準品0. ImL/孔 于上述已包被的反應孔中，置濕盒中室溫反應2小時。④洗板用洗滌緩沖液洗板3次，每次3min。⑤加二抗加入適當稀釋的該抗ESAT-6的單克隆抗體TBEF3 (IgM型，針對EAST-6 不同靶位)或兔抗ESAT-6多抗，0. Iml/孔，室溫反應2小時。⑥加酶聯(lián)物同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgM-HRP或抗兔IgG-HRP，0. Iml/孔，室 溫反應1小時。⑦顯色同上洗板4次后，加入底物(TMB)室溫避光反應5 10分鐘。⑧終止、讀板2M H2S04終止反應，450nm測定其OD值。⑨標準曲線及計算以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，生成標準曲線和直 線回歸方程式，根據(jù)標準反應曲線求的待測樣本中EAST-6的表達含量。
結(jié)果見附圖3和表1表IELISA法檢測臨床體液樣本中ESAT-6的陽性率及其在結(jié)核診斷中的應用
權(quán)利要求
一種抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白的單克隆抗體TBEF3，該單克隆抗體亞型為IgM、κ型，能與結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白ESAT 6特異結(jié)合，由保藏號為CCTCC No.C201080的雜交瘤產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白的單克隆抗體TBEF3 的制備方法，其特征是該單克隆抗體通過以下步驟獲得(1)小鼠免疫選擇6周齡的BALB/C小鼠，以特異的抗原肽即結(jié)核分枝桿菌早期分泌 性抗原靶蛋白基因的第1-14位氨基酸，14肽MTEQQWNFAGIEAA對小鼠進行免疫。每只小鼠 以200ug的抗原肽混合佐劑后皮下多點注射免疫，每2周一次，共3次；第四次加強免疫3 天后用于融合。(2)小鼠骨髓瘤細胞的培養(yǎng)培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細胞SP2/0并使其保持良好的生長狀態(tài) 用于雜交瘤細胞融合；(3)細胞融合采用聚乙二醇細胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞， 在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞于96孔培養(yǎng)板，含20 % FCS的HAT培養(yǎng)基培 養(yǎng)一天，將步驟(1)中免疫小鼠的脾臟淋巴細胞和步驟(2)中小鼠的骨髓瘤細胞混合離心， 然后以聚乙二醇介導細胞融合，稀釋融合后的細胞，接種至培養(yǎng)板培養(yǎng)；(4)雜交瘤細胞的篩選將上述培養(yǎng)物在含HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在細胞集落長到 大小合適時，吸取培養(yǎng)上清液以酶聯(lián)免疫吸附檢測法做抗體鑒定，篩選陽性克?。?5)雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)以有限稀釋法克隆陽性的雜交瘤細胞，將稀釋到一定 密度的細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板，使每孔只有一個細胞生長，形成細胞集落的孔取上清 做酶聯(lián)免疫吸附檢測，篩選和鑒定陽性克隆，重復克隆若干次，直到雜交瘤細胞的陽性孔率 達到100%，將克隆化后的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)并做抗體理化性狀分析和鑒定；(6)小鼠腹水的誘生給每只BALB/C小鼠接種5X IO6陽性雜交瘤細胞，10天后收集腹 水離心，測定抗體效價，并純化腹水中的單克隆抗體；(7)單克隆抗體的純化利用ProteinL親和純化法純化腹水中的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白的單克隆抗體TBEF3 在結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白檢測中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白的單克隆抗體TBEF3 在結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白檢測中的應用，其特征是通過抗體夾酶聯(lián)免疫吸 附試驗、免疫印跡法和免疫沉淀的方法檢測細菌培養(yǎng)物以及各種體液樣本中結(jié)核分枝桿菌 早期分泌性抗原靶蛋白的表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白的單克隆抗體TBEF3 在結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白定量分析中的應用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白的單克隆抗體TBEF3 在結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白定量分析中的應用，其特征是通過酶聯(lián)免疫吸附 試驗的方法對在細菌培養(yǎng)物及體液樣本中的結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白表達水 平進行定性和定量。
全文摘要
本發(fā)明提供抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白的單克隆抗體TBEF3。經(jīng)特異的抗原肽免疫小鼠，收集致敏的小鼠B淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡檢測法判定陽性克隆，建立分泌抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)單克隆抗體的雜交瘤細胞系TBEF3，把陽性的細胞擴增培養(yǎng)并注射至同品系的小鼠腹腔誘導產(chǎn)生含抗體的腹水，經(jīng)過收集與抗體親和純化，獲得抗結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明提供的單克隆抗體在結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶蛋白檢測中應用。
文檔編號C12R1/91GK101985473SQ20101050470
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者盧洪洲, 姚航平 申請人:浙江大學;上海市公共衛(wèi)生臨床中心