專利名稱：一種利用溶氧參數(shù)控制畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用溶氧參數(shù)控制畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法，屬于生物工 程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antibacterial peptides, ABP)是多細胞真核生物在外源性病原體誘導(dǎo) 條件下，其先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類防御性肽類活性物質(zhì)，其分子質(zhì)量一般在2-5ku。與傳 統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽不易使細菌產(chǎn)生耐藥性。近年來，以酵母為基因工程受體菌的研究引起人們的重視，酵母具有比大腸桿菌 更完備的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力，并且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素， 是基因工程中良好的真核基因受體菌。自1978年Hirmen等首先試驗酵母轉(zhuǎn)化成功后，已 有人干擾素基因、乙型肝炎表面抗原基因、α-淀粉酶基因等數(shù)十種外源基因在酵母中獲得 表達。國內(nèi)研究者大量研究表明，利用酵母表達抗菌肽是一條可行的道路，如能在表達產(chǎn)率 上得到進一步提高，將為抗菌肽早日進入臨床應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的申艷敏、張素芳等系統(tǒng)研究了各種抗菌肽的構(gòu)建并通過體外藥 敏試驗進行了活性的初步判斷，得到了有意義的幾種抗菌肽。本專利中的抗菌肽以其中 的LL-37為例，具體構(gòu)建過程為根據(jù)GenBank CAA86115中的LL-37氨基酸序列，選擇畢 赤酵母偏好密碼子，采用SOE-PCR方法合成基因。所合成的LL-37基因全長為141bp，并 在其N端引入kex2裂解位點，以保證表達抗菌肽具有天然N端?；蚩寺∪雙PICZa-A質(zhì) 粒，構(gòu)建出分泌型重組酵母表達載體pPICZa-A-LL-37。表達載體經(jīng)SacI酶切線性化后電 轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌株X-33，在博來霉素抗性固體平板上長出酵母單菌落后，提取酵母基 因組，進行PCR陽性鑒定，再進一步使用搖床進行發(fā)酵，取上清液進行藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 抗菌肽對指示菌株金黃色葡萄球菌Cowan I (Staphylococcus aureus)、致病性大腸桿菌 K99 (Enteropathogenic E. coli)和雞白痢沙門氏茵(Salmonella pullorum)的最小抑菌濃 度(Minimal InhibitoryConcentration, MIC)分另Ij 為 1. 56 μ g/mL, 3. 12 μ g/mL, 1. 56 μ g/
mLo由于在實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，畜禽養(yǎng)殖規(guī)模大，發(fā)病病原體種類多，發(fā)病季節(jié)頻繁，搖 瓶發(fā)酵無法滿足養(yǎng)殖需要，這成為制約抗菌肽進入實際應(yīng)用的最大障礙。因此，該發(fā)明對抗 菌肽早日實現(xiàn)發(fā)酵罐生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。中國專利申請CN101270339(申請?zhí)?200710027210.x)公開了一種分泌表達蛋
白酶的酵母菌培養(yǎng)方法，其特征在于采用無機鹽培養(yǎng)基對重組甲醇營養(yǎng)型酵母進行發(fā)酵培 養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)包括酵母菌的生長期和蛋白酶的分泌表達期，在蛋白酶的分泌表達期內(nèi)根據(jù) 發(fā)酵液溶氧值變化實時控制甲醇的流加補料，用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH值，從而實現(xiàn)蛋白酶的 高效表達。該方法需要根據(jù)酵母菌所處的不同生長時期，根據(jù)溶氧的變化來對酵母的生長 進行調(diào)控。在目前公布的與抗菌肽有關(guān)的專利中，主要側(cè)重點均集中在以下三個方面1、各類抗菌肽基因的構(gòu)建、電轉(zhuǎn)、鑒定和篩選的分子生物學(xué)過程；2、抗菌肽的人工化學(xué)合成以及天 然抗菌肽的化學(xué)提取法；3、抗菌肽作為殺蟲劑、飼料添加劑以及各類昆蟲抗菌肽有效成分 的深加工和應(yīng)用。鮮有報道發(fā)酵過程規(guī)律和利用參數(shù)反饋進行過程控制的專利，同時到目 前為止，國內(nèi)沒有抗菌肽LL-37基因工程酵母菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用溶氧參數(shù)指導(dǎo)畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法。發(fā)明概述本發(fā)明根據(jù)發(fā)酵開始后培養(yǎng)基的溶氧變化判斷誘導(dǎo)開始和誘導(dǎo)繼續(xù)的時間點，最 大程度地減少了甲醇的使用量，在保證足夠抑菌活性的同時也最大程度地縮短了發(fā)酵周 期。本發(fā)明使用的培養(yǎng)基采用了最簡單的制備工序和最簡單的合理配方，在保證營養(yǎng)成分 滿足畢赤酵母的同時也降低了大規(guī)模生產(chǎn)的成本。發(fā)明詳述本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種利用溶氧參數(shù)控制畢赤酵母發(fā)酵抗菌肽的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟如 下(1)向發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，實消并冷卻后，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為27 30°C，在通氣量 為0. 3 1. 5vvm、攪拌速度為250 400rpm的條件下，標定溶氧(DO)的百分點，得到發(fā)酵
培養(yǎng)基；(2)將活化后的基因酵母菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10% (ν/ν)，同時標 記為O點，開始發(fā)酵，發(fā)酵條件為通氣量為0. 3 1. 5vvm、攪拌速度為100 400rpm、罐壓 為 0. 02 0. IMPa ；(3)當DO值由10%以下上升至50%以上時，開始流加甲醇至DO值回落至10% 30%，停止流加甲醇，當DO值再次穩(wěn)定升高至50%以上時，再次開始流加甲醇至DO值回落 至10% 30 %，停止流加甲醇，循環(huán)操作，通過流加甲醇、調(diào)節(jié)通風(fēng)和轉(zhuǎn)速控制DO值始終維 持在10% 30% ；(4)當流加甲醇后DO值不再回落時，發(fā)酵結(jié)束。所述步驟(1)中的培養(yǎng)基為0. 5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基或甘油的BMGY培養(yǎng)基。所述步驟(2)的活化，采用如下方法將基因工程酵母菌在含有博萊霉素抗性的YPDS液體培養(yǎng)基進行搖床活化，培養(yǎng) 條件為28 30°C，100 200rpm，培養(yǎng)20 26小時，以O(shè)D65tl不超過4為限度。所述的含有博萊霉素抗性的YPDS液體培養(yǎng)基組分如下酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、山梨糖醇lmol/L、博來霉素25ug/ ml ο所述步驟(3)中流加甲醇的量為培養(yǎng)基中甲醇終濃度不超過0.2% (ν/ν) 0所述步驟(3)中循環(huán)操作的次數(shù)為3 6次。所述步驟(3)中流加甲醇時DO值回落至大于30%時，通過降低攪拌轉(zhuǎn)速和/或降 低通風(fēng)量來調(diào)節(jié)DO值，但通風(fēng)量不低于0. 3vvm ；DO值回落至小于10%時，通過提高攪拌轉(zhuǎn) 速和/或提高通風(fēng)量來調(diào)節(jié)DO值。
所述的基因酵母菌株可采用市售畢氏酵母，按現(xiàn)有技術(shù)或畢氏酵母使用說明書將 目的基因?qū)氘吺辖湍钢蝎@得。本發(fā)明有益效果如下1、本發(fā)明通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、通風(fēng)量和流加甲醇來控制DO值長期在一個區(qū)間內(nèi) 運行，相比傳統(tǒng)溶氧值調(diào)控，更易于操作，條件易于掌握。2、本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，省略了使用氨水作為氮源和調(diào)節(jié)pH的步驟，在BMGY培 養(yǎng)和BMMY轉(zhuǎn)換培養(yǎng)中任由其自由變化，通過趨勢變化了解不同碳源引起的菌體生長速度 的不同和判斷菌體處于好氧或厭氧階段。3、本方法便于操作，現(xiàn)象明顯。使用BMGY培養(yǎng)基富集菌體階段，若溶氧一直在低 位運行，則PH會持續(xù)下降，例如從發(fā)酵初始階段的pH6. 0可以下降到pH4. 8，溶氧反彈時，pH 亦趨步上升。使用BMMY誘導(dǎo)成功后，由于抗菌肽是堿性蛋白，pH也會保持平穩(wěn)或非常緩慢 的上升，但決不會下降。大型發(fā)酵生產(chǎn)中通過趨勢的重復(fù)性觀察可以增強生產(chǎn)人員的信心。4、本發(fā)明所述方法發(fā)酵周期短，甲醇用量少。實際發(fā)酵過程中，在發(fā)酵到36小時 后，就會檢測到有活性，此時甲醇用量約1 % 2%。


圖1抗菌肽LL-37 tricine-SDS-PAGE電泳圖片。Ml、超低分子量蛋白Marker ；M2、 低分子量蛋白Marker ；UpPICZa-A陰性對照；2、抗菌肽LL-37。圖2本發(fā)明工藝得到的抗菌肽LL-37對野毒大腸桿菌的抑制作用圖片。1、發(fā)酵22 小時抑菌圈大??；2、發(fā)酵24小時抑菌圈大??；3、發(fā)酵26小時抑菌圈大??；4、發(fā)酵28小時 抑菌圈大??；5、發(fā)酵30小時抑菌圈大小；6、發(fā)酵32小時抑菌圈大?。?、發(fā)酵34小時抑菌 圈大小；8、發(fā)酵36小時抑菌圈大??；constrast為4000U/ml的氨芐青霉素。圖3固定溶氧值8%得到的抗菌肽LL-37對野毒大腸桿菌的抑制作用圖片。1、發(fā) 酵22小時抑菌圈大小；2、發(fā)酵26小時抑菌圈大小；3、發(fā)酵30小時抑菌圈大?。?、發(fā)酵34 小時抑菌圈大??；5、發(fā)酵38小時抑菌圈大??；6、發(fā)酵42小時抑菌圈大??；7、發(fā)酵46小時 抑菌圈大??；8、發(fā)酵50小時抑菌圈大??；9、發(fā)酵52小時抑菌圈大??；constrast為4000U/ ml的氨芐青霉素。圖4固定溶氧值40%得到的抗菌肽LL-37對野毒大腸桿菌的抑制作用圖片。1、發(fā) 酵14小時抑菌圈大?。?、發(fā)酵16小時抑菌圈大?。?、發(fā)酵18小時抑菌圈大??；4、發(fā)酵20 小時抑菌圈大?。?、發(fā)酵22小時抑菌圈大?。?、發(fā)酵24小時抑菌圈大??；7、發(fā)酵26小時 抑菌圈大??；8、發(fā)酵28小時抑菌圈大?。?、發(fā)酵30小時抑菌圈大小constrast為4000U/
ml的氨芐青霉素。圖5是對照例得到的抗菌肽LL-37對野毒大腸桿菌的抑制作用圖片。其中，9. 80是30小時取樣抑菌圈大??；33、44、49、53分別為33小時、44小時、49 小時、53小時取樣抑菌圈大?。?br> 具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。實驗試劑說明
每升1 %甘油的BMGY培養(yǎng)基中含有如下組分磷酸二氫鉀10. 941g、磷酸氫二鉀緩4. 473g、酵母浸粉10g、蛋白胨20g、甘油10ml、 YNB 3. 4g、硫酸銨 IOg ；每升0. 5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基中含有如下組分磷酸二氫鉀10. 941g、磷酸氫二鉀緩4. 473g、酵母浸粉10g、蛋白胨20g、YNB 3. 4g、 硫酸銨10g，甲醇5ml ；上述YNB為市售產(chǎn)品，也可采用如下自配有機物溶液和自配無機鹽溶液替代，自 配有機物溶液，每IL培養(yǎng)基中需添加如下組分①硫胺素鹽酸鹽Img②核黃素2mg③吡哆醇鹽酸鹽Img④尼克酰胺6mg⑤泛酸鈣IOmg⑥生物素40 μ g⑦葉酸40 μ g⑧對氨基苯甲酸Img⑨肌醇2mg以上有機物混合物使用自來水配制，然后無菌條件下0. 22um微濾一遍即可使用；自配無機鹽溶液，每IL培養(yǎng)基中需添加如下組分①硫酸錳(MnSO4· H2O)IOmg②硫酸鋅(ZnSO4)IOmg③硫酸銅(CuSO4· 7H20) Img④碘化鈉(NaI)320 μ g⑤鉬酸鈉(Na2MoSO4· 2H20) 800 μ g⑥硫酸亞鐵(FeSO4· 7H20) IOmg⑦硼酸(H3BO3)80 μ g⑧硫酸銨((NH4)2SO4)IOg以上無機鹽混合物使用自來水配制，然后無菌條件的0. 22um微濾一遍即可使用；含有博萊霉素抗性的YPDS液體培養(yǎng)基組分如下酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、山梨糖醇lmol/L、博來霉素25ug/ ml ο實施例中的基因酵母菌株采用如下方法構(gòu)建1、抗菌肽基因設(shè)計與合成根據(jù)抗菌肽的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，利用DNA Star, primer premier5. 0軟件設(shè)計了 4個基因片段F1、RU F2和R2。Fl和Rl的3，端、Rl和F2的 5，端、F2和R2的3，端分別有21bp的互補序列，符合gene SOEing(gene splicing by overlapextension)的要求。序列如下
Xha I Kex2Fl :5，-GCT 歡知 TTGTTGGGTGACTTCTTCAGAAAGTCCAAGGAAA-3，，
Rl 5，-CTGGACGATTCTCTTGAACTCCTTACCGATCTTTTCCTTGGACTTTCTGAAGA-3，，F(xiàn)2 :5’ -GAGTTCAAGAGAATCGTCCAGAGAATCAAGGACTTCTTGAGGAACTTGGTC-3，，R2 5 ’ -ACT 姐!，TCATTGGGATTCAGTTCTTGGGACCAAGTTCCTCAAGAAGTC-3 ’。
Xba I四條引物中，F(xiàn)l含49bp, Rl含53bp, F2和R2各含51bp,由Invitrogen上海分公 司合成。2. PCR 擴增四條引物兩兩互為模板、引物，反應(yīng)體系(50ul) 10XPCR Buffer 5uL， MgCl2 (25mmol/L) 3uL, dNTPs (lOmmol/L) luL，F(xiàn)l、Rl、F2 和 R2(10pmol/L)各 luL,Taq 0. 5uL, ddH20 36. 5uL。混勻，離心。為了保證SOE合成的特異性，采用(touchdown，TD)PCR技術(shù)進 行優(yōu)化(具體步驟可參見申艷敏，魏建超，尚書文等.《人源抗菌肽LL-37在畢赤酵母中的 高效表達及其活性檢測》.微生物學(xué)通報，2008. 35 (4) :539-544)。94°C 30s，退火溫度從 65°C降至50°C，每循環(huán)1分鐘，每一個循環(huán)降低0. 5°C，72°C 45s，共30個循環(huán)后溫度降至 50°C，再在最適退火溫度52°C的條件下進行15個循環(huán)。最后72°C延伸7min，取TD-PCR產(chǎn) 物2. OuL, 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄拍照。3、重組酵母表達載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物和pPICZ alpha-A (invitrogen公司上海分公司)均用XHol、XbaI雙酶 切，T4 DNA連接酶連接連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5alpha，重組表達質(zhì)粒進行PCR、缺失 酶切位點鑒定。缺失酶切位點鑒定陽性的質(zhì)粒送Invitrogen上海分公司測序。構(gòu)建正確 的重組表達質(zhì)粒命名為pPICZalpha-A-LL-37。4、X-33及Mut+轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定^ ^ S Pichia pastoris X-33 (Mut+) 80ul 與 SacI _ 個生 it pPICZalpha-A-LL-37 (5ug)相混合，置冰上5min，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad) 中，1. 5KV、25yF、200Q電擊，立即加入Iml預(yù)冷的lmol/L山梨醇，取200 μ L涂布于YPDS 平板上，30°C培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。詳細步驟參見畢氏酵母產(chǎn)品使用說明書一《畢氏酵母表達 手冊》(((PichiaExpression Kit)))。采用PCR方法分析P. pastoris轉(zhuǎn)化子，用煮_凍-煮 法制備PCR模板，以PI、R2為引物，其中Pl為鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的畢赤酵母兩條通用引物之 一，其序列為 5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，(SEQ ID N0. 6)，反應(yīng)體系同上，PCR 反應(yīng)條 件94°C 5min ；94°C 45s, 48°C 45s, 72°C 45s，25 個循環(huán)；72°C 6min。以能擴增出 467bp 的 克隆定為陽性轉(zhuǎn)化子。實施例一種利用溶氧參數(shù)控制畢赤酵母發(fā)酵抗菌肽的生產(chǎn)方法，步驟如下1)基因酵母菌株的活化將基因酵母菌株在含有博萊霉素抗性的YPDS液體培養(yǎng)基進行搖床活化，培養(yǎng)條 件為28 30°C，100 200rpm，培養(yǎng)24小時，以O(shè)D65tl不超過4為限度；2)基因酵母菌株的富集將上述活化后的基因酵母菌株以體積百分比2%的接種量接入到BMGY培養(yǎng)基中， 在搖床中進行菌體的富集，培養(yǎng)條件為28 30°C，150 200rpm，培養(yǎng)過夜即可，培養(yǎng)結(jié)束 后，得種子液，等待接種使用，或放置于冰箱4度存放，但不可超過三天；
3)發(fā)酵罐的準備進行發(fā)酵罐清洗、空消、管路連接和各個電極的校正工作；4)發(fā)酵開始以及過程控制將配好的甘油的BMGY培養(yǎng)基在IOL機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐中進行實消，冷卻 后加入YNB溶液，設(shè)置發(fā)酵需要的溫度28 29°C，此時標定溶氧(DO)的百分點(0. 3vvm， 300rpm)。以無菌方式將種子液接入上述發(fā)酵罐中，接種量為10% (ν/ν)，此時發(fā)酵開始，記 為0點，軟件記錄各參數(shù)歷史數(shù)據(jù)。 發(fā)酵開始后從控制面板上可以看到的明顯變化是DO呈現(xiàn)快速下降趨勢，在4個小 時之內(nèi)，由開始時的100%快速下降到10%以下(若菌體在4°C冰箱中儲存時間較長，則DO 下降趨勢緩和，但同樣會在4小時之內(nèi)下降到10%以下)，此階段保持0. 3vvm的空氣通風(fēng) 量，轉(zhuǎn)速在80 200rpm,罐壓0. 02 0. IMPa0當溶氧歷史曲線持續(xù)一段時間的走低并平衡后，在1.5小時時DO值會快速反彈， 并在10分鐘之內(nèi)最大反彈到80%。此時發(fā)酵罐設(shè)備的補料泵以最小速度8ml/小時流加甲 醇，每啟動一波甲醇流加，其甲醇流加的最大終濃度為1%，流加過程和流加結(jié)束后注意觀 察溶氧曲線的走向，一般正常情況下，此時溶氧開始緩慢下降并在某一個數(shù)據(jù)點附近企穩(wěn)， 企穩(wěn)后DO有以下3種可能狀態(tài)a DO彡30%，則適當降低攪拌轉(zhuǎn)速，若轉(zhuǎn)速已經(jīng)調(diào)低而DO依舊不能降到30%以 下，則降低通風(fēng)量，但不能低于0. Ivvm ；b. 10%<D0< 30%，不進行任何操作，等待溶氧曲線的下一波升高；c. DO彡10%，則適當提高轉(zhuǎn)速，若轉(zhuǎn)速已經(jīng)上調(diào)達到標定溶氧百分點時的數(shù)值， 則適當提高通風(fēng)量。當?shù)谝徊―O歷史曲線企穩(wěn)后，會出現(xiàn)上述狀態(tài)b或者狀態(tài)C，而狀態(tài)a較少出現(xiàn)。發(fā)酵過程繼續(xù)進行，進行4小時后，發(fā)現(xiàn)溶氧曲線會再次走出10% 30%的區(qū)間， 并持續(xù)走高(在實際發(fā)酵過程中，DO不會穩(wěn)定在狹窄的區(qū)間內(nèi)，應(yīng)根據(jù)實際情況判斷溶氧 曲線是否已經(jīng)在持續(xù)走高，例如已經(jīng)走高超出50%，并不再回落)，此時啟動第二波的甲醇 流加，同樣，本次流加的甲醇終濃度不能高于5%，緩慢流加過程中注意觀察溶氧曲線的變 化，操作同上。經(jīng)過兩波甲醇流加后，溶氧曲線不再回落，在原標定條件甚至通風(fēng)和攪拌轉(zhuǎn)速均 減半的條件下，溶氧曲線仍居高不下，標志著發(fā)酵生產(chǎn)的結(jié)束，此時發(fā)酵約30 34小時，藥 敏定性試驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液有活性，且較穩(wěn)定。見圖2。經(jīng)tricine-SDS-PAG電泳，得到一條4. 5KD的條帶，如圖1所示，具有如下氨基酸 序列L-L-G-D-F-F-R-K-S-K-E-K-I-G-K-E-F-K-R-I-V-Q-R-I-K-D-F-L-R-N-L-V-P-R-T -E-S (SEQ ID NO. 1)，即為抗菌肽 LL-37。溶氧控制區(qū)間探索試驗低溶氧方案溶氧值控制在8%左右，加甲醇時間點、罐壓、溫度、接種量與具體實時方式同步驟 4)。直到發(fā)酵進行46小時，藥敏試驗才發(fā)現(xiàn)有較明顯的抑菌圈。見圖3。高溶氧方案
溶氧值控制在40%左右，加甲醇時間點、罐壓、溫度、接種量與具體實時方式4) 同。發(fā)酵只需24小時，藥敏試驗就發(fā)現(xiàn)有較明顯的抑菌圈。繼續(xù)進行下去，30小時時活性 消失。見圖4。使用本專利中介紹的方法進行發(fā)酵，進行到30小時左右時，即可使用藥敏試驗定 性檢測到抗菌肽的活性，通常情況下，使用真空旋蒸原理的設(shè)備進行濃縮4 5倍，可以使 原發(fā)酵液的活性得到增強。經(jīng)計算，每100L發(fā)酵液的生產(chǎn)成本約為70元左右，遠遠低于現(xiàn)有技術(shù)的200元。對照實驗根據(jù)中國專利申請CN101270339(申請?zhí)?00710027210.x)的記載，按照溶氧波 動曲線進行誘導(dǎo)生產(chǎn)抗菌肽的方法，步驟如下1)基因酵母菌株的活化將基因酵母菌株在含有博萊霉素抗性的YPDS液體培養(yǎng)基進行搖床活化，培養(yǎng)條 件為28 30°C，100 200rpm，培養(yǎng)24小時，以O(shè)D65tl不超過4為限度；2)基因酵母菌株的富集將以上YPDS菌株以2% (ν/ν)的接種量接入到BMGY培養(yǎng)基中，在搖床中進行菌體 的富集，培養(yǎng)條件為28 30°C，150 200rpm，培養(yǎng)過夜。3)發(fā)酵罐的準備進行發(fā)酵罐清洗、空消、管路連接和各個電極的校正工作；4)發(fā)酵開始以及過程控制將配好的甘油的BMGY培養(yǎng)基在IOL機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐中進行實消，冷卻 后加入YNB溶液，設(shè)置發(fā)酵需要的溫度28 29°C，此時標定溶氧(DO)的百分點(0. 2vvm， 300rpm)。以無菌方式將種子液接入上述發(fā)酵罐中，接種量為10% (ν/ν)，此時發(fā)酵開始，記 為0點，軟件記錄各參數(shù)歷史數(shù)據(jù)。發(fā)酵開始后從控制面板上可以看到，發(fā)酵進行到7小時后，實測溶氧值在0. 3%到 1 %左右浮動，并在此位置持續(xù)到發(fā)酵24小時左右，然后開始反彈，并在10分鐘之內(nèi)最大可 以反彈到80%。此時發(fā)酵罐設(shè)備的補料泵以8ml/小時的速度流加甲醇，并密切關(guān)注溶氧， 待溶氧下跌到10%后，停止流加甲醇，統(tǒng)計甲醇用量為50ml，密切關(guān)注溶氧，發(fā)現(xiàn)溶氧繼續(xù) 下跌，直到2%左右，并在此穩(wěn)定到40小時，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)第二波溶氧峰，再次以同樣的速度流 加甲醇，并密切關(guān)注溶氧，發(fā)現(xiàn)第二次溶氧峰下降的極其緩慢，流加甲醇兩小時后，將補料 泵流加甲醇的速度提升到16ml/小時，繼續(xù)觀察溶氧下降速度，并沒有明顯的變快，流加甲 醇4小時后，將補料泵速度提升到24ml/小時，繼續(xù)觀察溶氧的下降速度，還是沒有明顯的 變快，于是以16ml/小時的速度流加，統(tǒng)計第二次峰用時20小時，甲醇用量360ml，待溶氧下 降到10%后停止流加甲醇并密切關(guān)注溶氧，發(fā)現(xiàn)溶氧繼續(xù)下降到5%左右，在83小時之后， 溶氧反彈到56%，結(jié)束發(fā)酵。通過觀察溶氧峰起峰落進行甲醇流加，在發(fā)酵進行到30h、33h、44h、49h、53h后， 取樣經(jīng)10，OOOrpmUOmin的離心后能夠觀察到活性，分別為0、2086U、2530U、2765U、2637U， 見圖5。(活性的檢測方法可參見張秀英，孫玉梅.抗生素微生物檢定法，《獸藥檢驗操作規(guī) 程》，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，二〇〇五年三月，209-217)分析
對控溶氧區(qū)間進行甲醇流加的實施例與對照實驗進行比較，得到以下結(jié)果1、能夠最早出現(xiàn)活性的時間差不多，都是在30小時之后，活性值的大小考慮到藥 敏試驗半定量方法的系統(tǒng)誤差，可以認為相差不大，在2000U左右，以后隨發(fā)酵的進行，活 性也隨之提高，最高都可以達到2700U左右。2、對照實驗中甲醇最終用量在6% 8%，第二次誘導(dǎo)后發(fā)酵進行到約80h后，溶 氧峰重新反彈起，就可以結(jié)束發(fā)酵；實施例中，甲醇最終用量在 6%，能夠以適量的甲 醇控制溶氧區(qū)間的平穩(wěn)運行，發(fā)酵進行到48小時，就可以結(jié)束發(fā)酵。3、對照實驗實施過程中，發(fā)現(xiàn)抗菌肽活性值有一個最高值，然后會有一個變小的 過程，究其原因，抗菌肽是小肽，不穩(wěn)定，長時間的發(fā)酵有可能被酶降解，也有可能被酵母重 新利用。綜合考慮，可以認為，實施例更適合抗菌肽的發(fā)酵。
權(quán)利要求
一種利用溶氧參數(shù)控制畢赤酵母發(fā)酵抗菌肽的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟如下(1)向發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，實消并冷卻后，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為27～30℃，在通氣量為0.3～1.5vvm、攪拌速度為250～400rpm的條件下，標定溶氧的百分點，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)將活化后的基因酵母菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，同時標記為0點，開始發(fā)酵，發(fā)酵條件為通氣量為0.3～1.5vvm、攪拌速度為100～400rpm、罐壓為0.02～0.1MPa；(3)當DO值由10％以下上升至50％以上時，開始流加甲醇至DO值回落至10％～30％，停止流加甲醇，當DO值再次穩(wěn)定升高至50％以上時，再次開始流加甲醇至DO值回落至10％～30％，停止流加甲醇，循環(huán)操作，通過流加甲醇、調(diào)節(jié)通風(fēng)和轉(zhuǎn)速控制DO值始終維持在10％～30％；(4)當流加甲醇后DO值不再回落時，發(fā)酵結(jié)束。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(1)中的培養(yǎng)基為0.5%甲醇 的BMMY培養(yǎng)基或1 %甘油的BMGY培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(2)的活化，采用如下方法將基因工程酵母菌在含有博萊霉素抗性的YPDS液體培養(yǎng)基進行搖床活化，培養(yǎng)條件為28 30°C，100 200rpm，培養(yǎng)20 26小時，以O(shè)D65tl不超過4為限度。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的含有博萊霉素抗性的YPDS液體 培養(yǎng)基組分如下酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、山梨糖醇lmol/L、博來霉素25ug/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(3)中流加甲醇的量為培養(yǎng)基 中甲醇終濃度不超過0. 2% (ν/ν)。
6.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(3)中循環(huán)操作的次數(shù)為3 6次。
7.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(3)中流加甲醇時DO值 回落至大于30 %時，通過降低攪拌轉(zhuǎn)速和/或降低通風(fēng)量來調(diào)節(jié)DO值，但通風(fēng)量不低于 0. 3vvm ；DO值回落至小于10%時，通過提高攪拌轉(zhuǎn)速和/或提高通風(fēng)量來調(diào)節(jié)DO值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用溶氧參數(shù)控制畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。步驟如下(1)標定溶氧(DO)的百分點，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)同時標記為0點，開始發(fā)酵；(3)當DO值由10％以下上升至50％以上時，開始流加甲醇至DO值回落至10％～30％，停止流加甲醇，當DO值再次穩(wěn)定升高至50％以上時，再次開始流加甲醇至DO值回落至10％～30％，停止流加甲醇，循環(huán)操作，通過流加甲醇、調(diào)節(jié)通風(fēng)和轉(zhuǎn)速控制DO值始終維持在10％～30％；(4)當流加甲醇后DO值不再回落時，發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明所述方法發(fā)酵周期短，甲醇用量少，相比傳統(tǒng)溶氧值調(diào)控，更易于操作，條件易于掌握。
文檔編號C12P21/00GK101979649SQ20101050532
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者姜正軍, 孫大明, 朱孟豪, 王希鳳, 田建國, 蘇曉明, 袁永, 陳溥言 申請人:山東華辰生物科技有限公司