專利名稱：2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的有機(jī)物及其制備方法，具體是一種 2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸及其制備方法。
背景技術(shù)：
由Rhizoctonia solani引起的紋枯病是最重要的水稻病害之一，引起的產(chǎn)量損失 可達(dá)到20% 40%。目前我國水稻紋枯病的防治完全依賴于井崗霉素，井崗霉素對(duì)控制紋 枯病的蔓延與危害是相當(dāng)有效的。參見《井崗霉素防治水稻紋枯病試驗(yàn)初報(bào)》。但是井崗 霉素已使用了 30多年，使用井崗霉素防治紋枯病的藥量不斷提高，現(xiàn)每年使用次數(shù)已從30 年前的2次增加到目前的3 4次，使用量也已從以前的1. 5kg/hm2增加到目前的4. 5 6. 0kg/hm2。長期使用單一井崗霉素防治水稻紋枯病易導(dǎo)致R. solani產(chǎn)生抗藥性這個(gè)問題 已引起國內(nèi)外有關(guān)專家的高度關(guān)注。因此，用植物根際促生細(xì)菌發(fā)酵物來防治水稻紋枯病 是一種很有應(yīng)用前景的探索。植物根際促生細(xì)菌(PlantGrowth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是當(dāng)前農(nóng)業(yè) 微生物的研究熱點(diǎn)之一。PGPR能通過多種方式促進(jìn)植物生長，最重要的方式是分泌抗病物 質(zhì)抑制土壤中植物病原菌繁殖，控制植物病害發(fā)生。假單胞菌是其中典型代表，其生物防治 的機(jī)理目前多認(rèn)為是它可以分泌一種或幾種抗生物質(zhì)來抑制病原菌的生長，從而實(shí)現(xiàn)其生 物防治的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸及 其制備方法，通過簡單步驟實(shí)現(xiàn)從假單胞菌SJT25發(fā)酵液制備得到對(duì)水稻紋枯病具有抗性 的天然有機(jī)物2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸，具有應(yīng)用于生物農(nóng)藥的前景。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸(2-h印tyl-4-hexylfuran-3_carboxy lie acid)具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu) 本發(fā)明涉及上述2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的制備方法，包括以下步驟第一步、發(fā)酵將假單胞菌株SJT25接種到KMB培養(yǎng)基、PPM培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；所述的培養(yǎng)是指培養(yǎng)溫度為25-32°C，搖床轉(zhuǎn)速為80-280rpm。第二步、提取將發(fā)酵液用乙酸乙酯或氯仿萃取，將萃取得到的有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并 濃縮后得到浸膏；
所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)是指旋蒸溫度為25-60°C。第三步、分離純化將浸膏溶解于甲醇中，通過反相柱分離純化后以流動(dòng)相進(jìn)行梯 度洗脫，最后收集單峰得到2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸。所述的反相柱分離純化是指采用制備型高效液相ODS RP-C18反相柱進(jìn)行以下 兩種方式中的任意一種進(jìn)行分離純化a)設(shè)定流速為3ml/min，檢測波長205nm，出峰時(shí)間為49. 5min，流動(dòng)相0_20min， 20% -75% 甲醇；20-40min，75% 甲醇；40_45min，75-100% 甲醇；45_66min，100% 甲醇。b)設(shè)定流速為3ml/min，檢測波長205nm，出峰時(shí)間28. 4min，流動(dòng)相:0_30min， 20% -100% 甲醇；30-40min, 100% 甲醇。所述的流動(dòng)相是指甲醇和水的混合溶液。所述的假單胞菌株SJT25 拉丁學(xué)名為=Pseudomonas putida SJT25,生物保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所保藏號(hào)CGMCC3656本發(fā)明提供了一種制備天然有機(jī)物的簡便方法，原料易得，為大規(guī)模工業(yè)自動(dòng)化 生產(chǎn)提供了可能。本發(fā)明的新穎有機(jī)化合物2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸，經(jīng)抗性實(shí)驗(yàn)， 證實(shí)具有明顯的抗水稻紋枯病菌活性，有望應(yīng)用于水稻紋枯病的防治，對(duì)于開發(fā)相關(guān)抗植 物病原菌生防農(nóng)藥具有潛在的重要意義。


圖1分離純化方法一所得2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的制備液相色譜圖，圖中 箭頭所指C即為2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸色譜峰。圖2分離純化方法二所得2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的制備液相色譜圖，圖中 箭頭所指C即為2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸色譜峰。圖3提取粗品對(duì)水稻紋枯病菌抗性結(jié)果，其中a為空白PDA氯仿提取物對(duì)照，b 為空白KMB乙酸乙酯提取物對(duì)照，c為SJT25的PDA發(fā)酵液經(jīng)氯仿提取粗品，d為SJT25的 KMB發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯提取粗品，中間指示菌為水稻紋枯病菌。圖4 2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸對(duì)水稻紋枯病菌的抑制結(jié)果，其中A為50g/ mL，B 為 25g/mL，C 為 10g/mL，D 為 5g/mL，E 為空白對(duì)照。
圖5為2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸和吩嗪-1-羧酸(PCA)對(duì)水稻紋枯病的抑菌效 果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。實(shí)施例1化合物2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的分離提取方法一將假單胞菌SJT25接種于1升液體KMB培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天，將發(fā)酵液離心去菌體，取上清，用兩倍體積乙酸乙酯萃取3次，取上層乙酸乙酯有機(jī)相，將有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃 縮至浸膏。將此浸膏溶于2mL甲醇，過22m有機(jī)濾膜，再經(jīng)ODS RP-C18反相柱進(jìn)行分離和 純化，使用安捷倫1200制備液相色譜，分離條件為色譜柱大連依利特Hypersil 0DS2,5m, 10X250mm流速3· OmL/min檢測波長205nm流動(dòng)相甲醇和水梯度0-20min，20%-75% 甲醇；20_40min，75 % 甲醇；40_45min，75-100 % 甲醇； 45-66min，100% 甲醇。目的產(chǎn)物2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸出峰時(shí)間約為49. 5min。得2_庚基_5_己 基呋喃-3-羧酸20mg左右。色譜圖見圖1，圖中箭頭所指C即為2-庚基-5-己基呋喃_3_羧 酸色譜峰。實(shí)施例2化合物2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的分離提取方法二 將假單胞菌SJT25接種于1升液體PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天，將發(fā)酵液離心去菌體，取 上清，用兩倍體積氯仿萃取3次，取下層氯仿有機(jī)相，將有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至浸膏。 將此浸膏溶于2mL甲醇，過22m有機(jī)濾膜，再經(jīng)ODS RP-C18反相柱進(jìn)行分離和純化，使用安 捷倫1200制備液相色譜，分離條件為色譜柱大連依利特Hypersil 0DS2,5m, 10X250mm流速3· OmL/min檢測波長205nm流動(dòng)相甲醇和水梯度:0-30min,20%-100% 甲醇；30_40min，100% 甲醇。目的產(chǎn)物2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸出峰時(shí)間約為28. 4min。得2_庚基_5_己 基呋喃-3-羧酸20mg左右。色譜圖見圖2，圖中箭頭所指C即為2-庚基-5-己基呋喃_3_羧 酸色譜峰。高分辨質(zhì)譜得到該化合物的精密質(zhì)量數(shù)為294. 2240，推算其分子式為C18H3(l03。同 時(shí)對(duì)所得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，表ι列出了 C譜和H譜得出的碳?xì)鋵?duì)應(yīng)關(guān)系以及各碳 氫信號(hào)的歸屬。結(jié)果如表1所示。表1. IH NMR(400MHz)and 13C NMR(IOOMHz) data(CDC13,J in Hz and δ in ppm) 由此可以推斷出此化合物的結(jié)構(gòu)為實(shí)施例3(1)水稻紋枯病菌抗性實(shí)驗(yàn)分別將SJT25在KMB培養(yǎng)基中發(fā)酵，并乙酸乙酯提取的濃縮浸膏粗品lmg，和 SJT25在PDA培養(yǎng)基中發(fā)酵，并氯仿提取的濃縮浸膏粗品lmg，接種于固體PDA平板上牛津 杯中。平板中心接入直徑為8mm的水稻紋枯病菌塊，24小時(shí)后觀察，分別以空白KMB培養(yǎng)基 和空白PDA培養(yǎng)基提取物為對(duì)照。結(jié)果SJT25的KMB發(fā)酵液和PDA發(fā)酵液，分別以乙酸乙酯和氯仿為萃取劑所得粗 品浸膏均有抑制水稻紋枯病的效果。抑菌照片見附圖3。其中a為空白PDA氯仿提取物對(duì)照，b為空白KMB乙酸乙酯提取物對(duì)照，c為SJT25 的PDA發(fā)酵液經(jīng)氯仿提取粗品，d為SJT25的KMB發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯提取粗品，中間指示菌 為水稻紋枯病菌。(2)水稻紋枯病菌抗性的抑制率實(shí)驗(yàn)分別將lOOOg，500g, 200g, IOOg的2_庚基-5-己基呋喃_3_羧酸溶于20mL 60°C 左右液體PDA，倒平板，冷卻后在PDA平板中心接入直徑為8mm的水稻紋枯病菌塊，24小時(shí) 后觀察，以不含2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的空白PDA平板為對(duì)照。計(jì)算抑制率。菌絲 生長抑制率(％ )=(對(duì)照菌落直徑_處理菌落直徑)/ (對(duì)照菌落直徑-8mm) X 100 結(jié)果化合物2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸能夠抑制水稻紋枯病菌的生長，MIC為 10g/mL，抑制率結(jié)果見表2。抑菌照片見附圖4。其中A為50g/mL，B為25g/mL，C為IOg/ mL，D為5g/mL，E為空白對(duì)照。表22-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率 實(shí)施例42-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸和吩嗪-1-羧酸(陽性對(duì)照)的抑菌效果對(duì)比
分別將1 X 10_4mOl/L的2_庚基_5_己基呋喃_3_羧酸(分子量294)的1%。DMSO 溶液和1 X 10_4mOl/L的吩嗪-1-羧酸(分子量224)的1%。DMSO溶液各250L，接種于固體 PDA平板上的牛津杯中。平板中心接入直徑為8mm的水稻紋枯病菌塊，24小時(shí)后觀察，并以 250L空白1%。DMSO溶液為對(duì)照。結(jié)果2_庚基-5-己基呋喃-3-羧酸和吩嗪-1-羧酸(PCA)對(duì)水稻紋枯病均有抑 菌效果，結(jié)果見附圖5。其中F為2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸，G為吩嗪-1-羧酸，H為 空白1%。DMSO溶液對(duì)照；右圖為空白紋枯病菌平板。
權(quán)利要求
一種2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸，其特征在于，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下FDA0000021680920000011.tif
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟第一步、發(fā)酵將假單胞菌株SJT25接種到KMB、PPM或液體PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到發(fā) 酵液；第二步、提取將發(fā)酵液用乙酸乙酯或氯仿萃取，將萃取得到的有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并濃縮 后得到浸膏；第三步、分離純化將浸膏溶解于甲醇中，通過反相柱分離純化后以流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗 脫，最后收集單峰得到2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的制備方法，其特征是，所述 的培養(yǎng)是指培養(yǎng)溫度為25-32°C，搖床轉(zhuǎn)速為80-280rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的制備方法，其特征是，所述 的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)是指旋蒸溫度為25-60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的制備方法，其特征是，所述 的反相柱分離純化是指采用制備型高效液相ODS RP-C18反相柱進(jìn)行以下兩種方式中的 任意一種進(jìn)行分離純化a)設(shè)定流速為3ml/min,檢測波長205nm,出峰時(shí)間為49.5min,流動(dòng)相:0_20min， 20% -75% 甲醇；20-40min，75% 甲醇；40_45min，75-100% 甲醇；45_66min，100% 甲醇；b)設(shè)定流速為3ml/min,檢測波長205nm,出峰時(shí)間28.4min,流動(dòng)相:0_30min， 20% -100% 甲醇；30-40min，100% 甲醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸的制備方法，其特征是， 所述的流動(dòng)相是指甲醇和水的混合溶液。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸及其制備方法，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為本發(fā)明通過簡單步驟實(shí)現(xiàn)從假單胞菌SJT25發(fā)酵液制備得到對(duì)水稻紋枯病具有抗性的新穎天然有機(jī)物2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸，具有應(yīng)用于生物農(nóng)藥的前景。
文檔編號(hào)C12P17/04GK101880268SQ20101018148
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者徐燕, 王曉英, 許煜泉, 鐘建江 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)