專(zhuān)利名稱(chēng)：環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)肺炎衣原體的方法及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌的快速檢測(cè)技術(shù)，具體的說(shuō)是涉及一種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)肺炎 衣原體的方法及檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
肺炎衣原體(chlamydia pneumoniae, CPn)是1989年新定名和分類(lèi)的第三種衣 原體，是引起人類(lèi)急性呼吸道感染的重要致病原，臨床上不僅可引起呼吸系統(tǒng)感染性疾病 (肺炎、支氣管炎、鼻竇炎和咽炎)，而且在心血管疾病、哮喘、結(jié)節(jié)病患者中也發(fā)現(xiàn)較高的 抗體水平，近年又發(fā)現(xiàn)Cpn與AS有密切相關(guān)。目前，肺炎衣原體的病原學(xué)檢查主要有以下方法，一是從氣管或鼻咽吸取物做細(xì) 胞培養(yǎng)，此培養(yǎng)法，由于肺炎衣原體只能在活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，分離培養(yǎng)方法復(fù)雜，所需時(shí) 間長(zhǎng)，對(duì)操作人員要求高，而且敏感性不高，不便于臨床快速診斷。二是用熒光結(jié)合的肺炎 衣原體特異性單克隆抗體來(lái)鑒定細(xì)胞培養(yǎng)中的肺炎衣原體，值得注意的是，熒光顯微鏡的 質(zhì)量及操作熟練程度會(huì)影響免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果。三是用PCR檢測(cè)標(biāo)本中肺炎衣原體DNA， 此方法檢測(cè)程序相對(duì)復(fù)雜且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境要求較高，此方法容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000 年開(kāi)發(fā)出的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根據(jù)不同靶序列設(shè)計(jì) 的兩對(duì)特殊的內(nèi)引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3)，特異地識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域。 LAMP在恒溫(65°C )的條件下反應(yīng)1小時(shí)即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)熒光染色直接目測(cè) 比色就可以得到清晰的反應(yīng)結(jié)果。不需要長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)，不需要PCR等昂貴的儀器，不 需要繁瑣的電泳紫外觀察等過(guò)程。LAMP具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能代替PCR方法 的最新技術(shù)。現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)及胚胎性別鑒定等領(lǐng)域，如何運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫 擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)臨床肺炎衣原體在臨床診斷技術(shù)發(fā)展中具有重大意義，因此開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單快 速、檢測(cè)效率高的運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)肺炎衣原體的方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)效 率高的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)肺炎衣原體的方法及檢測(cè)試劑盒，本方法提高了肺炎衣原體的 診斷效率，解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法滿(mǎn)足臨床診斷的發(fā)展要求。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是首先通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)序得到肺炎衣原體的Pl基因序列 如序列表N0. 5所示，并通過(guò)專(zhuān)業(yè)軟件設(shè)計(jì)用于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)的特異性寡核苷 酸引物，以引物序列組擴(kuò)增待測(cè)樣品模板，進(jìn)行目的基因片段的特異性擴(kuò)增，其檢測(cè)方法的 步驟包括(1)基因提取步驟，從待檢樣品中提取模板DNA ；(2)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)步驟，將上述模板DNA加入反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其 中所使用的引物序列如下
F3 5-AGCCAAGCCTACTGGATC-3B3 5-AACGAGATTGAACGCTGT-3FIP 5-ACCACTCTGCATCGTGTAAATGTACTACTGCCGTAGATAGACC-3BIP 5-GGCTTCATTGCCTTAAACATTTGGAGAGTTTCCTCTAATGTAACCAT-3 ；(3)結(jié)果檢測(cè)步驟，選擇以下三種擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法中的任意一種進(jìn)行檢測(cè)A 將擴(kuò)增產(chǎn)物離心目測(cè)白色沉淀來(lái)檢測(cè)結(jié)果；B 加入顯色液觀察反應(yīng)液顏色來(lái)檢測(cè)結(jié)果；C 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)電泳帶形分析檢測(cè)結(jié)果。上述步驟(2)中環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為60 ~ 65 "C 45 90 分鐘；80 95°C 3 5 分鐘。其中采用A方法檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果會(huì)產(chǎn)生白色沉淀。在環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中， dNTP不斷添加進(jìn)新合成的核苷酸鏈，同時(shí)會(huì)生成大量的副產(chǎn)物——焦磷酸鎂。焦磷酸鎂是 一種白色沉淀物，由于整個(gè)擴(kuò)增試驗(yàn)都是在ere左右進(jìn)行，所以焦磷酸鎂沉淀無(wú)法溶解，最 終，隨著陽(yáng)性核苷酸鏈的增加，焦磷酸鎂沉淀也在不斷積累。從而在反應(yīng)結(jié)束后可以直接通 過(guò)觀察白色沉淀而確定陽(yáng)性反應(yīng)。采用B方法檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果如果加入SYBR Green染料，溶液變?yōu)榫G色。陽(yáng)性的 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增會(huì)合成大量的核苷酸鏈。反應(yīng)后，向陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR Green染料 后，SYBR Green分子會(huì)大量嵌入核苷酸鏈中，從而使SYBR Green分子產(chǎn)生綠色熒光。而陰 性結(jié)果由于沒(méi)有目的基因片段，無(wú)法擴(kuò)增出核苷酸鏈，SYBR Green也無(wú)法同核苷酸鏈結(jié)合， 結(jié)果只能是橙色。如采用C方法檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果在電泳中表現(xiàn)為階梯狀電泳條帶。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò) 增的原理是，F(xiàn)IP引物雜交在目標(biāo)DNA的F2C區(qū)段，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，導(dǎo)致DNA啞鈴狀結(jié)構(gòu)的 產(chǎn)生。此啞鈴狀結(jié)構(gòu)很快以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸，形成莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，該莖-環(huán) 結(jié)構(gòu)是LAMP法基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。LAMP反應(yīng)以此DNA結(jié)構(gòu)為起始結(jié)構(gòu)，進(jìn)行再循環(huán) 和延伸，靶DNA序列大量交替重復(fù)產(chǎn)生，形成的擴(kuò)增產(chǎn)物是有許多環(huán)的花椰菜形狀的莖一 環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA。因此隨著擴(kuò)增的不斷進(jìn)行，積累了以這一環(huán)狀結(jié)構(gòu)為基數(shù)的核苷酸鏈，反映 在電泳中即表現(xiàn)為形成階梯狀電泳條帶。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于上述檢測(cè)方法的檢測(cè)試劑盒，包括以下成分
成分
擴(kuò)增體系預(yù)混合物
引物F3
引物B3
引物FIP
引物BIP
Bst DNA聚合酶
雙蒸水
濃度加樣量
2X12. 5μ L
5 15pmol/ μ LIyL
5 15pmol/ μ LIyL
20 ~ 40pmol/y L1 μ L
20 ~ 40pmol/y L1 μ L
8U/ μ L1 μ L
5. 5 μ L ；
上述的擴(kuò)增體系預(yù)混合物中含有2. 5 μ L IOXThermoPol反應(yīng)緩沖液、
4μ L10mmol/L dNTPU μ L 100mmol/L 硫酸鎂、5 μ L 5mol/L 甜菜堿；
4
其中，10XThermoPol反應(yīng)緩沖液含有200mM pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽 酸、IOOmM的氯化鉀、IOOmM的硫酸銨、20mM的硫酸鎂和的曲拉通X-100 ；其中所述dNTP 中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的質(zhì)量比為1 1 1 1。此外為了測(cè)試本試劑盒的檢測(cè)靈敏度，還可取不同稀釋度的模板DNA，濃度分別為 ΙΟ5、ΙΟ4、103、102ccu/ml，按上述步驟進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)，結(jié)果顯示本檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度 為 100ccu/mlo本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的檢測(cè)方法和傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法相比，基于環(huán) 介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增的鑒定方法更適用于直接從患者含菌體液、體液培養(yǎng)物等臨床樣品中擴(kuò)增靶 基因，只需要一次環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)就能夠檢測(cè)肺炎衣原體是否存在，大大提高了檢測(cè) 效率。相比較其他PCR方法，本方法僅需要簡(jiǎn)單是設(shè)備——'〖亙溫水浴箱、離心機(jī)或普通電泳 設(shè)備(電泳儀)即可，大大提高了性?xún)r(jià)比節(jié)約了成本。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、 特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確的鑒定目標(biāo)菌。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增鑒 定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法準(zhǔn)確。本發(fā)明試劑盒是 根據(jù)肺炎衣原體的Pl基因序列為肺炎衣原體各不同菌株型所共有，以保證從種的水平上 檢測(cè)不用來(lái)源的肺炎衣原體的可靠性；以及本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為lOOccu/ml，既提供 了結(jié)果觀察直觀、簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)途徑也保證了檢測(cè)的特異性和靈敏度。


圖1是環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物離心后待測(cè)樣品目測(cè)沉淀結(jié)果試管底部可見(jiàn)明顯白 色沉淀，陰性對(duì)照沒(méi)有沉淀；其中1 陰性對(duì)照；2 陽(yáng)性結(jié)果；圖2是環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green后染色結(jié)果待測(cè)樣品溶液呈現(xiàn)綠 色，陰性對(duì)照為橙色；其中1 陰性對(duì)照；2 陽(yáng)性結(jié)果；圖3是環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)結(jié)果待測(cè)樣品出現(xiàn) 階梯狀條帶，陰性對(duì)照沒(méi)有條帶；其中1 marker ；2 陰性對(duì)照；3 陽(yáng)性結(jié)果；圖4是本試劑盒的靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果；其中M :marker ；N 陰性對(duì)照；1 模板 濃度為105CCu/ml ；2 模板濃度為104CCu/ml ；3 模板濃度為103CCu/ml ；4 模板濃度為 102ccu/ml ο
具體實(shí)施例方式下面就具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述采用本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)程序包 括下列步驟1、待檢樣品DNA提取(1)取200 μ L待檢樣品或100 μ L菌培養(yǎng)液置于1. 5mL無(wú)菌離心管中，加入600 μ L 懸浮液(15% ChelexlOO 樹(shù)脂、100mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 0、0· lmmol/L EDTA、0.1% 疊氮 鈉)，振蕩器上充分混勻30秒；(3)于沸水浴中煮沸10分鐘，后于冰上迅速冷卻；(4)放入離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5 10分鐘，取上清到無(wú)菌離心管中，即為待 檢模板DNA。
2、肺炎衣原體的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(1)其中用于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的試劑盒包括環(huán)介導(dǎo)恒溫反應(yīng)管，它包括12. 5 μ L的擴(kuò)增體系預(yù)混合物、1 μ L 5 15pmol/ μ L 的引物F3、lyL 5 15pmol/yL 的弓丨物B3、lyL 20 40pmol/μ L 的引物FIP、1 μ L 20 40pmol/y L的引物BIP,5. 5 μ L的無(wú)菌雙蒸水。其中，擴(kuò)增體系預(yù)混合物中含有2. 5 μ L IOXThermoPol反應(yīng)緩沖液、 4μ L10mmol/L dNTP、l μ L 100mmol/L 硫酸鎂、5 μ L 5mol/L 甜菜堿；10 X ThermoPol 反應(yīng)緩 沖液含有200mM pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、IOOmM的氯化鉀、IOOmM的硫酸銨、 20mM的硫酸鎂和1 %的曲拉通X-100 ；其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的質(zhì)量比為1 1 1 1。以及8U/y L的Bst DNA聚合酶。(2)在裝有22 μ L LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 μ L待檢樣品模板DNA和1 μ L Bst DNA聚合酶。(3)于恒溫水浴箱或金屬浴中60 65°C放置45 90分鐘。(4)于80 95°C放置3 5分鐘中止反應(yīng)，取出觀察結(jié)果。3、結(jié)果觀察(1)室溫10，OOOg離心5分鐘，陽(yáng)性結(jié)果在試管底部可見(jiàn)白色沉淀(圖1)；(2)加入顯色劑，陽(yáng)性結(jié)果為綠色(圖2)；(3) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性結(jié)果有梯狀電泳條帶(圖3)。選擇以上三種檢測(cè)方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測(cè)。4、靈敏度檢測(cè) 取不同稀釋度的模板DNA，濃度分別為ΙΟ5、ΙΟ4、103、102ccu/ml，按上述步驟進(jìn)行檢 測(cè)，結(jié)果顯示(如圖4所示)本檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度為lOOccu/ml。
權(quán)利要求
一種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)肺炎衣原體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)基因提取步驟，從待檢樣品中提取模板DNA；(2)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)步驟，將上述模板DNA加入反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中所使用的引物序列如下F3 5-AGCCAAGCCTACTGGATC-3B3 5-AACGAGATTGAACGCTGT-3FIP 5-ACCACTCTGCATCGTGTAAATGTACTACTGCCGTAGATAGACC-3BIP 5-GGCTTCATTGCCTTAAACATTTGGAGAGTTTCCTCTAATGTAACCAT-3；(3)結(jié)果檢測(cè)步驟，選擇以下三種擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法中的任意一種進(jìn)行檢測(cè)A將擴(kuò)增產(chǎn)物離心目測(cè)白色沉淀來(lái)檢測(cè)結(jié)果；B加入顯色液觀察反應(yīng)液顏色來(lái)檢測(cè)結(jié)果；C1.5％瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)電泳帶形分析檢測(cè)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)肺炎農(nóng)原體的方法，其特征在于，上述 步驟(2)中環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為60 65 °C 45 90分鐘； 80 95°C 3 5分鐘。
3.一種用于權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)肺炎衣原體的方法的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括以下成分成分濃度加樣量擴(kuò)增體系預(yù)混合物2 X12. 5 μ L弓丨物 F35 15pmol/y L1 μ L弓丨物 Β35 15pmol/y L1 μ L引物 FIP20 40pmol/yL1 μ L引物 BIP20 40pmol/yL1 μ LBst DNA 聚合酶8U/ μ L1 μ L雙蒸水5.5yL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)肺炎衣原體的檢測(cè)試劑盒，其特征在 于，其中擴(kuò)增體系預(yù)混合物中含有2. 5μ L IOXThermoPol反應(yīng)緩沖液、4 μ L 10mmol/L dNTP、l μ L 1 OOmmo 1/L 硫酸鎂、5 μ L 5mol/L 甜菜堿。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)效率高的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)肺炎衣原體的方法及檢測(cè)試劑盒，主要方案步驟為設(shè)計(jì)了引物組序列，采用利用檢測(cè)試劑盒對(duì)待檢樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，其環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法包括室溫10,000g離心5分鐘后陽(yáng)性結(jié)果在試管底部可見(jiàn)白色沉淀；加入顯色劑，陽(yáng)性結(jié)果為綠色；1.5％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果有梯狀電泳條帶；可以選擇以上三種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度為100ccu/ml，可以快速準(zhǔn)確地鑒定特異的目標(biāo)菌，從而解決了傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法滿(mǎn)足臨床檢測(cè)發(fā)展要求的現(xiàn)狀。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101886122SQ201010174440
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者于丹, 孫宜峰, 曾冰冰 申請(qǐng)人:珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司