專利名稱：一種檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物傳染病檢測領(lǐng)域，具體的是涉及一種檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒。技術(shù)背景
衣原體是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的，大小介于細(xì)菌和病毒之間的革蘭氏陰性微生物，能在雞胚和易感脊椎動物的細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，具有獨(dú)特的雙階段發(fā)育周期。衣原體感染在世界范圍內(nèi)廣為流行，是一種能夠引物人和動物患病的人畜共患病原體。依據(jù)衣原體核糖體rRNA的序列比對以及多形態(tài)限制性酶切位點(diǎn)的分析，將衣原體科分為衣原體屬和嗜性衣原體屬。衣原體屬包含沙眼衣原體、豬衣原體和鼠衣原體；嗜性衣原體屬包含鸚鵡熱嗜性衣原體、流產(chǎn)嗜性衣原體、肺炎嗜性衣原體、家畜嗜性衣原體、貓嗜性衣原體以及豚鼠嗜性衣原體。
衣原體具有廣泛的宿主，家畜中羊、牛、豬以及各種家禽均可感染發(fā)病。豬感染衣原體后，臨床癥狀主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、產(chǎn)弱仔等；各年齡段豬表現(xiàn)為肺炎、腸炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、心包炎以及結(jié)膜炎等；公豬感染后主要發(fā)生睪丸炎、附睪炎以及尿道炎等。
1955年，美國人winigan等首先發(fā)現(xiàn)衣原體對豬具有致病性，他們從患心包炎病豬病料分離出了衣原體。羅馬尼亞學(xué)者Sorodok等1959年和1965年分別報道了豬群感染衣原體，發(fā)生肺炎，大批母豬流產(chǎn)及新生仔豬死亡的病例。此后，英國、前蘇聯(lián)、德國和日本也陸續(xù)報道表現(xiàn)不同癥狀的豬衣原體病。我國從80年代開始關(guān)注和研究豬衣原體病。楊宜生等在國內(nèi)首先報道豬衣原體病，他們從流產(chǎn)母豬和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎仔豬的病料中分別分離出衣原體。90年代后，豬衣原體感染呈上升趨勢，我國各省均有衣原體感染豬導(dǎo)致流產(chǎn)、 死胎等的報道，而且衣原體血清學(xué)調(diào)查報告顯示各省規(guī)?；i場中衣原體血清學(xué)檢測結(jié)果陽性率普遍較高。邱昌慶等O000)對河北省衡水地區(qū)某規(guī)?；i場的豬衣原體病進(jìn)行檢測，陽性率達(dá)35%。高雙娣等報道甘肅省豬衣原體病的流行情況，對甘肅省7個市 (地)的部分豬場豬群用間接血凝試驗(yàn)進(jìn)行衣原體血清抗體檢測，共檢測468份豬血清，總陽性率達(dá)34. 496，個別地區(qū)的陽性率高達(dá)67%。白挨泉等Q004)對廣東部分地區(qū)豬衣原體病的血清學(xué)做了調(diào)查，10個豬場的陽性率為14. 3%-94. 1%。王海志Q004)對遼寧鐵嶺市6 個規(guī)模較大的養(yǎng)豬場的豬衣原體病進(jìn)行了調(diào)查，平均陽性率達(dá)5. 16%。索緒峰等Q005)對海南省部分市縣13個豬場的972份血清用間接血凝試驗(yàn)進(jìn)行豬衣原體病抗體檢測，結(jié)果顯示豬場整體抗體陽性率為49. 596，其中母豬群抗體陽性率為53. 66%。陸文俊(2006)對廣西部分地市豬場衣原體病調(diào)查，結(jié)果顯示平均陽性率為20. 77%。近些年來，各省家畜疫病普查表明，豬衣原體病在我國大部分地區(qū)都有流行，而且陽性感染率呈現(xiàn)增高趨勢。分析原因主要是對衣原體對養(yǎng)豬業(yè)的危害認(rèn)識不夠，防控意識不強(qiáng)。同時，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬場的快速發(fā)展，針對衣原體病的診斷沒有很好的方法可以應(yīng)用。
眾多研究者對牛的衣原體病和禽類的衣原體病關(guān)注較多，而對豬的衣原體病研究3較少。傳統(tǒng)的豬衣原體病檢測方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)法、血凝實(shí)驗(yàn)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等， 而這些實(shí)驗(yàn)方法都不同程度的存在缺陷。細(xì)胞培養(yǎng)法操作繁瑣、周期長等；血凝實(shí)驗(yàn)的敏感度低；而已有的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中所用包被抗原均為全病原，這對具有種間特異性的衣原體診斷并不適合，而且存在容易造成病原擴(kuò)散的潛在危險性?，F(xiàn)在普遍應(yīng)用的PCR檢測技術(shù)對實(shí)驗(yàn)條件要求較高，目前尚難以普及。因此，開發(fā)一種簡便、高效、廉價的豬衣原體抗體檢測試劑盒無論對于科學(xué)研究亦或是臨床檢測豬衣原體病的流行狀況等都有重要的意義。
衣原體的外膜蛋白主要包括40kDa的主要外膜蛋白(Μ0ΜΡ)、富含半胱氨酸的 60kDa的大蛋白和12kDa的小蛋白等組成。40kDa的衣原體主要外膜蛋白(MOMP)占衣原體外膜蛋白的60%以上，具有血清型、亞種、種和屬特異性抗原決定簇，大量實(shí)驗(yàn)研究表明該蛋白是衣原體的主要保護(hù)性抗原。在牛的衣原體病及禽類的衣原體病檢測方面或者是亞單位疫苗的研制中，MOMP均作為目的抗原而被大量研究。但是衣原體的MOMP蛋白具有種屬特異性，這些實(shí)驗(yàn)方法在檢測豬的衣原體病方面存在局限性。迄今為止，尚未有推廣應(yīng)用的用于檢測豬衣原體病的方法報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)而提供一種快速、準(zhǔn)確檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒，可供科學(xué)研究使用以及臨床對豬衣原體病的監(jiān)測及診斷等臨床應(yīng)用。
本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有抗原包被的酶標(biāo)板、陽性對照血清、陰性對照血清、羊抗豬酶標(biāo)二抗、樣品稀釋液、洗滌液、封閉液、底物緩沖液A、底物緩沖液B和終止液，其中抗原包被的酶標(biāo)板上包被有重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP。
按上述方案，所述的重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP的包被濃度為0. 97 μ g/mL。
按上述方案，所述的陽性對照血清和陰性對照血清使用時與樣品稀釋液的稀釋比均為1:50，所述的羊抗豬酶標(biāo)二抗使用時與樣品稀釋液的稀釋比為1:5000。
按上述方案，所述的重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP的制備方法是1)以臨床分離的豬源衣原體為病原株，提取病原株的總DNA為模板，經(jīng)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到主要外膜蛋白MOMP全基因片段，對其核苷酸序列進(jìn)行測定并分析預(yù)測其信號肽位點(diǎn)及抗原表位分布，依據(jù)上述分析測定結(jié)果，利用主要外膜蛋白MOMP全序列上天然存在的ife // I位點(diǎn)，選取主要外膜蛋白MOMP上無信號肽、抗原性強(qiáng)、而且抗原表位均位于其表面的部分片段；2)將主要外膜蛋白MOMP截取部分的片段與pET-28a連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定，測序，篩選出正確連接的陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-M0MP ；將此重組質(zhì)粒pET48a-M0MP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、鎳離子親和層析純化得到得到重組豬流產(chǎn)嗜性衣原體主要外膜蛋白rMOMP。
按上述方案，所述的特異性引物為 上游 Pl -.ttaggaiccATGAAAAAACTCTTGAAATCG ； 下游 P2 :gcg§"ic^acTTAGAATCTGAATTGAGC。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1)本發(fā)明填補(bǔ)了豬衣原體病臨床診斷中檢測方法的空白，已有的診斷家畜衣原體病的 ELISA檢測試劑盒都是從?；蛘咔蓊惙蛛x的病原株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對其病原株的主要外膜蛋白MOMP進(jìn)行原核表達(dá)得到的蛋白抗原，而衣原體對宿主具有選擇性和依賴性，因此，這些檢測試劑盒對豬衣原體的檢測靈敏度不高，本發(fā)明則已從臨床發(fā)病的豬源分離到的病原衣原體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；2)本發(fā)明所用于包被的蛋白抗原，是經(jīng)分子生物學(xué)軟件預(yù)測及實(shí)驗(yàn)分析后對主要外膜蛋白MOMP全基因序列進(jìn)行選擇性的克隆表達(dá)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中將主要外膜蛋白MOMP基因序列中的信號肽部分以及無抗原性的部分切去，只對抗原性較強(qiáng)而且位于外膜表面的部分進(jìn)行克隆表達(dá)；3)本發(fā)明中原核表達(dá)產(chǎn)生的蛋白包涵體溶解后，除去了影響抗原抗體特異性反應(yīng)的雜蛋白；4)本發(fā)明中原核表達(dá)產(chǎn)生的蛋白采用鎳離子親和層析住純化后的蛋白經(jīng)透析復(fù)性，蛋白構(gòu)象得以恢復(fù)自然狀態(tài)，免疫學(xué)活性較好；5)本發(fā)明的生產(chǎn)過程安全性高，不存在有害微生物擴(kuò)散的危險。而且采用原核表達(dá)制備蛋白抗原已有成熟的發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)，生產(chǎn)成本低，質(zhì)量容易保證，適于科研應(yīng)用及臨床推廣。


圖1為以提取的衣原體基因組為模板，P1、P2為引物，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；其中，1、Mark DL2000 ；2、衣原體主要外膜蛋白MOMP PCR產(chǎn)物；圖2為MOMP表面抗原位點(diǎn)分析結(jié)果； 圖3為MOMP全基因序列信號肽預(yù)測結(jié)果；圖4為蛋白表達(dá)及純化結(jié)果SDS-PAGE檢測結(jié)果；其中，1、蛋白質(zhì)Marker ；2、3、pET_28a 誘導(dǎo)前后；4、5重組M0MP-pET-28a誘導(dǎo)前后；6、包涵體上清；7、8、9、三個不同咪唑濃度洗脫液；10、濃縮后的重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP ；圖5為純化后的蛋白Western-blot檢測結(jié)果，1、與陽性血清反應(yīng)結(jié)果；2、4、蛋白質(zhì) Marker ；3、與陰性血清反應(yīng)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，可以理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1 1)M0MP基因擴(kuò)增以臨床分離的豬源衣原體為病原株接種SPF雞胚，收集72h以后規(guī)律死亡的雞胚卵黃囊液。以此為原料使用Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit商品化的試劑盒提取提取分離衣原體的基因組，也就是總DNA模板取適量卵黃囊液于1. 5mL離心管中， 3000r/min離心lOmin，取上清，再15000r/min離心30min，棄沉淀，按照試劑盒操作步驟提取基因組。
根據(jù)Genbank中衣原體主要外膜蛋白MOMP全基因序列設(shè)計(jì)兩條特異性引物 上游 Pl -.ttaggaiccATGAAAAAACTCTTGAAATCG (斜體部分為及I 酶切位點(diǎn)) 下游 Ρ2 :gcg§"ic^acTTAGAATCTGAATTGAGC (斜體部分為 5 / I 酶切位點(diǎn))上下游引物使用的限制性內(nèi)切酶分別是及 // I和5 / I，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以提取的衣原體全基因組為模板，特異性的引物P1、P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)(圖1，PCR產(chǎn)物1200bp左右)。反應(yīng)體系=PCR MIX 25ul，上下游引物P1、P2各0. 5ul，模板 4ul，加 ddH20 20ul 至總體積 50ul ；反應(yīng)程序?yàn)?94°C 2min，94°C 15s，58°C 30s, 72°C lmin, 30個循環(huán)，72°C 10min，4°C池。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定有無目的條帶。采用 Axyft·印凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，得到主要外膜蛋白MOMP全基因片段，并送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序； 2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pETj8a-M0MP使用DNAstar、SignalP 3.0 krver等軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，依據(jù)分析結(jié)果(圖2， 從圖中可看出第20-90位氨基酸殘基之間的區(qū)段雖然抗原性位點(diǎn)較強(qiáng)但是其可能不是表面抗原位點(diǎn)，而在100位、240位以及345位氨基酸殘基處抗原性較強(qiáng)，而且均可能為表面抗原位點(diǎn)；圖3，全部391個氨基酸殘基中最有可能為信號肽的是前22個氨基酸殘基)，利用衣原體主要外膜蛋白MOMP全序列上天然存在的及 /7 I位點(diǎn)，選取主要外膜蛋白MOMP上無信號肽、抗原性強(qiáng)、而且抗原表位均位于蛋白表面的部分片段(271bp-1176bp)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-28a-M0MP。
職BamH I和5 / I對PCR回收產(chǎn)物及質(zhì)粒pET48a進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系PCR 產(chǎn)物酶切 IOXT Buffer BamH 1 2ul,5a7 1 2ul，PCR 產(chǎn)物 8ul，加 ddH20 22ul 至總體積 40ul ；質(zhì)粒酶切 IOXT Buffer 15ul, BamH 1 4ul, Sal 1 4ul，質(zhì)粒 20ul，加 ddH20 57ul 至總體積 100ul，37°C水浴 4h。使用 DNA Fragment Purification Kit Ver. 2. 0 對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切正確后，采用DNA Fragment Purification Kit Ver. 2. 0 DNA片段試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。將帶有黏性末端的酶切產(chǎn)物使用T4DNA連接酶反應(yīng)體系連接，連接產(chǎn)物(含ρΕΤ48ει-Μ0ΜΡ重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化具體步驟詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，96-99)。篩選出陽性克隆后，小量搖菌，使用Ε. Ζ. N. A. Plasmid Mimi Kit 1試劑盒從菌液提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切鑒定，以確定目的片段正確克隆入載體，同時將提取的質(zhì)粒送上海生工測序。測序結(jié)果顯示目的片段正確插入質(zhì)粒pET48a，獲得正確的重組質(zhì)粒ρΕΤ48ει-Μ0ΜΡ。
3)目的蛋白原核表達(dá)步驟2)中構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pETj8a-M0MP轉(zhuǎn)化表達(dá)載體五coli BL21 (ED3)。轉(zhuǎn)化具體步驟詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，1228-1232)。篩選出的陽性菌落小量搖菌， 5mlLB/瓶，37度搖床他；4°C過夜；按1 100體積比接種400mlLB大量搖菌，3h后加誘導(dǎo)劑 IPTG至終濃度IMm/L，繼續(xù)37°C搖床4h ；富集菌體，8000r，5min，于兩個50mlEP管中；每管加BufferA20ml，重懸；超聲破碎菌體，3min/次，間隔3min，破碎10次左右；破碎完全后 12000r/min, IOmin ；上清為包涵體上清，留樣待檢，包涵體沉淀加BufferA洗滌兩次。
4)目的蛋白純化步驟3)中制備的包涵體沉淀使用鎳離子親和層析法進(jìn)行純化，除去雜蛋白。具體操作方法每管包涵體沉淀各加20ml鎳柱親合層析平衡緩沖液(含8M/L尿素)，4°C過夜；鎳離子親和層析填料用平衡緩沖液洗滌兩次，500g/min，5min ；將玻璃柱固定在鐵架臺上，加 IOml平衡緩沖液潤洗玻璃柱；加洗滌完成的填料，使其自然沉降；4°C過夜的包涵體溶液 12000r/min, 5min,棄沉淀，用IOml —次性注射器將包涵體溶液緩慢加入到玻璃柱中，作用 30min ；松開止血鉗，收集穿流液；蛋白加完后，加40ml平衡緩沖液，洗去未結(jié)合的雜蛋白； 依次用含100mM/L、200 mM/L、300 mM/L咪唑洗脫目的蛋白；洗脫完成后，洗脫液中加終濃度為0. 2%的聚乙二醇4000 (PEG4000)，1. OmM/L的氧化型谷胱甘肽及2. OmM/L的還原型谷胱甘肽，4°C過夜；PBS透析6h/次，3次；透析完成后使用蔗糖濃縮蛋白洗脫液；收集蛋白， 1. 5mlEP管分裝，-70保存。
5 )蛋白表達(dá)及純化結(jié)果SDS-PAGE檢測步驟3-4)中誘導(dǎo)表達(dá)和純化過程中的蛋白樣品，雙蒸水以及SDS-PAGE上樣緩沖液按照1 5 4的比例配制成200ul樣品，沸水中煮沸IOmin制成電泳樣品；SDS-PAGE分離膠和濃縮膠配制過程及膠架的安裝過程詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，1713-1720);待膠塊凝固后，加甘氨酸緩沖液，取制備好的蛋白樣品上樣，電泳，80V至分離膠時調(diào)高電壓至120V 至電泳完成；取出膠塊剝離上面濃縮膠層，考馬斯亮藍(lán)染色4h ；用脫色液進(jìn)行脫色4h ；組后觀察蛋白表達(dá)及純化過程中蛋白情況，照相(圖4，誘導(dǎo)后在預(yù)計(jì)分子量大小的地方有明顯的蛋白表達(dá)條帶，經(jīng)純化后，雜蛋白基本被去除)。
6) Western-blot 檢測蛋白活性按照步驟5)中步驟SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后取出膠塊進(jìn)行ffestern-blot，具體方法轉(zhuǎn)膜，將兩個蛋白泳道與各自相鄰的Marker切下來，用尺子量出大小，裁剪出同樣的大小6層重疊的濾紙；再裁剪出比之大約3-4mm的NC膜；將3層濾紙用轉(zhuǎn)移液浸透后放在電轉(zhuǎn)板上，將膠塊放上，再加上NC膜，最后再加上剩余的3張濾紙，壓平，蓋好電轉(zhuǎn)儀的蓋子； 接通電壓，80mA，45min ；轉(zhuǎn)移結(jié)束后進(jìn)行封閉，將NC膜放入加有封閉液的平皿中，振蕩池； 加標(biāo)準(zhǔn)豬衣原體陽性血清和陰性血清，各1:50稀釋加樣，4°C過夜；TBST洗滌三遍，加二抗 HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG，37°C溫育Ih ；TBST洗滌三遍，加DAB顯色液顯色；最后用蒸餾水洗滌三遍，觀察結(jié)果，照相(圖5，僅與衣原體陽性血清發(fā)生顯色，表明重組衣原體主要外膜蛋白 rMOMP有良好的免疫反應(yīng)原性)。
7)標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清制備臨床分離的病原接種雞胚后，收集7 后無細(xì)菌感染死亡的雞胚，收集卵黃囊液經(jīng)甲醛滅活后制成油乳劑滅活苗。用此疫苗免疫30日齡的健康長白豬，最后采集血清，檢測效價。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清效價在1:800左后。
標(biāo)準(zhǔn)陰性血清采自健康的經(jīng)檢測無衣原體感染的健康豬。
實(shí)施例2建立ELISA檢測方法 1試劑配制包被液(PH9. 6碳酸鹽緩沖液)=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加雙蒸水補(bǔ)齊至1000ml, 調(diào)PH至9. 6。
洗滌液(含0.05%的了界6611-20的卩85):妝(18. 0g, KCl 0. 2g, Na2HP03*12H20 2. 9g, KH2PO4 0. 2g, Tween-20 0. 5ml，加雙蒸水補(bǔ)齊至 1000ml，調(diào) pH 至 7. 4。
樣品稀釋液0. IgBSA溶于100ml洗滌液。
封閉液IgBSA溶于IOOml洗滌液。
底物緩沖液A =Na2HPO4 14.6g、檸檬酸9. 33g、過氧化氫脲0. 52g，加雙蒸水 CddH2O)定容至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH至5. 0-5. 4，無菌分裝，IOmL/瓶。
底物緩沖液B 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)20mg、無水乙醇10mL，加雙蒸水(ddH20)定容至 1 OOOmL，無菌分裝，IOmL/瓶。
終止液氫氟酸(40%) 625 4 1^，加雙蒸水((1(^20)定容至IOOmL,無菌分裝，IOmL/瓶。
2蛋白最佳包被濃度和血清最佳稀釋度選擇方陣滴定法將步驟4)中純化得到的重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP用包被液倍比稀釋包被8個濃度，第一行從1:25開始，IOOul/孔；4°C過夜后，洗滌3次，每次^iin ；每孔加封閉液200ul，37°C溫育Ih ；洗滌3次，每次;3min;將陰陽性血清分別從1:50稀釋開始，橫向倍比稀釋，8個濃度滴度，IOOul/孔，37°C溫育Ih ；洗滌3次，每次;3min ；加SoutherBiotech 公司HRP標(biāo)記的羊抗豬1 5000稀釋液，IOOul/孔，37°C溫育Ih ；洗滌3次，每次3min ；加底物緩沖液A和B，各一滴，Smin后加終止液，酶標(biāo)儀測OD63tl。檢測結(jié)果如表1所示。從表1 和表2數(shù)據(jù)可判定蛋白稀釋160倍(0. 97 μ g/mL)，血清稀釋50倍時，P/N值最大。
權(quán)利要求
1.一種檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有抗原包被的酶標(biāo)板、陽性對照血清、陰性對照血清、羊抗豬酶標(biāo)二抗、樣品稀釋液、洗滌液、封閉液、底物緩沖液A、底物緩沖液B和終止液，其中抗原包被的酶標(biāo)板上包被有重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP。
2.按權(quán)利要求1所述的檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述的重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP的包被濃度為0. 97 μ g/mL。
3.按權(quán)利要求1或2所述的檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述的陽性對照血清和陰性對照血清使用時與樣品稀釋液的稀釋比均為1:50，所述的羊抗豬酶標(biāo)二抗使用時與樣品稀釋液的稀釋比為1:5000。
4.按權(quán)利要求3所述的檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述的重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP的制備方法是1)以臨床分離的豬源衣原體為病原株，提取病原株的總DNA為模板，經(jīng)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到主要外膜蛋白MOMP全基因片段，對其核苷酸序列進(jìn)行測定并分析預(yù)測其信號肽位點(diǎn)及抗原表位分布，依據(jù)上述分析測定結(jié)果，利用主要外膜蛋白MOMP全序列上天然BamH I位點(diǎn)，選取主要外膜蛋白MOMP上無信號肽、抗原性強(qiáng)、而且抗原表位均位于其表面的部分片段；2)將主要外膜蛋白MOMP截取部分的片段與pET-28a連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定，測序，篩選出正確連接的陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-M0MP ；將此重組質(zhì)粒pET48a-M0MP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、鎳離子親和層析純化得到得到重組豬流產(chǎn)嗜性衣原體主要外膜蛋白rMOMP。
5.按權(quán)利要求4所述的檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述的特異性引物為上游 Pl -.ttaggaiccATGAAAAAACTCTTGAAATCG ；下游 P2 :gcg§"ic^acTTAGAATCTGAATTGAGC。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的ELISA試劑盒，包括有抗原包被的酶標(biāo)板、陽性對照血清、陰性對照血清、羊抗豬酶標(biāo)二抗、樣品稀釋液、洗滌液、封閉液、底物緩沖液A、底物緩沖液B和終止液，其中抗原包被的酶標(biāo)板上包被有重組衣原體主要外膜蛋白rMOMP。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于填補(bǔ)了豬衣原體病臨床診斷中檢測方法的空白，生產(chǎn)過程安全性高，不存在有害微生物擴(kuò)散的危險。而且采用原核表達(dá)制備蛋白抗原已有成熟的發(fā)酵罐規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)，生產(chǎn)成本低，質(zhì)量容易保證，適于科研應(yīng)用及臨床推廣。
文檔編號G01N33/566GK102520166SQ20111036764
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者劉澤文, 周丹娜, 楊克禮, 段正贏, 田永祥, 袁芳艷, 郭銳 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所