肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法。本發(fā)明從肺炎衣原體CpnAR39株基因中獲取cHSP60的序列,設(shè)計(jì)引物序列;用RT-PCR法擴(kuò)增cHSP60的cDNA,并將cHSP60與原核表達(dá)載體pET28a連接,構(gòu)建pET28a-cHSP60重組質(zhì)粒;經(jīng)過克隆、酶切鑒定及核苷酸測序證實(shí),獲得重組的表達(dá)載體pET28a-cHSP60,經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)在E.coliBL21菌株中產(chǎn)生cHSP60-His融合蛋白,獲得的cHSP60-His融合蛋白進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。得到的cHSP60融合蛋白有生物活性,可進(jìn)行與衣原體相關(guān)感染的研究,不局限于以病人進(jìn)行研究。
【專利說明】肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體涉及肺炎衣原體熱休克蛋白60即CHSP60融合蛋白的制備方法及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, Cpn)是一種常見的引起呼吸道疾病的病原體。首次分離于一名患急性眼結(jié)膜炎的臺灣兒童的眼結(jié)膜,暫命名為TW-183 ;1983年,研究人員在美國西雅圖一位急性呼吸道感染病人的咽部分離出另一株衣原體,將其命名為AR3。1989年,該病原體被認(rèn)定為衣原體屬的一個新種,即肺炎衣原體。Cpn主要引起包括肺炎,支氣管炎,咽炎,鼻竇炎,中耳炎等在內(nèi)的急性呼吸道感染,其中肺炎占50%以上,急性支氣管炎占25%。此外,越來越多的證據(jù)表明,Cpn感染還可能造成哮喘、慢性阻塞性肺病、冠心病、心肌梗死、動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)等疾病的發(fā)生。但是目前人們對其中的機(jī)制尚未完全了解。盡管如此,來自實(shí)驗(yàn)室和臨床的證據(jù)表明,Cpn引起的呼吸道及其他心血管疾病與宿主免疫應(yīng)答關(guān)系密切,即機(jī)體產(chǎn)生的抗感染免疫在清除病原體的同時,有可能誘導(dǎo)免疫病理反應(yīng),其中過度的炎癥應(yīng)答是導(dǎo)致局部組織損傷和病變的最重要因素。
[0003]衣原體熱休克蛋白60 (Chlamydia Heat Shock Protein60, cHSP60)為肺炎衣原體的主要抗原成分,具有較強(qiáng)的免疫刺激能力。CHSP60蛋白在由肺炎衣原體所引起的免疫和炎癥反應(yīng)中起著重要的媒介作用。已有研究表明,病原微生物來源的CHSP60蛋白與機(jī)體自身CHSP60蛋白分子之間存在高度同源性,由此形成與宿主之間的免疫交叉反應(yīng),引起超敏反應(yīng)和炎癥的發(fā)生。臨床資料顯示,CHSP60蛋白大量表達(dá)于動脈粥樣硬化斑塊和相應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物的病變組織中。相關(guān)研究表明,CHSP60蛋白反復(fù)、持續(xù)感染血管內(nèi)皮細(xì)胞,可引起內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌一系列生長因子、細(xì)胞因子和粘附因子,導(dǎo)致炎癥性細(xì)胞的聚集、浸潤和粘附,進(jìn)而造成對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用,這可能是引起衣原體相關(guān)AS發(fā)生的一個重要機(jī)制。在慢性感染中,CHSP60蛋白可以活化血管內(nèi)皮細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞,其所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)和免疫病理應(yīng)答與心血管疾病密切相關(guān)。有研究證實(shí)衣原體感染機(jī)體后,血清抗CHSP60蛋白效價和冠心病發(fā)生呈正相關(guān)關(guān)系。在某些肺炎衣原體感染過程中,血清中出現(xiàn)的抗CHSP60蛋白抗體(IgG)會誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗IgG抗體,從而誘發(fā)自身免疫應(yīng)答。此外,CHSP60蛋白反復(fù)、持續(xù)感染血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞分泌一系列生長因子,炎癥因子以及粘附因子,由此產(chǎn)生了單核巨噬細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的聚集,粘附以及向內(nèi)皮下的遷移,而炎癥因子的持續(xù)存在并且損傷組織是發(fā)生慢性炎癥性疾病的根本原因。一些炎癥性疾病包括AS,冠心病,心肌炎等都與Cpn的反復(fù)感染和CHSP60蛋白的持續(xù)存在相關(guān)。最近有研究顯示CHSP60蛋白可引起肺部炎癥的發(fā)生,其主要原因是激活了骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs),引起 DCs 的活化、分化和免疫應(yīng)答。另外有研究顯示cHSP60蛋白能活化抗原提呈細(xì)胞(antigen presentingcell,APC),誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放;也有研究顯示該蛋白可起到免疫佐劑和細(xì)胞因子的作用。這些證據(jù)都顯示CHSP60蛋白與Cpn感染引起的免疫和炎癥應(yīng)答存在密切關(guān)系。
[0004]迄今為止,大部分關(guān)于Cpn的研究都是基于病人的樣本的研究,而且大部分研究是探究CHSP60蛋白與心血管疾病之間的關(guān)系,并沒有將CHSP60蛋白與肺炎關(guān)聯(lián)研究。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法及使用方法。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法,肺炎衣原體熱休克蛋白60即CHSP60,該方法構(gòu)建CHSP60的原核表達(dá)系統(tǒng)pET28a_cHSP60,制備cHSP60_組氨酸標(biāo)簽即cHSP60-His融合蛋白,SEQ ID NO:1,顯示本發(fā)明cHSP60_His融合蛋白的核苷酸序列;所述肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法包括以下步驟:
[0008]步驟(1)
[0009]從肺炎衣原體Cpn AR39株基因中獲取cHSP60的序列,設(shè)計(jì)引物序列;
[0010]引物序列:上游引物,5’-CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3’;下游引物,5’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3,
[0011]步驟(2)
[0012]用RT-PCR法擴(kuò)增CHSP60的cDNA,并將cHSP60與原核表達(dá)載體pET28a連接,構(gòu)建pET28a-cHSP60 重組質(zhì)粒。
[0013]RT-PCR法擴(kuò)增體系為:模板cDNA為2.5 μ I,5’引物與3’引物各加0.4 μ I,2xTaqPlus PCR MasterMix為10 μ 1,最后加雙蒸水補(bǔ)足至Ij 20 μ I。
[0014]反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5分鐘;95°C變性30秒,58°C退火30秒,72°C延伸90秒,進(jìn)行30個循環(huán);72°C延伸5分鐘。
[0015]步驟(3)
[0016]經(jīng)過克隆、酶切鑒定及核苷酸測序證實(shí),獲得重組的表達(dá)載體pET28a-cHSP60,經(jīng)過異丙基硫代半乳糖苷即IPTG的誘導(dǎo)在E.coli BL21菌株中產(chǎn)生cHSP60_His融合蛋白。
[0017]一種肺炎衣原體熱休克蛋白60 (CHSP60)的可溶性蛋白的使用方法:按照誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為1.0mM,誘導(dǎo)溫度30°C,誘導(dǎo)時間6小時進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)cHSP60-His融合蛋白,鑒定cHSP60-His融合蛋白純度,將純化的cHSP60-His融合蛋白加入培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞中。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn),CHSP60能夠誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6和TNF-α,其表達(dá)具有濃度依賴性以及時間依賴性;同時,此發(fā)明顯示CHSP60能夠激活核因子K B亞基即NF-kB的活化和促分裂素原活化蛋白激酶即MAPK通路;將野生型Β6小鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后,于氣管內(nèi)給予多粘菌素B(polymyCin B, PMB)處理過的cHSP60-His融合蛋白,小鼠保持直立位,以 確保液體全部被吸入肺部,6小時后處理小鼠肺部細(xì)胞,證實(shí)CHSP60能夠有效激發(fā)小鼠肺部炎癥反應(yīng)。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明得到的CHSP60融合蛋白具有生物活性,可以用來進(jìn)行與衣原體相關(guān)感染的研究,而不局限于以病人進(jìn)行研究,此外,本發(fā)明還可研究CHSP60蛋白與肺炎之間的關(guān)系?!緦@綀D】
【附圖說明】
[0019]圖1為不同濃度CHSP60對小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白介素-6(IL_6)和腫瘤壞死因子α (TNF-α )mRNA水平的影響;
[0020]圖2為CHSP60作用不同時間對小鼠巨噬細(xì)胞IL-6和TNF-a mRNA表達(dá)水平的影響;
[0021]圖3為CHSP60作用不同時間對小鼠巨噬細(xì)胞IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平的影響;
[0022]圖4為小鼠肺組織的蘇木精一伊紅染色法;
[0023]圖5為小鼠氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞數(shù);
[0024]圖6為小鼠氣管肺泡灌洗液中炎癥因子水平。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的分析。
[0026]本發(fā)明中所用的緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)用于基因克隆表達(dá)的常規(guī)試劑,TaqDNAPolymerase, dNTP Mixture, T4DNA 連接酶,NdeI,XhoI 限制性內(nèi)切酶,DNA Marker 以及Trizol,PrimerScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit, SYBR Premix Ex Taq?等均購自Takara公司。2xTaq Plus PCR MasterMix購自天根生化科技有限公司;磷酸緩沖液干粉即PBS干粉,IPTG,瓊脂糖均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均是由獨(dú)立的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到,采用不配對的t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),均用士 sEM表示。P值≤0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。
[0027]實(shí)施例1:CHSP60融合蛋白基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建
[0028]1.細(xì)胞總RNA的提取與濃度測定
[0029]將人喉癌細(xì)胞系H印-2細(xì)胞以2xl05/孔的密度鋪于12孔板內(nèi),加入Iml含有10%體積的胎牛血清(FBS)的新鮮培養(yǎng)液,將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24小時;吸棄原有培養(yǎng)基,用PBS洗2遍,加入500 μ I含有10%FBS以及I μ g/ml的放線菌酮的新鮮培養(yǎng)液,用500 μ I的上述Cpn上清感染!fep-2細(xì)胞,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)72小時;吸棄原有培養(yǎng)基,PBS洗2遍,加入500 μ I RNA提取試劑Trizol試劑,反復(fù)吹打細(xì)胞,以保證細(xì)胞完全裂解,將其轉(zhuǎn)移至已高壓滅菌的1.5ml離心管中;按Trizol:氯仿為5:1的比例加入氯仿,劇烈震蕩15秒,室溫靜置2-3分鐘,4°C,12000rpm,離心15分鐘,離心后,混合液體分為下層的紅色酚氯仿相,中間層以及無色水相上層,RNA被分配于無色的水相上層;將無色水相上層轉(zhuǎn)移至一干凈無RNA酶的離心管中,加入等體積的異丙醇混合,以沉淀其中的RNA,室溫孵育10分鐘,4°C, 12000rpm,離心10分鐘;吸棄掉上清,每Iml Trizol的樣品加入至少Iml用去RNA酶水配制的75%的乙醇,清洗RNA,混勻后,4°C,12000rpm,離心5分鐘;吸去大部分乙醇溶液,將無RNA酶的離心管倒置于超凈臺內(nèi),徹底的棄掉乙醇溶液,正置離心管使RNA沉淀在室溫干燥5-10分鐘使乙醇完全揮發(fā)掉;加入無RNA酶的水10 μ 1,放置于40C,溶解30分鐘,使其完全溶解;測定RNA的濃度,并做好記錄,_80°C保存所抽提的RNA。
[0030]2.cHSP60基因全長序列通過互聯(lián)網(wǎng)從GenBank獲得,該序列的GenBank序列號為G1:7189880。根據(jù)cHSP60蛋白已知序列,對照原核表達(dá)載體pET28a_c (+)上的多克隆酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)CHSP60基因的特異性擴(kuò)增引物,上游引物在5’端加入限制性酶切位點(diǎn)Ndel,下游引物在5’端加入限制性酶切位點(diǎn)Xhol,并加上保護(hù)性堿基。引物如下,下劃線為酶切位點(diǎn):上游引物5’ -CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3’ (下劃線為NdeI酶切位點(diǎn));下游引物5’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3> (下劃線為XhoI酶切位點(diǎn)),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0031 ] 3.CHSP60 基因的 PCR 擴(kuò)增
[0032]按照Takara 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimerScript II 1st Strand cDNA SynthesisKit說明書,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)過程如表1所示:
[0033]表1.PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)過程
【權(quán)利要求】
1.一種肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法,肺炎衣原體熱休克蛋白60即CHSP60,該方法構(gòu)建CHSP60的原核表達(dá)系統(tǒng)pET28a_cHSP60,制備cHSP60_組氨酸融合蛋白,SEQ ID NO:1,顯示CHSP60-組氨酸融合蛋白的核苷酸序列;其特征在于:所述肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的制備方法包括以下步驟: 步驟(1) 從肺炎衣原體Cpn AR39株基因中獲取cHSP60的序列,設(shè)計(jì)引物序列; 引物序列:上游引物,5 ’ -CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3 ’;下游引物,5 ’ -CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3’ ; 步驟(2) 用RT-PCR法擴(kuò)增CHSP60的cDNA,并將cHSP60與原核表達(dá)載體pET28a_c (+)連接,構(gòu)建pET28a-cHSP60重組質(zhì)粒; RT-PCR法擴(kuò)增體系為:模板cDNA為2.5μ 1,5’引物與3’引物各加0.4μ l,2xTaq PlusPCR MasterMix為10 μ 1,最后加雙蒸水補(bǔ)足至Ij 20 μ I ; 反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5分鐘;95°C變性30秒,58°C退火30秒,72°C延伸90秒,進(jìn)行30個循環(huán);72°C延伸5分鐘; 步驟(3) 經(jīng)過克隆、酶切鑒定及核苷酸測序證實(shí),獲得重組的表達(dá)載體pET28a-cHSP60,經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)在E.coli BL21菌株中產(chǎn)生cHSP60_His融合蛋白。
2.一種肺炎衣原體熱休克蛋白60的可溶性蛋白的使用方法:其特征在于:按照誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為1.0mM,誘導(dǎo)溫度30°C,誘導(dǎo)時間6小時進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)cHSP60_組氨酸標(biāo)簽融合蛋白鑒定CHSP60-組氨酸融合蛋白純度,將純化的CHSP60-組氨酸融合蛋白純度加入觀察細(xì)胞中,CHSP60誘導(dǎo)觀察細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6和TNF- α,其表達(dá)具有濃度依賴性以及時間依賴性,除此之外,CHSP60能夠激活核因子K B亞基的活化和促分裂素原活化蛋白激酶通路;將野生型Β6小鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后,于氣管內(nèi)給予多粘菌素B處理過的CHSP60-組氨酸融合蛋白;小鼠保持直立位,以確保液體全部被吸入肺部,6小時后處理小鼠肺部細(xì)胞,證實(shí)CHSP60能有效激發(fā)小鼠肺部炎癥反應(yīng)。
【文檔編號】C07K19/00GK103789336SQ201410056510
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】史麗云, 康艷華, 盧哲 申請人:杭州師范大學(xué)