專利名稱：一種測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳感器，具體地說是一種測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
作為高效生物催化劑，酶廣泛分布于自然界中，發(fā)揮著重要生理作用，加之在免疫分析等領(lǐng)域的應(yīng)用，酶活性的測(cè)定是分析科學(xué)領(lǐng)域的重要課題。現(xiàn)有的酶檢測(cè)技術(shù)主要包括電流分析、光度分析、熒光分析、化學(xué)發(fā)光分析、質(zhì)量分析、表面等離子體共振分析等，但這些方法或者成本過高，或者對(duì)樣品顏色、濁度等要求苛刻，或者對(duì)震動(dòng)等測(cè)定環(huán)境敏感， 為克服上述問題，發(fā)展更高效的酶活性測(cè)定方法十分必要。聚合物液膜離子選擇性電極是一種成本低廉、操作簡(jiǎn)單的電位檢測(cè)方法。在已報(bào)道的該類電極在酶活性檢測(cè)的應(yīng)用中，利用的是敏感膜對(duì)反應(yīng)終止后的某種特定產(chǎn)物產(chǎn)生能斯特電位響應(yīng)。需要指出的是，該類方法中，檢測(cè)在反應(yīng)終止后單獨(dú)進(jìn)行，故無法捕捉到反應(yīng)過程中的瞬態(tài)中間產(chǎn)物的電位信號(hào)；敏感膜在測(cè)定前被某種終產(chǎn)物離子活化，故難以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種產(chǎn)物離子的共同檢測(cè)。受此限制，聚合物液膜離子選擇性電極成功檢測(cè)的酶物種十分有限，特別是對(duì)過氧化物酶等重要免疫相關(guān)酶類的高靈敏檢測(cè)亟待實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通用性強(qiáng)、靈敏度高、成本低廉的測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器及其檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器，包括工作電極、外參比電極、內(nèi)參比電極和電位測(cè)定儀，電位測(cè)定儀通過導(dǎo)線分別連接內(nèi)參比電極和外參比電極，內(nèi)參比電極插入盛有內(nèi)充液的工作電極內(nèi)，工作電極和外參比電極插入盛有檢測(cè)液的檢測(cè)池中，工作電極為固定有聚合物敏感膜的電極載體，檢測(cè)池中設(shè)有具有擾動(dòng)溶液作用的動(dòng)力裝置。所述敏感膜為將聚合物基體材料、增塑劑和離子交換劑，按質(zhì)量百分比 20-80 20-80 0. 1-10混合后溶入到四氫呋喃中，攪均后在室溫下放置6-48h，待四氫呋喃揮發(fā)完全后即得到聚合物敏感膜。所述聚合物基體材料為聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亞胺、橡膠或溶膠凝膠膜；增塑劑為鄰-硝基苯辛醚、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；離子交換劑為三-十二烷基甲基氯化銨、三-十四烷基甲基氯化銨、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸鹽或硼酸鹽。所述動(dòng)力裝置為磁性攪拌子、旋轉(zhuǎn)圓盤電極、注射泵或噴壁式電極。檢測(cè)方法將通過電位測(cè)定儀連接的工作電極和外參比電極插入含有待測(cè)酶的檢測(cè)液中，檢測(cè)液中加入引發(fā)酶促反應(yīng)的底物待電位穩(wěn)定后，測(cè)定電位測(cè)定儀上引發(fā)酶促反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。
檢測(cè)方法待測(cè)酶液中加入底物待終止酶促反應(yīng)后，將酶促反應(yīng)液加入到檢測(cè)液中，通過連接的工作電極和外參比電極的電位測(cè)定儀測(cè)定引發(fā)酶促反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。所述待測(cè)酶液中加入底物甲，待電位穩(wěn)定后加入引發(fā)酶促反應(yīng)的底物乙，并測(cè)定電位測(cè)定儀上引發(fā)酶促反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。所述待測(cè)酶液可為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、具有相似催化性能的模擬酶或無機(jī)催化劑。所述氧化還原酶為辣根過氧化物酶、大豆過氧化物酶、漆酶、膽紅素氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶；所述轉(zhuǎn)移酶為糖苷酶；所述水解酶為蛋白酶或糖苷酶；所述具有相似催化性能的模擬酶為聚乙二醇-血紅素；所述無機(jī)催化劑為四氧化三鐵納米顆粒或富勒烯。所述對(duì)于氧化還原酶的檢測(cè)，所述底物甲可為苯胺、聯(lián)苯胺、四甲基聯(lián)苯胺、鄰聯(lián)茴香胺、二氨基聯(lián)苯胺、對(duì)茴香胺、間茴香胺、鄰茴香胺、甲苯胺、氯苯胺、氟苯胺、二甲基聯(lián)苯胺、4，4’ -亞甲基雙鄰氯苯胺、對(duì)氨基偶氮苯、萘胺、硝基萘胺、對(duì)乙氧基苯胺、鄰苯二胺、 間苯二胺、對(duì)苯二胺、N-苯基對(duì)苯二胺、聯(lián)大茴香胺、鄰聯(lián)甲苯胺、三甲基苯胺、氨基苯甲酸、 氨基比林、氨基安替吡啉、氨基芴，苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對(duì)苯二酚、對(duì)苯氧基苯酚、對(duì)羥基聯(lián)苯、甲氧基苯酚、甲基苯酚、氯苯酚、二甲基苯酚、二氯苯酚、對(duì)羥基苯甲酸、氯萘酚、 抗壞血酸、多巴胺、對(duì)叔丁基兒茶酚、對(duì)乙酰氨基酚、酪氨酸、咖啡酸、兒茶酚、兒茶酚紫、鉻黑T、酸性鉻藍(lán)K、偶氮染料、隱性亮綠、溴鄰苯三酚；所述底物乙可為過氧化氫、過氧化甲基、過氧化乙基或氧氣；所述底物乙可為二糖衍生物、松柏醇或氨基酸衍生物；所述對(duì)于轉(zhuǎn)移酶、水解酶、具有相似催化性能的模擬酶或無機(jī)催化劑檢測(cè)時(shí)，底物為二糖衍生物、松柏醇或氨基酸衍生物。所述敏感膜為將聚合物基體材料、增塑劑和離子交換劑，按質(zhì)量百分比 20-80 20-80 0. 1-10混合后溶入到四氫呋喃中，攪均后在室溫下放置6-48h，待四氫呋喃揮發(fā)完全后即得到聚合物敏感膜；將所得敏感膜固定于電極載體上后活化電極，基于陽離子交換劑的聚合物敏感膜使用前用鈉離子離子活化，能對(duì)陽離子產(chǎn)生電位響應(yīng)，基于陰離子交換劑的聚合物敏感膜使用前用氯離子活化，能對(duì)陰離子產(chǎn)生電位響應(yīng)；所述聚合物基體材料為聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亞胺、橡膠或溶膠凝膠膜；增塑劑為鄰-硝基苯辛醚、二 -2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；離子交換劑為三-十二烷基甲基氯化銨、三-十四烷基甲基氯化銨、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸鹽或硼酸鹽。所述內(nèi)充液或檢測(cè)液為電解質(zhì)溶液，內(nèi)充液可以為常規(guī)緩沖溶液，檢測(cè)液可為水相緩沖液或水相緩沖液與有機(jī)溶劑的混合液。檢測(cè)原理為酶促反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物和/或終產(chǎn)物具有與底物不同的電荷數(shù)和親脂性，故能在離子交換劑膜電極上引起與酶活性相關(guān)的電位變化。以過氧化物酶-苯胺類或苯酚類芳香族氫供體-過氧化氫體系為例，苯胺類或苯酚類化合物在測(cè)定條件下主要以非離子形式存在，只能引起微弱的電位響應(yīng)，在過氧化物酶的催化下，過氧化氫氧化苯胺類或苯酚類化合物，生成芳香類自由基離子、芳香類電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物離子、芳香類寡聚離子、芳香類聚離子等產(chǎn)物離子。對(duì)于苯胺類化合物，產(chǎn)物為陽離子，可在陽離子交換劑摻雜的聚合物膜電極(鈉離子活化)上引發(fā)顯著電位上升；對(duì)于苯酚類化合物，產(chǎn)物為陰離子， 可在陰離子交換劑摻雜的聚合物膜電極(氯離子活化)上引發(fā)顯著電位下降。過氧化氫和氫供體的量一定時(shí)，電位上升量或下降量與過氧化物酶的活性相關(guān)，故可實(shí)現(xiàn)對(duì)過氧化物酶的檢測(cè)。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明中酶促反應(yīng)與電位檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，離子交換劑摻雜的聚合物液膜同時(shí)檢測(cè)包括自由基離子等瞬態(tài)產(chǎn)物在內(nèi)的多種產(chǎn)物離子。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明突破了聚合物膜離子選擇電極只能檢測(cè)某一種特定酶促反應(yīng)產(chǎn)物，且必須是穩(wěn)態(tài)產(chǎn)物的限制，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)反應(yīng)中瞬態(tài)產(chǎn)物的檢測(cè)和多種產(chǎn)物離子的共同檢測(cè)。 大大擴(kuò)展了離子選擇性電極可測(cè)生物酶的范圍。特別是對(duì)過氧化物酶的高效測(cè)定對(duì)發(fā)展酶聯(lián)免疫電位分析具有重要意義。2.本發(fā)明傳感器通用性強(qiáng)，特別是底物十分豐富，易于根據(jù)不同需求做出選擇。其中部分底物對(duì)過氧化物酶檢測(cè)靈敏度很高，檢出限可達(dá)10-6U/mL。3.本發(fā)明傳感器抗干擾能力強(qiáng)，既不受待測(cè)液顏色、濁度等因素的干擾；又對(duì)樣品中的基質(zhì)離子(如0. 12M鈉離子)有好的選擇性。故特別適于復(fù)雜基質(zhì)中的檢測(cè)分析。4.本傳感器制備簡(jiǎn)單、操作方便，且因不需要特別的離子載體，成本低廉。同時(shí)，一次性使用的傳感器避免了再生過程引起的測(cè)試性能改變，保證了良好的重現(xiàn)性。5.本發(fā)明中酶促反應(yīng)與電位檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，離子交換劑摻雜的聚合物液膜同時(shí)檢測(cè)包括自由基離子等瞬態(tài)產(chǎn)物在內(nèi)的多種產(chǎn)物離子。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例傳感器示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例以苯胺為底物時(shí)，對(duì)不同活性濃度辣根過氧化物酶的電位響應(yīng)。圖3為本發(fā)明實(shí)施例以苯胺為底物時(shí)，對(duì)不同活性濃度的辣根過氧化物酶的標(biāo)準(zhǔn)
工作曲線。圖4為本發(fā)明實(shí)施例以苯酚為底物時(shí)，對(duì)不同活性濃度辣根過氧化物酶的電位響應(yīng)。圖5為本發(fā)明實(shí)施例以苯酚為底物時(shí)，對(duì)不同活性濃度的辣根過氧化物酶的標(biāo)準(zhǔn)
工作曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1電位傳感器，包括工作電極1、外參比電極2、內(nèi)參比電極3和電位測(cè)定儀4，電位測(cè)定儀4通過導(dǎo)線分別連接內(nèi)參比電極3和外參比電極4，內(nèi)參比電極3插入盛有內(nèi)充液8 的工作電極1內(nèi)，工作電極1和外參比電極2插入盛有檢測(cè)液6的檢測(cè)池5中，工作電極1 為固定有聚合物敏感膜7的電極載體，檢測(cè)池5中設(shè)有具有攪拌作用的磁性攪拌子9，檢測(cè)池底配套有磁力攪拌器以轉(zhuǎn)動(dòng)磁力攪拌子。固定有聚合物敏感膜7的電極載體為聚氯乙烯管。檢測(cè)方法
以苯胺作為底物，待測(cè)酶為辣根過氧化物酶，a.以陽離子交換劑二壬基萘磺酸摻雜的聚合物膜為工作電極敏感膜，銀-氯化銀電極為內(nèi)外參比電極，內(nèi)參比電極與電化學(xué)工作站CHI760D的工作電極接頭連接，外參比電極與參比電極接頭連接(參見圖1)，選擇“開路電位-時(shí)間”技術(shù)測(cè)定電位值。工作電極敏感膜的制備按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù) 49.5% 49. 5%將二壬基萘磺酸、聚氯乙烯、鄰-硝基苯辛醚共345mg的混合物溶解于到3. 5mL四氫呋喃溶液中，室溫下在平底玻璃環(huán)(內(nèi)徑為3. 6cm)中放置，約后四氫呋喃蒸發(fā)完畢，即得到均勻的聚合物敏感膜。固定有聚合物敏感膜的電極載體工作電極的制備將上述所得聚合物敏感膜用打孔器打取直徑約0. 7cm的聚合物敏感膜，并通過四氫呋喃將打取的膜固定于聚氯乙烯管底部。電極使用前在50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 4，鈉離子濃度為0. 12mol/L)中活化約 8h，每個(gè)電極只使用一次。即活化時(shí)基于陽離子交換劑的聚合物敏感膜使用前用鈉離子離子活化，能對(duì)陽離子產(chǎn)生電位響應(yīng)；基于陰離子交換劑的聚合物敏感膜使用前用氯離子活化，能對(duì)陰離子產(chǎn)生電位響應(yīng)。聚氯乙烯管內(nèi)部充有50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 4，鈉離子濃度為0. 12mol/ L)。檢測(cè)液為50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 5. 4，鈉離子濃度為0. 12mol/L)。b.攪拌條件下，向4mL檢測(cè)液加入80 μ L 0. IM苯胺(最終濃度2mM)，等電位值穩(wěn)定后，加入不同濃度的辣根過氧化物酶溶液，而后加入4 μ LlMH2O2 (最終濃度ImM)弓丨發(fā)反應(yīng)，記錄引發(fā)氧化反應(yīng)后300s的電位增量。用四個(gè)相同的電極在相同條件下分別測(cè)定最終濃度為0. 001U/mL、0. 01U/mL、0. lU/mL和lU/mL的辣根過氧化物酶引發(fā)的電位增加值(參見圖2)，由于對(duì)于苯胺化合物，產(chǎn)物為陽離子，可在陽離子交換劑摻雜的聚合物膜電極(鈉離子活化)上引發(fā)顯著電位上升，并且能引起點(diǎn)位上升的化合物包括苯胺自由基陽離子、 苯胺寡聚物離子和苯胺聚合物離子；同時(shí)其在攪拌條件能保證產(chǎn)物離子從檢測(cè)溶液到聚合物液膜間的傳質(zhì)過程，進(jìn)而保證電位信號(hào)的產(chǎn)生。并作出電位增加值對(duì)酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(參見圖3)。c.將未知濃度辣根過氧化物酶的待測(cè)樣品加入到檢測(cè)液中，而后0. IM苯胺，待電位穩(wěn)定后加入IM H2O2引發(fā)氧化反應(yīng)，記錄300s內(nèi)的電位增量，而后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得酶活性。實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于以苯酚為底物，待測(cè)酶為辣根過氧化物酶。a.以陰離子交換劑三-十二烷基甲基氯化銨摻雜的聚合物膜為工作電極敏感膜， 銀-氯化銀電極為內(nèi)外參比電極，內(nèi)參比電極與電化學(xué)工作站CHI760D的工作電極接頭連接，外參比電極與參比電極接頭連接，選擇“開路電位-時(shí)間”技術(shù)測(cè)定電位值。工作電極的制備為按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1. 5% 66% 32. 5%將三-十二烷基甲基氯化銨、聚氯乙烯、癸二酸二辛酯共:345mg溶解于到3. 5mL四氫呋喃溶液中，室溫下在平底玻璃環(huán)(內(nèi)徑為3.6cm)中放置，約后四氫呋喃蒸發(fā)完畢，即得到均勻的聚合物敏感膜。 用打孔器打取直徑約0. 7cm的該聚合物膜，并通過四氫呋喃將打取的膜固定于聚氯乙烯管底部。電極使用前在50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7.4)中活化約他，每個(gè)電極只使用一次。聚氯乙烯管內(nèi)部充有50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 4)。檢測(cè)液為50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 4)。b.在攪拌條件下，向4mL檢測(cè)液加入80 μ L0. IM苯酚(最終濃度2mM)，等電位值穩(wěn)定后，加入4 μ LlM H2O2 (最終濃度ImM)，然后加入不同濃度的辣根過氧化物酶溶液.記錄引發(fā)氧化反應(yīng)后120s的電位減小值。用五個(gè)相同的電極在相同條件下分別測(cè)定最終濃度為0. 0005U/mL、0. 001U/mL、0. 01U/mL、0. lU/mL和lU/mL的辣根過氧化物酶引發(fā)的電位減小值，由于對(duì)于苯酚類化合物，產(chǎn)物為陰離子，可在陰離子交換劑摻雜的聚合物膜電極(氯離子活化)上引發(fā)顯著電位下降。其中能引起電位下降的產(chǎn)物包括苯酚寡聚物離子和苯酚聚合物離子。同時(shí)其在攪拌條件能保證產(chǎn)物離子從檢測(cè)溶液到聚合物液膜間的傳質(zhì)過程， 進(jìn)而保證電位信號(hào)的產(chǎn)生。(參見圖4)，并作出電位減小值對(duì)酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(參見圖5)。c.將未知濃度辣根過氧化物酶的待測(cè)樣品加入到檢測(cè)液中，而后0. IM苯酚，待電位穩(wěn)定后加入IM H2O2引發(fā)氧化反應(yīng)，記錄120s內(nèi)的電位減小值，而后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得酶活性。實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于以，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺為底物，待測(cè)酶為辣根過氧化物酶。傳感器中，將固定有聚合物敏感膜的聚乙烯管套到旋轉(zhuǎn)圓盤電極的電極頭上，內(nèi)參比電極為與旋轉(zhuǎn)圓盤電極的參比電極接口相連。旋轉(zhuǎn)圓盤電極轉(zhuǎn)速調(diào)至5000rpm后，向ImL檢測(cè)液加入20yL0. 1M3，3 ‘，5， 5'-四甲基聯(lián)苯胺(最終濃度2mM)，等電位值穩(wěn)定后，加入IyLlM H2O2 (最終濃度ImM)， 然后加入不同濃度的辣根過氧化物酶溶液，記錄引發(fā)氧化反應(yīng)后300s的電位增量。用六個(gè)相同的電極在相同條件下分別測(cè)定最終濃度為10_6U/mL、10_5U/mL、10_4U/mL、0. 001U/mL、 0. OlU/mL和0. lU/mL的辣根過氧化物酶引發(fā)的電位增加值，并作出電位增加值對(duì)酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，未知酶樣品的活性可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線獲得。其中引起電位增加的產(chǎn)物包括3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺自由基陽離子、3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺_3，3'，5， 5'-四甲基聯(lián)苯亞胺電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合體陽離子和3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯亞胺陽離子。實(shí)施例4與實(shí)施例1不同之處在于以對(duì)苯二酚為底物，待測(cè)酶為漆酶。工作電極敏感膜的制備按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1.5% 66% 32. 5%將三-十四烷基甲基氯化銨、聚丁基丙烯酸酯、二 -2-乙基己基癸酯共345mg溶解于到3. 5mL四氫呋喃溶液中，室溫下在平底玻璃環(huán)(內(nèi)徑為3. 6cm)中放置，約他后四氫呋喃蒸發(fā)完畢，即得到均勻的聚合物敏感膜。在空氣條件下，待測(cè)酶液中加入對(duì)苯二酚，酶促反應(yīng)進(jìn)行后通過液氮冷卻終止反應(yīng)，而后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到檢測(cè)緩沖液中，同時(shí)用傳感器檢測(cè)加入反應(yīng)液前后工作電極上的敏感膜的電位變化，通過該信號(hào)得到辣根過氧化物酶的量。實(shí)施例5
與實(shí)施例1不同之處在于工作電極敏感膜的制備按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1.5% 66% 32. 5%將三-十二烷基甲基氯化銨、聚丙烯酸丁酯、癸二酸二丁酯共345mg溶解于到3. 5mL四氫呋喃溶液中，室溫下在平底玻璃環(huán)(內(nèi)徑為3.6cm)中放置，約后四氫呋喃蒸發(fā)完畢，即得到均勻的聚合物敏感膜。以含有磺酸基的二糖衍生物為底物，進(jìn)行糖苷酶的檢測(cè)。將通過電位測(cè)定儀連接的黏附有陰離子交換劑的敏感膜的工作電極和外參比電極插入含有待測(cè)的糖苷酶液的檢測(cè)液中，其中糖苷酶為透明質(zhì)酸酶、纖維素酶或幾丁質(zhì)酶， 檢測(cè)液中加入引發(fā)酶促反應(yīng)的二糖衍生物(其中二糖衍生物為軟骨二糖)，(待電位穩(wěn)定后，測(cè)定電位測(cè)定儀上反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。實(shí)施例6與實(shí)施例1不同之處在于工作電極敏感膜的制備按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.5% 30% 69. 5%將三-十二烷基甲基氯化銨、聚醚酰亞胺、鄰-硝基苯辛醚共175mg溶解于到2. 5mL四氫呋喃溶液中，室溫下在平底玻璃環(huán)(內(nèi)徑為3. 6cm)中放置，約后四氫呋喃蒸發(fā)完畢，即得到均勻的聚合物敏感膜。以含有酚羥基的氨基酸衍生物為底物，進(jìn)行蛋白酶的檢測(cè)。將通過電位測(cè)定儀連接的黏附有陰離子交換劑的敏感膜的工作電極和外參比電極插入含有待測(cè)的蛋白酶液的檢測(cè)液中，其中蛋白酶為木瓜酶、鳳梨酵素或胰蛋白酶，檢測(cè)液中加入引發(fā)酶促反應(yīng)的含酚羥基的氨基酸衍生物(其中苯酚基團(tuán)的氨基酸為對(duì)羥基亞甲基氨基酸乙酯)，待電位穩(wěn)定后，測(cè)定電位測(cè)定儀上反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。實(shí)施例7與實(shí)施例1不同之處在于工作電極敏感膜的制備按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)5% 47.5% 47. 5%將三-十四烷基甲基氯化銨、聚氯乙烯、鄰-硝基苯辛醚共:345mg溶解于到3. 5mL四氫呋喃溶液中，室溫下在平底玻璃環(huán)(內(nèi)徑為3. 6cm)中放置，約后四氫呋喃蒸發(fā)完畢，即得到均勻的聚合物敏感膜。以松柏醇和氧氣為底物，進(jìn)行氧化酵素或漆酶的檢測(cè)。將通過電位測(cè)定儀連接的黏附有陰離子交換劑的敏感膜的工作電極和外參比電極插入含有待測(cè)的氧化酵素或漆酶的磷酸鹽緩沖液與二氧六環(huán)的混合檢測(cè)液(體積比為 1 1)中，檢測(cè)液中加入引發(fā)酶促反應(yīng)的底物松柏醇待電位穩(wěn)定后，記錄電位測(cè)定儀上反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。所述電解質(zhì)溶液包括內(nèi)充液(固體電極除外)和檢測(cè)液。內(nèi)充液可以是常規(guī)緩沖溶液等電解質(zhì)溶液，檢測(cè)液可以是水相緩沖液，也可以是水相緩沖液與有機(jī)溶劑的混合液。本發(fā)明檢測(cè)儀器為電位測(cè)定儀，電極包括工作電極、內(nèi)參比電極和外參比電極，工作電極為基于離子交換劑的聚合物液膜電極。電極、電位測(cè)定儀與檢測(cè)液組成檢測(cè)回路，檢測(cè)液連有動(dòng)力裝置以擾動(dòng)溶液，達(dá)到促進(jìn)檢測(cè)液與聚合物膜間的物質(zhì)傳遞的目的。同時(shí)本發(fā)明中酶促反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物和/或終產(chǎn)物具有與底物不同的電荷數(shù)和親脂性，能在離子交換劑膜上引起與酶活性相關(guān)的電位變化，實(shí)現(xiàn)酶活性測(cè)定。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器，包括工作電極(1)、外參比電極O)、內(nèi)參比電極C3)和電位測(cè)定儀G)，其特征在于電位測(cè)定儀(4)通過導(dǎo)線分別連接內(nèi)參比電極⑶和外參比電極O)，內(nèi)參比電極⑶插入盛有內(nèi)充液⑶的工作電極⑴內(nèi)，工作電極(1)和外參比電極(2)插入盛有檢測(cè)液(6)的檢測(cè)池(5)中，工作電極(1)為固定有聚合物敏感膜(7)的電極載體，檢測(cè)池(5)中設(shè)有具有擾動(dòng)溶液作用的動(dòng)力裝置(9)。
2.按權(quán)利要求1所述的測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器，其特征在于所述敏感膜為將聚合物基體材料、增塑劑和離子交換劑，按質(zhì)量百分比20-80 20-80 0.1-10混合后溶入到四氫呋喃中，攪均后在室溫下放置6-48h，待四氫呋喃揮發(fā)完全后即得到聚合物敏感膜。
3.按權(quán)利要求1所述的測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器，其特征在于所述聚合物基體材料為聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亞胺、橡膠或溶膠凝膠膜； 增塑劑為鄰-硝基苯辛醚、二 -2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；離子交換劑為三-十二烷基甲基氯化銨、三-十四烷基甲基氯化銨、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸鹽或硼酸鹽。
4.按權(quán)利要求1所述的測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器，其特征在于所述動(dòng)力裝置為磁性攪拌子、旋轉(zhuǎn)圓盤電極、注射泵或噴壁式電極。
5.一種按權(quán)利要求1所述測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于將通過電位測(cè)定儀連接的工作電極和外參比電極插入含有待測(cè)酶的檢測(cè)液中，檢測(cè)液中加入引發(fā)酶促反應(yīng)的底物后，測(cè)定電位測(cè)定儀上引發(fā)酶促反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。
6.一種按權(quán)利要求1所述測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于待測(cè)酶液中加入底物引發(fā)酶促反應(yīng)進(jìn)行后，終止酶促反應(yīng)，將酶促反應(yīng)液加入到檢測(cè)液中，通過連接的工作電極和外參比電極的電位測(cè)定儀測(cè)定引發(fā)酶促反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。
7.按權(quán)利要求5或6所述的測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于所述待測(cè)酶液中加入底物甲，待電位穩(wěn)定后加入引發(fā)酶促反應(yīng)的底物乙，并測(cè)定電位測(cè)定儀上引發(fā)酶促反應(yīng)前后聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。
8.按權(quán)利要求5、6或7所述測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于所述待測(cè)酶液可為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、具有相似催化性能的模擬酶或無機(jī)催化劑。
9.按權(quán)利要求5、6或7所述測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于所述氧化還原酶為辣根過氧化物酶、大豆過氧化物酶、漆酶、膽紅素氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶；所述轉(zhuǎn)移酶為糖苷酶；所述水解酶為蛋白酶或糖苷酶；所述具有相似催化性能的模擬酶為聚乙二醇-血紅素；所述無機(jī)催化劑為四氧化三鐵納米顆?；蚋焕障?。
10.按權(quán)利要求5、6或7所述測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于所述氧化還原酶、其模擬酶或無機(jī)催化劑的檢測(cè)，所述底物甲可為苯胺、聯(lián)苯胺、四甲基聯(lián)苯胺、鄰聯(lián)茴香胺、二氨基聯(lián)苯胺、對(duì)茴香胺、間茴香胺、鄰茴香胺、甲苯胺、氯苯胺、 氟苯胺、二甲基聯(lián)苯胺、4，4’_亞甲基雙鄰氯苯胺、對(duì)氨基偶氮苯、萘胺、硝基萘胺、對(duì)乙氧基苯胺、鄰苯二胺、間苯二胺、對(duì)苯二胺、N-苯基對(duì)苯二胺、聯(lián)大茴香胺、鄰聯(lián)甲苯胺、三甲基苯胺、氨基苯甲酸、氨基比林、氨基安替吡啉、氨基芴，苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對(duì)苯二酚、對(duì)苯氧基苯酚、對(duì)羥基聯(lián)苯、甲氧基苯酚、甲基苯酚、氯苯酚、二甲基苯酚、二氯苯酚、對(duì)羥基苯甲酸、氯萘酚、抗壞血酸、多巴胺、對(duì)叔丁基兒茶酚、對(duì)乙酰氨基酚、酪氨酸、咖啡酸、兒茶酚、 兒茶酚紫、鉻黑T、酸性鉻藍(lán)K、偶氮染料、隱性亮綠、溴鄰苯三酚；所述底物乙可為過氧化氫、過氧化甲基、過氧化乙基或氧氣；所述轉(zhuǎn)移酶或水解酶的檢測(cè)，底物可為二糖衍生物、松柏醇或氨基酸衍生物。
11.按權(quán)利要求5、6或7所述測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器的檢測(cè)方法， 其特征在于所述敏感膜為將聚合物基體材料、增塑劑和離子交換劑，按質(zhì)量百分比 20-80 20-80 0. 1-10混合后溶入到四氫呋喃中，攪均后在室溫下放置6-48h，待四氫呋喃揮發(fā)完全后即得到聚合物敏感膜；將所得敏感膜固定于電極載體上后活化電極，基于陽離子交換劑的聚合物敏感膜使用前用鈉離子活化，能對(duì)陽離子產(chǎn)生電位響應(yīng)，基于陰離子交換劑的聚合物敏感膜使用前用氯離子活化，能對(duì)陰離子產(chǎn)生電位響應(yīng)；所述聚合物基體材料為聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亞胺、橡膠或溶膠凝膠膜；增塑劑為鄰-硝基苯辛醚、二 -2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；離子交換劑為三-十二烷基甲基氯化銨、三-十四烷基甲基氯化銨、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸鹽或硼酸鹽。
12.按權(quán)利要求5、6或7所述測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于所述內(nèi)充液或檢測(cè)液為電解質(zhì)溶液，內(nèi)充液可以為常規(guī)緩沖溶液，檢測(cè)液可為水相緩沖液或水相緩沖液與有機(jī)溶劑的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及傳感器，具體地說是一種測(cè)定酶活性的聚合物液膜電位傳感器及其檢測(cè)方法。電位測(cè)定儀通過導(dǎo)線分別連接內(nèi)參比電極和外參比電極，內(nèi)參比電極插入盛有內(nèi)充液的工作電極內(nèi)，工作電極和外參比電極插入盛有檢測(cè)液檢測(cè)池中，工作電極為固定有聚合物敏感膜的電極載體，檢測(cè)池中設(shè)有具有溶液擾動(dòng)作用的動(dòng)力裝置。測(cè)定方法為通過電位測(cè)定儀測(cè)定酶促反應(yīng)前后工作電極底部的聚合物敏感膜上的電位變化，根據(jù)電位變化信號(hào)通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)得酶活性濃度。本發(fā)明通用性強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高、成本低廉，同時(shí)適合復(fù)雜基質(zhì)條件下的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK102235995SQ20101017436
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者丁家旺, 王學(xué)偉, 秦偉 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所