專利名稱：一種人季節(jié)性流感h1n1的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人季節(jié)性流感Him的恒溫?cái)U(kuò) 增檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
季節(jié)性流感是由以往已存在的流感病毒引起，流行具有季節(jié)性，冬春季多發(fā)，人群 存在一定免疫力。導(dǎo)致季節(jié)性流感的流感病毒基因亞型主要有H1N1，H3N2, H5N1，其中由 H1N1流感病毒導(dǎo)致的流行性感冒占絕大部分。季節(jié)性流感會(huì)使病人出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽、嗓子痛、肌肉疼痛、頭痛、發(fā)冷、疲勞等癥狀。 季節(jié)性流感主要侵襲兒童、老年人以及一些慢性病患者等體質(zhì)較弱的人群，約90%的重癥 病例和死亡發(fā)生在65歲以上的老年人。接種流感疫苗是預(yù)防季節(jié)性流感及其并發(fā)癥的有 效手段。季節(jié)性流感是一種可防可控的傳染病，在日常生活中要做到注意個(gè)人衛(wèi)生，如經(jīng)常 使用肥皂和清水洗手，咳嗽或打噴嚏時(shí)用紙巾遮住口鼻，公共場(chǎng)所、公共交通工具及居室經(jīng) 常開窗通風(fēng)，流行期間不到人群擁擠的公共場(chǎng)所，盡量減少與流感樣病例接觸，到醫(yī)院就診 或看望病人最好戴口罩等，可以有效地預(yù)防季節(jié)性流感的發(fā)生。同時(shí)保持充足睡眠和良好 精神心理狀態(tài)，加強(qiáng)戶外體育鍛煉，合理飲食也能有效抵御疾病入侵，減少并發(fā)癥的發(fā)生。近年來的發(fā)展起來針對(duì)人季節(jié)性流感Hmi病毒的熒光定量 PCR(FluorescenceQuantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈敏度高，速度快，特異性強(qiáng)等 優(yōu)點(diǎn)在人季節(jié)性流感Hmi病毒的基因檢測(cè)水平上有著廣泛的應(yīng)用，是目前人季節(jié)性流感 H1N1檢測(cè)的主要方法，目前國內(nèi)市場(chǎng)上已經(jīng)有了關(guān)于人季節(jié)性流感Hmi核酸定量檢測(cè)試 劑盒。FQ-PCR雖然有著簡(jiǎn)便，快速，靈敏的優(yōu)勢(shì)，但是其檢測(cè)需要昂貴的儀器，且容易造 成假陽性等問題。交叉引物擴(kuò)增法是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū) 域設(shè)計(jì)6種(三對(duì))特異引物，引物尾端交叉互換序列，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件 即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、多次溫度循環(huán)等過程，此交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增 靶核苷酸序列的方法及其應(yīng)用本申請(qǐng)人之前已申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?00810134583. 1)。在此 方法的基礎(chǔ)上制備了本發(fā)明的人季節(jié)性流感Hmi的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種人季節(jié)性流感Hmi的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè) 試劑盒，所述試劑盒特異性好，靈敏度高，步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快。本發(fā)明所提供的人季節(jié)性流感Hmi的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括下列組成(1) RNA提取液RNA提取試劑盒；(2)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液
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包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴(kuò)增引物、 IX Thermolbuffer、MgS04、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和無菌雙蒸水；其中所述的外圍引物分別為正向外圍引物序列為5，-GAATCAACTACTACTGGACT-3，(SEQ ID N01)；反向外圍引物序列為5，-CTCCTGACATACTTTGGACA-3，(SEQ ID N02)；所述的兩條探針的序列分別為正向5，端 Biotin 標(biāo)記探針 5，-biotin-TGCGAAGTGTCAAACACCTC-3，(SEQ IDN03)；反向3，端異硫氰酸熒光素 FitC 標(biāo)記探針 5，-GGAGCTATAAACAGCAGTCT-FitC-3，(S EQ ID N04)；所述的擴(kuò)增交叉引物分別為擴(kuò)增反向引物5， -TGACTGGGTGTACGTTCTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGC-3， (SEQ IDN05)；擴(kuò)增正向引物5， -AGGCAAATGGAAATCTAATAGCTGACTGGGTGTACGTTCTG-3， (SEQ IDN06)；(3)陽性對(duì)照模板為含有人季節(jié)性流感Hmi HA基因片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；(4)陰性對(duì)照無菌雙蒸水。恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中所述的lXThermol buffer含有摩爾濃度為20mM的Tris_HCl、 10mM 的KCl、10mM 的(NH4) 2S04、2mM 的MgS04 以及質(zhì)量濃度為 0. 的 Triton X_100，pH 8.8。本發(fā)明試劑盒中的6條寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的鏈置換特 性，使得鏈置換DNA合成不斷的自我擴(kuò)增循環(huán)。本發(fā)明提供的人季節(jié)性流感Hmi核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中，對(duì)不同的反應(yīng) 條件進(jìn)行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應(yīng)溫度等的優(yōu)化，并將本發(fā)明與核酸檢 測(cè)試紙條檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立了人季節(jié)性流感Hmi核酸恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)的方法。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用本發(fā)明試劑盒的人季節(jié)性流感 H1N1核酸恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)用RNA提取試劑盒從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取RNA ；(2)將步驟⑴提取得到的RNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中， 在60°C下擴(kuò)增反應(yīng)90分鐘；對(duì)照PCR管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽性模板和標(biāo)準(zhǔn)陰性模板；c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測(cè)裝置(申請(qǐng)?zhí)?200610109620. 4)中 進(jìn)行檢測(cè)，15分鐘以后判讀結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽性時(shí)，說明樣品中含有人季節(jié)性流 感H1N1核酸。本發(fā)明的試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿足快速檢測(cè) 人季節(jié)性流感Him的要求。本試劑盒的不同批次間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重 復(fù)性。對(duì)樣本的檢測(cè)僅僅需要2個(gè)小時(shí)就能完成，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。同時(shí)本試劑盒只需要 1個(gè)人就可以完成所有的操作過程，可一次性檢測(cè)一個(gè)到數(shù)百個(gè)樣本，這樣也減少了人力的浪費(fèi)。故本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果1.特異性好，靈敏度高步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；2.反應(yīng)速度快，單個(gè)樣本從樣本處理到完成檢測(cè)，僅需2小時(shí)；
3.整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過程中不需要打開PCR管蓋，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)；4.可同時(shí)滿足高通量和低通量的樣品檢測(cè)；5.整個(gè)反應(yīng)過程不需要復(fù)雜的儀器。


圖1實(shí)施例3的檢測(cè)人季節(jié)性流感Hmi的特異性；圖中從左至右依次為人季節(jié)性流感H3N2，人季節(jié)性流感H5W，人季節(jié)性流感 H9N7，甲型Hmi流感，季節(jié)性流感B，禽流感H5m，人季節(jié)性流感Hmi ；圖2實(shí)施例4的檢測(cè)人季節(jié)性流感Hmi的靈敏度；圖中從左至右分別表示104拷貝/微升、103拷貝/微升、102拷貝/微升、10拷貝 /微升、陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實(shí)施例1試劑盒的組成與配制a) RNA提取試劑RNA提取試劑盒b)反應(yīng)液兩條外圍引物(0.05iimol)，兩條探針(0. 5 y mol)，和兩條交叉引物 (0. 5 u mol)，1 X Thermo 1 buffer, MgS04 (6mmol)，dNTPs 溶液(0. 4mmol)，Bst DNA 聚合酶 (10U)和無菌雙蒸水組成，總反應(yīng)液體積為16 yl。其中外圍引物分別為正向外圍引物序列為5，-GAATCAACTACTACTGGACT-3，(SEQ ID N01)；反向外圍引物序列為5，-CTCCTGACATACTTTGGACA-3，(SEQ ID N02)；兩條探針的序列分別為兩條探針的序列分別為正向5，端財(cái)0衍11標(biāo)記探針5，-1^0^11-1606六六61611^六六0六011(-3，(5￡0ID N03)；反向3，端異硫氰酸熒光素 FitC 標(biāo)記探針 5，-GGAGCTATAAACAGCAGTCT-FitC-3，(S EQID N04)；擴(kuò)增交叉引物分別為擴(kuò)增反向引物5，-TGACTGGGTGTACGTTCTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGC-3，(SEQ ID N05)；擴(kuò)增正向引物5，-AGGCAAATGGAAATCTAATAGCTGACTGGGTGTACGTTCTG-3，(SEQ ID N06)；IXThermo 1 buffer 的組成20mM Tris_HCl(pH 8. 8), 10mM KC1,10mM(NH4)2S04, 2mM MgS04，0. 1% Triton X-100。所有的引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。
c)陽性對(duì)照含有人季節(jié)性流感Hmi HA基因[NCBI gene bank number AE000511 (725-975)]的RNA片段。陽性對(duì)照為含有長250bp的人季節(jié)性流感Hmi病毒HA 基因序列，序列如下GAATCAACTACTACTGGACTCTGCTGGAACCCGGGGATACAATAATATTTGAGGCAAAT GGAAATCTAATAGCGCCAAGATATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGATCAGGAATCATCAACTCAAATGCACC AATGGATAAATGTGATGCGAAGTGCCAAACACCTCAGGGAGCTATAAACAGCAGTCTTCCTTTCCAGAACGTACACC CAGTCACAATAGGAGAGTGTCCAAAGTATGTCAGGAG (SEQ ID N07)陽性對(duì)照的制備步驟利用一條外圍引物和帶有T7啟動(dòng)子的另一條外圍引物以 人季節(jié)性流感Hmi的基因組RNA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因；用Promega的PCR 純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過Promega的RiboMAX LargeScale RNA Production Systems轉(zhuǎn)錄出目的的RNA片段。用分光光度計(jì)測(cè)A28(1定量 并稀釋至106拷貝/yl，-20°C保存。d)陰性對(duì)照無菌雙蒸水。實(shí)施例2用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)人季節(jié)性流感mm核酸的具體方法a)用RNA提取試劑盒從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取RNA。b)取標(biāo)本RNA作為模板加入到裝有反應(yīng)液的PCR管中，在60°C進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)90 分鐘，其中標(biāo)本RNA 4iU，反應(yīng)液16iU ；對(duì)照PCR管中分別加入陽性對(duì)照模板和陰性對(duì)照 模板。c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測(cè)裝置中進(jìn)行檢測(cè)，15分鐘以后判讀結(jié) 果。當(dāng)樣本中含有人季節(jié)性流感Hmi核酸時(shí)，試紙條的檢測(cè)線上呈陽性。反復(fù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異，說明本試劑盒的不同批次間的檢測(cè) 結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。上述實(shí)施例說明，用本發(fā)明的試劑盒來檢測(cè)重復(fù)性 好，且對(duì)樣本的檢測(cè)僅僅需要2個(gè)小時(shí)就能完成，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。同時(shí)本試劑盒只需要 1個(gè)人就可以完成所有的操作過程，可一次性檢測(cè)一個(gè)到數(shù)百個(gè)樣本，這樣也減少了人力的 浪費(fèi)。實(shí)施例3用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)人季節(jié)性流感mm的專一性按照實(shí)施例2的方法檢測(cè)人季節(jié)性流感H3N2、人季節(jié)性流感H5W、人季節(jié)性流感 H9N7、甲型Hmi流感、季節(jié)性流感B、禽流感H5W、人季節(jié)性流感Hmi。其結(jié)果如表1，見圖 1表1人季節(jié)性流感Hmi的專一性檢測(cè)結(jié)果 注“ _ ”表示陰性，“ + ”表示陽性從表1測(cè)試結(jié)果可見，用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)人季節(jié)性流感Him核酸具有很強(qiáng)的專一性。實(shí)施例4用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)人季節(jié)性流感mm核酸的靈敏度提取培養(yǎng)的人季節(jié)性流感Him病毒的RNA，對(duì)其進(jìn)行定量，分別稀釋至濃度為104 拷貝/微升、103拷貝/微升、102拷貝/微升、101拷貝/微升，采用實(shí)施例2中所述方法來 確定本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)人季節(jié)性流感Him核酸的靈敏度。結(jié)果如圖2所示，可以發(fā)現(xiàn) 該試劑盒可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10個(gè)拷貝，具有很高的靈敏度，可以滿足快速檢測(cè)人季 節(jié)性流感Hmi的要求。
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權(quán)利要求
一種人季節(jié)性流感H1N1的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括下列組成(1)RNA提取液RNA提取試劑盒；(2)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴(kuò)增引物、1×Thermolbuffer、MgSO4、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和無菌雙蒸水；其中所述的外圍引物分別為正向外圍引物序列為5’-GAATCAACTACTACTGGACT-3’，SEQ ID NO1；反向外圍引物序列為5’-CTCCTGACATACTTTGGACA-3’，SEQ ID NO2；所述的兩條探針的序列分別為正向5’端Biotin標(biāo)記探針5’-biotin-TGCGAAGTGTCAAACACCTC-3’，SEQ ID NO3；反向3’端異硫氰酸熒光素FitC標(biāo)記探針5-GGAGCTATAAACAGCAGTCT-FitC-3’，SEQ ID NO4；所述的擴(kuò)增交叉引物分別為擴(kuò)增反向引物5’-TGACTGGGTGTACGTTCTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGC-3’，SEQ ID NO5；擴(kuò)增正向引物5’-AGGCAAATGGAAATCTAATAGCTGACTGGGTGTACGTTCTG-3’，SEQID NO6；(3)陽性對(duì)照模板為含有人季節(jié)性流感H1N1HA基因片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；(4)陰性對(duì)照無菌雙蒸水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人季節(jié)性流感Hmi的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于 所述的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中IXThermol buffer含有摩爾濃度為20mM的Tris_HCl、10mM的 KClUOmM 的(NH4) 2S04、2mM 的 MgSO4 以及質(zhì)量濃度為 0. 的 Triton X-100，pH 8. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人季節(jié)性流感Hmi的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所 述的陽性對(duì)照為含有長250bp的人季節(jié)性流感Hmi病毒HA基因序列，序列如下GAATCAA CTACTACTGGACTCTGCTGGAACCCGGGGATACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCGCCAAGATATG CTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGATCAGGAATCATCAACTCAAATGCACCAATGGATAAATGTGATGCGAAGTGC CAAACACCTCAGGGAGCTATAAACAGCAGTCTTCCTTTCCAGAACGTACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGTCCAAA GTATGTCAGGAG, SEQ ID N07。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人季節(jié)性流感Hmi的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所 述的陽性對(duì)照通過下列步驟制備利用一條外圍引物和帶有T7啟動(dòng)子的另一條外圍引物以人季節(jié)性流感Hmi病毒的基 因組RNA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因；用PCR純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純 化；將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄出目的的RNA片段，用分光光度計(jì)測(cè)A28tl定量并稀釋至IO6拷 貝 / μ 1，_20°C保存。
5.一種應(yīng)用權(quán)利要求1試劑盒的人季節(jié)性流感Hmi核酸恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)方法，包括 如下步驟(1)用RNA提取試劑盒從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取RNA；(2)將步驟(1)提取得到的RNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在 60°C下擴(kuò)增反應(yīng)90分鐘；對(duì)照PCR管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽性模板和標(biāo)準(zhǔn)陰性模板；(3)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸防污染檢測(cè)裝置中進(jìn)行檢測(cè)，15分鐘以后判讀結(jié)果， 當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽性時(shí)，說明樣品中含有人季節(jié)性流感Hmi核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人季節(jié)性流感Hmi核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在 于所述的反應(yīng)液中兩條外圍引物為0. 05 μ mol，兩條探針為0.5 μ mol，兩條交叉引物為 0. 5 μ mol, MgSO4 為 6mmol, dNTPs 溶液為 0. 4mmol, Bst DNA 聚合酶為 IOU。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人季節(jié)性流感Hmi核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于 標(biāo)本RNA4 μ 1，總反應(yīng)液16 μ 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人季節(jié)性流感H1N1的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明試劑盒包含RNA提取液、人季節(jié)性流感病毒H1N1核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、人季節(jié)性流感病毒H1N1陽性對(duì)照、陰性對(duì)照。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒特異性高、靈敏度高；反應(yīng)速度快，單個(gè)樣本從樣本處理到完成檢測(cè)，僅需2小時(shí)；可同時(shí)滿足高通量和低通量的樣品檢測(cè)，且整個(gè)反應(yīng)過程不需要復(fù)雜的儀器。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101864497SQ20101014575
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者葉魏, 吳嘉平, 周嫻, 周心, 張曉航, 徐高連, 李克勝, 王健, 石堅(jiān), 章琪, 簡(jiǎn)大釗, 胡林, 鐘華燕, 閻俊, 韓曉輝 申請(qǐng)人:上海國際旅行衛(wèi)生保健中心;杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司