一種化合物在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種化合物在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用，特 別涉及3-脫水-6-羥基蛇孢菌素A在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒按照病毒顆粒內(nèi)核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原性的不同可分為甲、乙、丙三種 類型。其中，甲型流感病毒又可根據(jù)其表面血凝素（HA)和神經(jīng)氨酸酶（NA)抗原結(jié)構(gòu)的不 同分成很多亞型。至今發(fā)現(xiàn)不同的HA亞型有18種，其中Hl和H3主要引起人類的大多數(shù) 流感，H5、H7、H9偶爾也會(huì)造成人類的感染。NA亞型有11種，目前在人類中主要的亞型是 Nl、N2和N9。甲型流感病毒是引起人的季節(jié)性流感的主要影響因素，同時(shí)它也能感染包括 家禽、豬、馬在內(nèi)的多種動(dòng)物。
[0003] 流感不僅給人類和動(dòng)物的健康帶來極大的威脅，同時(shí)也造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失及社 會(huì)秩序的擾亂。季節(jié)性流感每年可引發(fā)300萬到500萬例重癥，導(dǎo)致25萬到50萬人死亡。 當(dāng)前對(duì)于流感病毒的主要防治措施是接種疫苗，但是疫苗本身具有一定的局限性：免疫接 種率低，很難產(chǎn)生有效的群體免疫；對(duì)高危人群很難產(chǎn)生有效的免疫力；由于流感病毒RNA 聚合酶缺少翻譯后校正機(jī)制，流感病毒易突變，所以在新突變的病毒快速流行的早期較難 在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出相應(yīng)的疫苗。因此，抗流感藥物在流感的預(yù)防和治療中具有重要作用。
[0004] 目前用于預(yù)防和治療流感的藥物有：
[0005] (1)M2離子通道抑制劑：金剛烷胺、金剛乙胺在M2離子通道抑制劑中具有代表性， 它們以跨膜區(qū)（TM)的N端作為靶點(diǎn)，抑制病毒釋放基因組片段進(jìn)入胞漿，但是現(xiàn)今大多數(shù) 流感病毒對(duì)金剛烷胺均有耐藥性。2008-2009年，在美國幾乎所有的甲型流感病毒H3N2對(duì) 金剛烷胺都具有耐藥性。目前金剛烷類藥物僅用于預(yù)測(cè)病毒在M2通道上的生命周期和確 診后的治療，而且它們只對(duì)甲型流感病毒有效，對(duì)沒有M2蛋白的乙型流感病毒無作用。
[0006] (2)神經(jīng)氨酸酶抑制劑：除M2離子通道抑制劑以外，近三十年來最流行的流感治 療藥物為神經(jīng)氨酸酶抑制劑。NA為四聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體均有一個(gè)唾液酸結(jié)合口袋，組成口 袋的氨基酸在所有A、B型流感中均保守。甲型流感病毒通過囊膜上的HA蛋白與宿主細(xì)胞 表面的唾液酸受體結(jié)合。子代病毒從細(xì)胞釋放必須依賴神經(jīng)氨酸酶活性催化唾液酸受體水 解，這對(duì)病毒傳播和再感染至關(guān)重要。因此阻斷神經(jīng)氨酸酶的特殊作用是治療流感的有效 途徑。當(dāng)前主要有兩種神經(jīng)氨酸酶抑制劑用于臨床治療：奧司他韋（oseltamivir)和扎那 米韋（zanamivir)。2008-2009年，在美國幾乎100%的季節(jié)性HlNl病毒對(duì)奧司他韋產(chǎn)生了 抗藥性。而且對(duì)于有免疫力的患者預(yù)防性應(yīng)用奧司他韋常導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，因此WHO不 推薦將該藥用于預(yù)防。另外，有研究表明肺移植患者對(duì)奧司他韋更易產(chǎn)生耐藥性。
[0007] (3)其它藥物：除此之外，還有靶向流感病毒血凝素的抗病毒藥物、靶向流感病毒 核蛋白的抗病毒藥物、靶向流感病毒RNA聚合酶的抗病毒藥物等。而且近年來人們也嘗 試使用其他方法制備新型抗流感病毒藥物，如利巴韋林、抗體及最近研究較多的核酸藥物 (比如siRNA、適體和miRNA等）。利巴韋林（Ribavirin)是鳥苷類似物，能間接抑制肌苷 5-磷酸鹽脫氫酶活性降低細(xì)胞內(nèi)GTP水平，也可直接抑制病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，極少出 現(xiàn)抗藥性。利巴韋林通過靜脈注射方式給藥，能夠快速清除病毒，但該藥可能會(huì)產(chǎn)生溶血 性貧血，孕婦使用也可能會(huì)導(dǎo)致胎兒畸形，因此其臨床應(yīng)用比較有限。另外Smee等在藍(lán)藻 (Nostocellipsosporum)中發(fā)現(xiàn)一種抗病毒蛋白N(cyanovirin-N)能與病毒表面HAl上 甘露寡糖結(jié)合，阻止病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，有效抑制HlNl病毒對(duì)小鼠和雪貂的感 染。香港大學(xué)袁國勇課題組研究發(fā)現(xiàn)一種名為Nucleozin的小分子化合物，可阻止病毒核 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制H1N1、H3N2和H5N1病毒的感染。
[0008] 因此，研制新型抗流感病毒藥物仍然任務(wù)艱巨。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種化合物在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為3-脫水-6-羥基蛇孢菌素AG-anhydro-e-hydroxy-ophiobolin A) 在制備抗流感藥物中的應(yīng)用。
[0011] 具體而言，本發(fā)明保護(hù)3-脫水-6-羥基蛇孢菌素A(3-anhydro_6-hydroxy-〇phio bolin A)在如下如下（a)和/或（b)和/或（c)中的應(yīng)用：
[0012] (a)制備抗流感病毒藥物；
[0013] (b)制備抑制流感病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的藥物；
[0014] (C)制備治療和/或預(yù)防流感的藥物。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種新的藥物。
[0016] 本發(fā)明所提供的藥物，為抗流感藥物或抗流感病毒藥物，其活性成分為3-脫 水-6_ 羥基蛇抱菌素 A(3-anhydr〇-6_hydroxy-〇phiobolin A)。
[0017] 進(jìn)一步，所述藥物的作用可為如下（al)和/或（a2):
[0018] (al)抑制流感病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；
[0019] (a2)治療和/或預(yù)防流感。
[0020] 以上所有的所述流感病毒，均包含（但不限于）甲型流感病毒。
[0021] 在本發(fā)明中，所述甲型流感病毒為Hl型流感病毒，具體為HlNl型流感病毒；更加 具體的，為HlNl型流感病毒A/WSN/33株（ATCC VR-825)。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，以上所述的細(xì)胞均為A549細(xì)胞（ATCC CCL-185)。
[0023] 在本發(fā)明中，所述3_脫水-6-羥基蛇孢菌素A(3-anhydro_6-hydroxy-〇phioboli n A)的結(jié)構(gòu)式如式I，簡記為L435-3。
[0024]
[0025] 實(shí)驗(yàn)證明，式I所示的化合物L(fēng)435-3 (0. 5 y M)能有效抑制流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù) 制，且通過滴鼻的方式給感染流感病毒的BALB/c小鼠使用L435-3 (0. 3mg/Kg/只）后，小鼠 對(duì)流感病毒的抵抗力增強(qiáng)，表現(xiàn)為流感病毒感染小鼠的體重下降速度變緩慢、肺臟病變程 度減輕、肺臟病毒載量減少和存活時(shí)間延長。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該化合物在抗流感病毒中的有效 應(yīng)用，為預(yù)防新一輪流感的爆發(fā)提供更多的選擇，也為流感的治療帶來新的希望。
【附圖說明】
[0026] 圖1為L435-3處理流感病毒感染A549細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)流感病毒NP蛋 白的表達(dá)量。
[0027] 圖2為試驗(yàn)小鼠的體重變化圖。
[0028] 圖3為試驗(yàn)小鼠的存亡曲線圖。
[0029] 圖4為試驗(yàn)小鼠肺臟的HE染色切片圖。其中，A為組I(400X) ;B為組II(400X); C 為組 III(400X)。
[0030] 圖5為試驗(yàn)小鼠肺臟中流感病毒的滴度。**表示差異極顯著（P〈0. 01)。
【具體實(shí)施方式】
[0031 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] A549細(xì)胞（人肺癌細(xì)胞系）：美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American type culture collection, ATCC)，編號(hào)為 CCL-185。
[0034] HlNl型流感病毒A/WSN/33株：美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American type culture collection, ATCC)，編號(hào)為 VR-825。
[0035] MDCK細(xì)胞（犬腎細(xì)胞系）：美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American type culture collection, ATCC)，編號(hào)為 CCL-34。
[0036] DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，Cat. NO. 12800-017);胎牛血清（Gibco 公司，Cat. NO. 10270-106) 〇
[0037] 實(shí)施例1、化合物3-脫水-6-羥基蛇孢菌素A的制備及鑒定
[0038] 本發(fā)明中的化合物3_脫水-6-羥基蛇孢菌素A (3-anhydro_6-hydroxy-〇phioboli n A)即為中國專利申請(qǐng)（申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310093409,公開號(hào)為CN103193743A)中式（I)所 示的化合物，其制備及鑒定具體參見中國專利申請(qǐng)（申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310093409,公開號(hào)為 CN103193743A)的實(shí)施例 2。
[0039] 具體而言，3_ 脫水-6-羥基蛇抱菌素 A (3-anhydro_6-hydroxy-〇phiobolin A)的 結(jié)構(gòu)式如式I,簡記為L435-3。
[0040]
[0041] 實(shí)施例2、化合物L(fēng)435-3可抑制流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制
[0042] 1、流感病毒感染細(xì)胞
[0043] 接種適量A549細(xì)胞于6孔板中，至細(xì)胞匯合度為90 % -100 %時(shí)感染流感病毒。先 用PBS清洗其中4個(gè)孔內(nèi)的A549細(xì)胞2-3次，再加入1ml病毒維持液（無血清DMEM中含 2 U g/ml的胰酶）和20 ill HlNl型流感病毒A/WSN/33株（M0I = 1)。然后置于37°C，飽和 濕度，5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih,期間每隔15min搖晃一次6孔板。Ih后，將病 毒維持液棄去，再次用PBS清洗細(xì)胞3次后，向其中2個(gè)孔內(nèi)加入2ml新鮮病毒維持液和終 濃度為〇. 5 ii M的L435-3,剩余2個(gè)孔內(nèi)直接加入2ml新鮮病毒維持液，然后繼續(xù)置于細(xì)