一種細(xì)胞膜電流抑制劑及其在抑制Ｋｉｒ2．1內(nèi)向電流方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于內(nèi)向整流鉀離子通道Kir2.1調(diào)節(jié)劑的篩選，具體涉及氫化肉桂酸與HEK293T細(xì)胞浴液混合物對(duì)Kir2.1通道內(nèi)向電流的抑制。
【背景技術(shù)】
[0002]離子通道是細(xì)胞膜上只能通透某一種或某幾種離子的孔道性蛋白，在維持膜電位、進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)方面起著非常重要的作用。內(nèi)向整流鉀通道Kir2.1是鉀離子通道的一種，它允許鉀離子通透這一孔道。在細(xì)胞內(nèi)存在鎂離子或者多胺離子的情況下，鉀離子較易流入細(xì)胞而不易流出細(xì)胞，因此稱為“內(nèi)向整流鉀離子通道”。Kir2.1通道的異常表達(dá)會(huì)引起很多的猝死型心臟疾病，比如安德森綜合癥、短QT3綜合癥、巴氏綜合癥等等。這些疾病都是因?yàn)镵ir2.1某些位點(diǎn)的基因突變以至于其電流變化引起。治療這些癥狀的最有效的手段就是在人體置入心臟除顫器，但除顫器會(huì)引起很嚴(yán)重的神經(jīng)性損傷。特別是對(duì)于幼兒或者兒童，根本不適用。而這些疾病都是家族遺傳性疾病，對(duì)從嬰兒到老人都有很強(qiáng)的致病性。所以尋找Kir2.1通道電流的調(diào)節(jié)劑，對(duì)于研究治療這些疾病的靶向藥物方面意義重大。
[0003]篩選離子通道調(diào)節(jié)劑的實(shí)驗(yàn)設(shè)備主要為膜片鉗，它可以記錄細(xì)胞膜上離子通過(guò)離子通道形成的電流。當(dāng)候選藥物為激活劑時(shí)，則膜片鉗記錄到的離子通道電流變大；當(dāng)候選藥物為抑制劑時(shí)，則膜片鉗記錄到的離子通道電流變小甚至消失。
[0004]前面的工作發(fā)現(xiàn)中藥蘇合香為Kir2.1通道內(nèi)向電流的抑制劑。但蘇合香為一混合物，其單體成份多達(dá)幾百種，這為相關(guān)藥物的研制帶來(lái)很大的困難。氫化肉桂酸是一種化合物單體，其常用于餅干、冰激凌和糖果等的增香劑。此外，氫化肉桂酸作為中間體還常用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可見(jiàn)其對(duì)人體副作用很小。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)當(dāng)前Kir2.1內(nèi)向整流鉀離子通道電流抑制試劑缺乏的情況下，提供一種氫化肉桂酸與細(xì)胞浴液組成的細(xì)胞膜電流抑制劑，該抑制劑能夠?qū)Ρ磉_(dá)于HEK293T細(xì)胞的Kir2.1通道的內(nèi)向電流起到很強(qiáng)的抑制作用。利用含有20mM氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液孵育轉(zhuǎn)染有Kir2.1通道蛋白的HEK293T細(xì)胞后，膜片鉗記錄到的Kir2.1通道內(nèi)向電流消失。當(dāng)灌流無(wú)氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液后，Kir2.1通道電流恢復(fù)，這證明氫化肉桂酸與細(xì)胞浴液混合物未破壞Kir2.1通道蛋白的結(jié)構(gòu)。氫化肉桂酸與細(xì)胞浴液混合物為Kir2.1通道內(nèi)向電流的抑制劑。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007]—種細(xì)胞膜電流抑制劑，該抑制劑的組成包括氫化肉桂酸和細(xì)胞浴液，抑制劑中氫化肉桂酸的濃度為I?20mM ;所述的細(xì)胞浴液的pH值為7.2?7.4，使用蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓為 290 ?310m0sm/L。
[0008]所述的細(xì)胞膜電流抑制劑在抑制Kir2.1內(nèi)向電流方面的應(yīng)用，為利用該抑制劑孵育轉(zhuǎn)染有Kir2.1通道蛋白的HEK293T細(xì)胞，有效抑制或消除Kir2.1通道內(nèi)向電流。
[0009]具體包括以下步驟:
[0010](I)配制細(xì)胞浴液；
[0011](2)將氫化肉桂酸加入到含有細(xì)胞浴液的離心管中，20?40攝氏度下超聲波振蕩至固體全部溶解，得到氫化肉桂酸濃度為I?20mM的細(xì)胞浴液；
[0012](3)利用上面得到的細(xì)胞膜電流抑制劑孵育表達(dá)有Kir2.1通道蛋白的HEK293T細(xì)胞，最終得到Kir2.1內(nèi)向電流被抑制或消除的HEK293T細(xì)胞。
[0013]所述的細(xì)胞浴液優(yōu)選為細(xì)胞浴液a、細(xì)胞浴液b、細(xì)胞浴液C、細(xì)胞浴液d或者細(xì)胞浴液e ;其中，
[0014]所述的細(xì)胞浴液a的組成包括:116.88mM的KC1，5mM的MgCl2, 2mM的EDTA，2.83mM的KH2PO4, 7.17mM的K2HPO4,溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.3，蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓為290 ?310m0sm/L ；
[0015]所述的細(xì)胞浴液b的組成或者包括:濃度分別為140mM的KC1，1mM的K-HEPES，ImM的K-EGTA，溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.3，蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓為290?310m0sm/L ；
[0016]所述的細(xì)胞浴液C的組成包括:濃度分別為I 1mM的KCl，1mM的KH2PO4, 2mM的EDTA, 5mM的HEPES，1.9mM的K2ATP,溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.3，蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓為 290 ?31OmOsm/L ；
[0017]所述的細(xì)胞浴液d的組成或者包括:濃度分別為123mM的KC1，5mM的K2EDTA, 7.2mM的K2HPO4, 8mM的KH2PO4,溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.3，蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓為 290 ?310m0sm/L ；
[0018]所述的細(xì)胞浴液e的組成包括:濃度分別為120mM的KC1，4mM的K2EDTA, 7.2mM的K2HPO4, 2.8mM的KH2PO4,溶劑為超純水，KOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.3，蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓為290?310m0sm/Lo
[0019]本發(fā)明的有益效果是:
[0020]迄今為止，Kir2.1通道的抑制劑有ML133、他莫西芬、氯乙基可樂(lè)定，其中，只有ML133 (N- (4-Methoxybenzyl) -1- (naphthalen-l-yl)methanamine)抑制效果比較明顯，其半數(shù)有效抑制濃度只有290nM。但是它是一種化學(xué)合成的小分子，其對(duì)人體的副作用仍需驗(yàn)證。另外雖然發(fā)現(xiàn)中草藥小分子中的南蛇藤醇和藤黃酸對(duì)Kir2.1通道內(nèi)向電流也有抑制作用，但不能完全抑制，效果不明顯。蘇合香能夠有效抑制Kir2.1通道的內(nèi)向電流，但它是一種混合物，里面含有幾百種單體成份，這對(duì)于研制短QT3綜合征有著極大的困難。
[0021]氫化肉桂酸為一種單體成份，廣泛適用于醫(yī)藥行業(yè)。最近幾年，氫化肉桂酸作為醫(yī)藥原料和中間體逐漸受到重視。本發(fā)明通過(guò)其與細(xì)胞浴液混合而成作為細(xì)胞膜電流抑制劑，對(duì)Kir2.1內(nèi)向電流抑制率達(dá)100%，半數(shù)有效抑制濃度為2.56mM。而且氫化肉桂酸作為一種中藥化合物單體，相對(duì)于采用其他化合物與細(xì)胞浴液組成的抑制劑，其對(duì)人體副作用小，更加有利于短QT3綜合癥的有效治療藥物的進(jìn)一步研發(fā)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為實(shí)施例1中，通過(guò)膜片鉗內(nèi)向外模式記錄到的轉(zhuǎn)染Kir2.1的HEK293T細(xì)胞上的電流隨膜電位的變化，橫坐標(biāo)為膜電位，縱坐標(biāo)為電流。其中:
[0023]圖1A，灌流無(wú)氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液后Kir2.1的內(nèi)向電流隨膜電位變化的特征曲線；
[0024]圖1B，灌流含有20mM氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液后的Kir2.1通道內(nèi)向電流隨膜電位的變化曲線；
[0025]圖1C，利用無(wú)氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液沖掉氫化肉桂酸后的Kir2.1通道的內(nèi)向電流隨膜電位的變化曲線。
[0026]圖2為實(shí)施例1中，通過(guò)膜片鉗內(nèi)向外模式記錄到的轉(zhuǎn)染Kir2.1的HEK293T細(xì)胞上的歸一化內(nèi)向電流。這一內(nèi)向電流會(huì)受到20mM氫化肉桂酸的影響:無(wú)氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液孵育時(shí)，內(nèi)向電流最大；含有20mM氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液孵育時(shí)，內(nèi)向電流接近零；再次更換為無(wú)氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液后，Kir2.1內(nèi)相電流重新恢復(fù)。其中，膜電位為_(kāi)80mV。
[0027]圖3為實(shí)施例1中，蘇合香與氫化肉桂酸對(duì)Kir2.1通道內(nèi)向電流抑制的時(shí)間。這一時(shí)間為抑制至Kir2.1通道最大電流的50%時(shí)需要的時(shí)間。
[0028]圖4為實(shí)施例2中，含有不同濃度氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液對(duì)Kir2.1內(nèi)向電流抑制百分比，也就是量效曲線。橫坐標(biāo)為氫化肉桂酸的摩爾濃度，縱坐標(biāo)為抑制Kir2.1內(nèi)向電流的百分比。IC5。= 2.56mM。這里，曲線中的特征點(diǎn)的氫化肉桂酸在細(xì)胞浴液中的濃度分別為 lmM、2mM、5mM、10mM、16mM 和 20mM。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明涉及的氫化肉桂酸購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，產(chǎn)品編號(hào)135232，CAS 號(hào) 501-52-0，5 克裝。
[0030]實(shí)施例1
[0031 ] 采用膜片鉗測(cè)試方法記錄含有20mM氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液對(duì)Kir2.1內(nèi)向電流抑制與恢復(fù)的代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0032]氫化肉桂酸與細(xì)胞浴液混合液配制方法:量杯量取50mL細(xì)胞浴液倒入50mL離心管中。利用天平秤取0.375克氫化肉桂酸，加入離心管中。將離心管固定在超聲容器中30攝氏度超聲波振蕩30分鐘至固體氫化肉桂酸全部溶解，得到含有50mM氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液。這里配制的氫化肉桂酸的濃度為常溫下氫化肉桂酸溶解度下的摩爾濃度，也就是常溫下氫化肉桂酸所能溶解的最高濃度。50mL含有20mM氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液的配置方法為:取20mL含有50mM氫化肉桂酸的細(xì)胞浴液倒入50mL離心管，再取30mL細(xì)胞浴液倒入此離心管，混勻。
[0033]所述的細(xì)胞浴液配方如下:KCl116.88mM, MgCl25mM, EDTA 2mM，ΚΗ2Ρ042.83mM，K2HP047.17mM，溶劑為超純水，利用KOH調(diào)節(jié)其pH為7.3，利用蔗糖調(diào)節(jié)細(xì)胞浴液滲透壓為290?310m0sm/L。玻璃微電