專利名稱：定量檢測肝癌缺失因子1啟動(dòng)子甲基化水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和基因診斷領(lǐng)域，涉及腫瘤抑癌基因Deleted in Livercancer-1 (肝癌缺失因子1)甲基化的檢測及用途。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，它在細(xì)胞正常發(fā)育、 基因表達(dá)模式以及基因組穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用。它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化 S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(mC)的一種反應(yīng)。在真 核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基。在哺乳動(dòng)物約占C 總量的2 7%。CpG 二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn)，所謂CpG島是指基因的5’端，特別 是啟動(dòng)子和第一外顯子附近的一段DNA序列，其片段長度為Ikb左右，G+C含量大于 50%。CpG島僅占總DNA的左右，幾乎所有的管家基因、約有60%以上基因的啟 動(dòng)子和約占40%的組織特異性基因的5’末端均含有CpG島。若CpG島發(fā)生甲基化， 則啟動(dòng)子也被甲基化。一般說來，DNA的甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)。通過基因啟動(dòng)子 區(qū)及附近區(qū)域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而引起相應(yīng)基 因沉默。CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常重要的地位。異常的CpG甲基 化，被認(rèn)為是人類癌癥發(fā)生早期的一個(gè)特征。早在1983年，F(xiàn)einberg等[FeinbergAP， Vogelstein B.Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers fromtheir normal counterparts.Nature, 1983，301 89_92.]就發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在著基因總體低甲基化和 局部高甲基化的現(xiàn)象。一方面，全基因組的低甲基化可促使癌基因活化，使逆轉(zhuǎn)座子的 轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)及基因的不穩(wěn)定性增加，如去甲基化可能引起癌基因的非擴(kuò)增性的過度表 達(dá)。另一方面，局部的高甲基化，包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤的基因、細(xì) 胞周期調(diào)節(jié)基因、DNA修復(fù)基因、血管形成抑制基因等通過誘導(dǎo)基因突變、基因缺失、 啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)抑制，使抑癌基因喪失功能。這主要是與局部高甲基化 后胞嘧啶更容易產(chǎn)生內(nèi)源性突變，且突變后產(chǎn)生的T G不易被錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制識(shí)別，對(duì) 外源性損傷如物理損傷的敏感性增高等相關(guān)。基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常高甲基化是腫 瘤細(xì)胞中抑癌基因失活的一種重要機(jī)制pHerman JG，merlo A, Maol, et al.Inactivation of theCDKN2/ρ 16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation inall common human cancer.Cancer Res, 1995, 55: 4525-4530.]。鑒于啟動(dòng)子甲基化是抑癌基因發(fā)生表達(dá)缺失和轉(zhuǎn)錄抑制，從而引起癌變的作 用之一，DNA啟動(dòng)子甲基化檢測可用于癌癥的早期診斷，同時(shí)也是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和治療效 果監(jiān)測的有效手段 pBalic M, Pichler M, Strutz J, et al.High qualityassessment of DNA methylation in archival tissues from colorectal cancer patientsusing quantitative high-resolution melting analysis] Mol Diagn，2009，11: 102_108.]。早期的研究已經(jīng)表明在檢測腫瘤患
3者外周血中可以發(fā)現(xiàn)來自腫瘤組織的甲基化DNA，癌變細(xì)胞可以釋放DNA到外周血中， 研究發(fā)現(xiàn)外周血血漿/血清、腫瘤累及器官相關(guān)的體液(如唾液、痰等)中同樣可以檢測 到腫瘤組織中存在的腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子異常甲基化。因此血清中循環(huán)甲基化DNA可 用于腫瘤診斷或作為一個(gè)預(yù)后因子，且甲基化變化似乎發(fā)生在細(xì)胞惡變之前，因此有助 于早期發(fā)現(xiàn)有癌變傾向的細(xì)胞。人類肝癌缺失因子1 (deleted in liver caner-1，DLC-1)基因是1998年首次從人 原發(fā)性肝癌中分離鑒定出來的一個(gè)新抑癌基因。該基因位于人染色體8p21.3-22區(qū)， 全長3800bp，含14個(gè)外顯子，編碼1091個(gè)氨基酸。DLOl的5，端上游的663bp片 段富含 G+C (73% ),完全滿足 CpG 島的定義。Durkin ME 等[4DurkinME，Yuan BZ, Thorgeirsson SS，et al.Gene structure, tissue expression, and linkagemapping of the mouse DLC-I gene.Gene, 2002，288 119_127.]研究認(rèn)為，DLOl具有抑制細(xì)胞增殖和抗腫 瘤的作用。DLOl基因的失活將引起生物過程的改變并導(dǎo)致惡性表型?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在 許多腫瘤包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤[5Ullmann0Va V，Popescu NC.Expression profile of the tumorsuppressor genes DLC-I and DLC-2 in solid tumors.Int J Oncol, 2006，29: 1127_1132.]中均出現(xiàn)低表達(dá)或表達(dá)缺失并伴隨該基因啟 動(dòng)子的甲基化[6ParkSW, Durkin ME, Thorgeirsson SS，et al.DNA variants of DLOl，a candidate tumorsuppressor gene, in human hepatocellular carcinoma.Int J Oncol, 2003, 23: 133-137 ]。DLC-IDNA甲基化改變是癌變?cè)缙诎l(fā)現(xiàn)，早期預(yù)測和癌癥風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后評(píng)估的重 要指標(biāo)之一。目前，常用的甲基化檢測方法主要有甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶 (methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE) -PCR,結(jié)合重亞硫酸鹽的限制 性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA),甲基化特異性聚合酶鏈反 應(yīng)(MSP)和亞硫酸鹽測序的方法。但這些方法都只能定性檢測是否存在甲基化改變， 無法區(qū)分低水平和高水平甲基化。然而，低水平的甲基化(低于轉(zhuǎn)錄抑制閾值)可能 并不具有生物學(xué)意義[3Balic M, Pichler M, Strutz J, etal.High quality assessment of DNA methylation in archival tissues from colorectal cancer patients using quantitative high-resolution melting analysis.J Mol Diagn, 2009，11: 102-108.]，因此，啟動(dòng)子甲基化定量檢測更適合 用于腫瘤的早期診斷和腫瘤擴(kuò)散的早期檢測。迄今為止，已有多個(gè)研究小組開展了對(duì)啟 動(dòng)子甲基化定量檢測的研究，范圍涉及Prader-Willi/Angelman綜合征[7 White HE, Hall VJ, Cross NC.Methylation-sensitive high-resolution melting-curve analysis of the SNRPN gene as adiagnostic screen for Prader-Willi and Angelman syndromes.Clin Chem, 2007, 53 1960-1962.]、結(jié)腸癌[8Wojdacz TK, Dobrovic A.Methylation-sensitive highresolution melting (MS-HRM) a new approach for sensitive and high-throughputassessment of methylation.Nucleic Acids Res, 2007，35.]、宮頸癌[9Kahn SL，Ronnett BM, Gravitt PE, et al. Quantitative methylati on—specific PCR for thedetection of aberrant DNA methylation in liquid-based Pap tests.Cancer, 2008，114 57-64.]等多種疾病。目前，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤TNM分期越后DLC-I甲基化程度越高。如果沒 有簡單有效的甲基化定量檢測方法，則無法根據(jù)DLC-I的甲基化程度進(jìn)一步分析腫瘤發(fā) 病、發(fā)展的情況。
目前，定量檢測甲基化的方法一般采用熒光定量PCR法，也叫Methylight。這
種方法先用甲基化修飾處理待測DNA片段，再用特異性的引物和Taqman探針來區(qū)分甲 基化和非甲基化的DNA[1°范保星.DNA甲基化檢測方法.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊(cè)，2002， 25 99-101 λ但是一種探針通常只包含一個(gè)CpG位點(diǎn)，需要通過不同熒光素標(biāo)記的探 針，才可以檢測多個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平。而且熒光標(biāo)記的探針費(fèi)用較為昂貴，且受較多 因素影響。high-resolution melting(HRM)技術(shù)是是近幾年來推出的一種新的DNA分析方 法。原理與普通熔解曲線分析一樣，根據(jù)熔解溫度(Tm)判斷產(chǎn)物的性質(zhì)。熔解溫度 由PCR產(chǎn)物的GC含量、長度、序列和雜合情況決定。HRM使用的是一種新型飽和染 料SYTO 9 green fluorescent(Invitrogen,美國)，這種染料具有更強(qiáng)的DNA結(jié)合能力和很 低的抑制作用，同時(shí)結(jié)合Rotor-Gene 6000 (CorbettResearch，Mortlake,澳大利亞)實(shí)時(shí) 熒光定量PCR儀精確的溫度控制能力，使得HRM具有普通熔解曲線所無法達(dá)到的高分 辨率 tllReed GH, Kent JO, WittwerCΤ.High-resolution DNAmelting analysis for simple and efficient moleculardiagnostics.Pharmacogenomics, 2007, 8: 597-608.]。樣本 DNA 以亞硫 酸氫鹽處理后，在啟動(dòng)子區(qū)非甲基化胞嘧啶(C)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，接著作為胸腺嘧 啶(T)擴(kuò)增。而甲基胞嘧啶仍然以胞嘧啶保留下來，作為胞嘧啶擴(kuò)增，因而甲基化的序 列G C含量比較高。由于GC堿基對(duì)有三個(gè)氫鍵相連，AT堿基對(duì)為二個(gè)氫鍵，因此 GC堿基穩(wěn)定性比AT堿基好，需要更多的能量才能打開氫鍵，Tm值也就比相應(yīng)的非甲基 化序列高。在熔解曲線圖中，Tm值會(huì)隨著甲基化程度的升高而升高，曲線從左往右依 次排列，因此能精確地劃分標(biāo)本甲基化程度[12 Worm J，Aggerholm A, Guldberg P.In-tube DNA methylation Profilling by fluorescencemelting curve analysis.Clin Chem, 2001, 47 1183-1189. ； 13 Guldberg P, Worm J, Grronbak K.Profilling DNA methylation by melting analysis.Methods, 2002，27 121—127.]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡單的定量檢測DLC-I基因甲基化的方法。本發(fā)明采用高分辨率熔解(high-resolution melting，HRM)技術(shù)，使用商品化的
100%甲基化標(biāo)準(zhǔn)品，建立甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線，并設(shè)計(jì)針對(duì)引物針對(duì)DLC-I啟動(dòng)子區(qū)的134 個(gè)堿基，內(nèi)含12個(gè)CpG位點(diǎn)。本發(fā)明建立的方法可以定量檢測樣本DLOl甲基化程 度。該方法操作簡單、靈敏，檢測到低至的甲基化水平。具體而言，本發(fā)明提供了一種定量檢測肝癌缺失因子1啟動(dòng)子甲基化水平的方 法，其特征在于對(duì)樣本DNA作甲基化修飾，再采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出肝癌缺失因 子1啟動(dòng)子的DNA片段；加入飽和熒光染料，檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的熒光變化，進(jìn) 行熔解曲線分析；根據(jù)樣品曲線在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的位置，確定樣品中肝癌缺失因子1啟動(dòng) 子甲基化水平。上述方法中，對(duì)樣本DNA作甲基化修飾是將樣本DNA中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn) 化為其它種類的堿基。例如，使非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。上述方法中，利用100%甲基化的標(biāo)準(zhǔn)品和100%非甲基化的DNA，調(diào)節(jié)兩者比 例配成甲基化程度為0% -100%若干濃度的溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
上述方法中，標(biāo)準(zhǔn)曲線分辨率視實(shí)際需要而定，例如采用對(duì)應(yīng)于0%、1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%甲基化的溶液，或者濃度種類更少的系列溶液。也可以 根據(jù)需要配制更多種百分比甲基化的溶液。例如，增加配置5%、15%, 40%或者85% 甲基化的溶液。上述方法中，進(jìn)行熔解曲線分析的條件為95°C 2min, 40°C 2min預(yù)處理后， 熔解溫度72 90°C，每升高O.rC采集一次數(shù)據(jù)。本發(fā)明的定量檢測DLOl基因甲基化的方法，其具體步驟如下1.從各類組織或體液標(biāo)本中抽提DNA。2.使用甲基化修飾試劑盒對(duì)DNA作甲基化修飾，使非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿 嘧啶，而甲基胞嘧啶仍然以胞嘧啶保留下來。3.設(shè)計(jì)引物。例如，上游引物 F: 5，-TCGTTACGGTTTTAGAAAGAAA-3，， 下游引物R 5，-TTCGCTCCC AACCAAAACATAA-3 ‘。 相應(yīng)的PCR退火溫度為
58 "C。4.制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)于0%、1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%甲基化的溶液。也可以根據(jù)需要配制更多百分比甲基化 的溶液。例如，增加配置5%、15%, 40%或者85%甲基化的溶液。5.加入熒光染料SYTO-9進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)束后，檢測熔解溫度，分析溫度下 降時(shí)樣本熒光信號(hào)的變化。6.分析樣本甲基化程度。上述方法可用于制備腫瘤診斷試劑，尤其是在制備前列腺癌診斷試劑中的應(yīng)用。上述方法還可以應(yīng)用于結(jié)前列腺癌惡性程度診斷或治療監(jiān)測。本發(fā)明中，可采用該方法檢測外周血中DLC-I基因甲基化，可幫助早期診斷腫瘤。本發(fā)明中，可采用該方法檢測各種體液(包括腦脊液、胸腹水等)脫落細(xì)胞中 DLC-I基因甲基化，幫助早期診斷腫瘤。本發(fā)明中，可采用該方法檢測腫瘤組織DLC-I基因甲基化，以判斷腫瘤的惡性 和分期。本發(fā)明中，可采用該方法檢測腫瘤組織DLC-I基因甲基化，以判斷腫瘤組織對(duì) 藥物的敏感性。本發(fā)明的方法還可以用于制備定量檢測DLOl甲基化水平的試劑盒。該試劑盒 含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控反應(yīng)體系。陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控反應(yīng) 體系包括PCR擴(kuò)增的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照等。本發(fā)明所述的新的檢測DLC-I甲基化的方法所具有的超高敏感性，給有關(guān)腫瘤 的基因診斷工作帶來了顯著的便利，也有利于進(jìn)一步闡明DLOl甲基化的分子機(jī)制。本發(fā)明提供了一種簡單的定量檢測DLC-I基因甲基化的方法。該方法具有方 便、快速、不需要電泳、無污染，非常靈敏的特點(diǎn)，可用于各種類型的標(biāo)本，包括組 織、各種體液、血清(漿)中DNA。尤其可對(duì)各種腫瘤(前列腺癌、白血病等)進(jìn)行基 因?qū)W診斷或治療監(jiān)測。實(shí)施例中，采用此方法檢測了前列腺癌組織中DLOl甲基化水平
6發(fā)現(xiàn)，DLC-I甲基化程度與前列腺癌惡性程度呈正相關(guān)，這預(yù)示DLC-I啟動(dòng)子甲基化改 變是前列腺癌變?cè)缙谥刚?，可以成為評(píng)估前列腺癌惡性程度的重要指標(biāo)。


圖1:不同濃度甲基化標(biāo)準(zhǔn)品的PCR擴(kuò)增曲線?？煽闯鯟t值相近，濃度基本一 致。作為稀釋劑的健康人外周血DNA和作為100%甲基化標(biāo)準(zhǔn)品的CpGenomeUniversal Methylated DNA都采用非甲基化特異性PCR(USP)和甲基化特異性PCR(MSP)驗(yàn)證其甲
基化程度。圖 2 CpGenome Universal Methylated DNA 和健康人外周血 DNA 的 MSP 和 USP
結(jié)果。圖中“M”為標(biāo)準(zhǔn)帶；“1”為空白對(duì)照(水)，沒有條帶；“2”為CpGenome Universal Methylated DNA的MSP結(jié)果，有甲基化條帶；“3”為健康人外周血DNA的 MSP 結(jié)果，無甲基化條帶；“ 4 ” 為 CpGenome Universal MethylatedDNA 的 USP 結(jié)果，
無非甲基化條帶；“5”為健康人外周血DNA的USP結(jié)果，有非甲基化條帶。電泳結(jié)果 證實(shí)此健康人外周血DNA無甲基化，CpGenomeUniversal Methylated DNA為全甲基化。圖3: HRM方法的甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線從右至左依次代表了甲基化程度 100%, 75%, 50%, 25%, 10%, 1%, 0%。圖4:熔解曲線圖，Tm=(79.6 士 0.2) °C 的為非甲基化峰，Tm= (83.5 士 0.2)°C 的為甲基化峰。圖5 HRM檢測DLC-I甲基化程度重復(fù)性曲線圖。各個(gè)濃度的甲基化標(biāo)準(zhǔn)品 重復(fù)檢測2次，熔解曲線幾乎重疊。圖6 采用HRM定量檢測待測樣本甲基化程度。
具體實(shí)施例方式1.DNA 提取使用QIAamp DNAExtract Kit (德國Qiagen公司)試劑盒從前列腺癌石蠟切片中
提取DNA。2.甲基化修飾取DNA 樣本 1 μ g，使用 EZ DNA Methylation-Gold Kit (美國 ZYMO Research 公
司)試劑盒進(jìn)行甲基化修飾，使非甲基化的胞嘧啶在亞硫酸氫鹽作用下轉(zhuǎn)變成尿嘧啶， 而甲基胞嘧啶仍然以胞嘧啶保留下來。3.引物設(shè)計(jì)使用軟件 methyprimer(http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html)設(shè) 計(jì)引物，上游引物 F 5，-TCGTTACGGTTTTAGAAAGAAA-3，，下游引物 R 5’ -TTCGCTCCCAACCAAAACATAA-3‘，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公
司合成。4.配制標(biāo)準(zhǔn)品在定量檢測樣本甲基化程度前，必須先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以CpGenomeUniversal Methylated DNA (美國Chemicon公司)作為100 %甲基化的標(biāo)準(zhǔn)品，以100 %非甲基化
的健康人外周血DNA作為稀釋劑，將兩者濃度調(diào)至相同水平，按不同比例分別配成甲基化程度為0%、1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%系列濃度，圖1為這7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的 real-time PCR結(jié)果，可看出Ct值相近，濃度基本一致。作為稀釋劑的健康人外周血DNA 和作為100 %甲基化標(biāo)準(zhǔn)品的CpGenomeUniversal Methylated DNA都采用非甲基化特異性 PCR (USP)和甲基化特異性PCR (MSP)驗(yàn)證其甲基化程度。圖2為CpGenome Universal Methylated DNA和健康人外周血DNA的MSP和USP結(jié)果，圖中“M”為標(biāo)準(zhǔn)帶；“1” 為空白對(duì)照(水)，沒有條帶；“ 2 ” 為 CpGenome Universal Methylated DNA 的 MSP 結(jié) 果，有甲基化條帶；“3”為健康人外周血DNA的MSP結(jié)果，無甲基化條帶；“4”為 CpGenome Universal Methylated DNA的USP結(jié)果，無非甲基化條帶；“5”為健康人外 周血DNA的USP結(jié)果，有非甲基化條帶。電泳結(jié)果證實(shí)此健康人外周血DNA無甲基 化，CpGenome Universal Methylated DNA 為全甲基化。5.樣本檢測PCR 反應(yīng)總體積為 25 μ 1，反應(yīng)條件為12.5 μ 1 HotStar Taq Master Mix(德國 Qiagen 公司)，上游引物F 0.5 μ 1 (10 μ mol)，下游引物R 0.5 μ 1 (10 μ mol)，0.75 μ 1 SYTO 9染料，加水至總體積24μ1，然后加入Iyl甲基化修飾后的樣本DNA擴(kuò)增。7份不同 濃度的甲基化標(biāo)準(zhǔn)品也配制成相同的反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增條件95°C15min，94°C 30s、 58°C 30s、72°C 45s，50個(gè)循環(huán)后，72°C 5min延伸。使用9700基因擴(kuò)增儀(美國ABI 公司)擴(kuò)增后，將樣品管轉(zhuǎn)移到Rotor-Gene 6000 (澳大利亞Mortlake Corbett Research公 司)，進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析。條件為95°C2min，60°C 2min預(yù)處理后，熔解溫 度(Tm)從72°C升至90°C，每升高0.1°C采集一次數(shù)據(jù)，獲得高分辨率熔解曲線圖。圖3 為甲基化程度分別為0%、1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%的甲基化標(biāo)準(zhǔn)品組成的 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。甲基化程度從左往右依次遞增。也可轉(zhuǎn)換成熔解曲線圖，如圖4，Tm = (79.6士0.1) °C的為非甲基化峰，Tm= (83.5士0.2) °C的為甲基化峰。按照甲基化程度的 降低從上向下依次排列。標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)性好，圖5中可見，甲基化程度100%、75%、 50%, 25%, 10%, 1%, 0%的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測2次，曲線幾乎重疊。6.分析甲基化程度待測樣本在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位置即代表其甲基化程度。如圖4所示，紫線從右至 左依次代表了甲基化程度100%、75%, 50%, 25%, 10%, 1%, O%的標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣 本1為藍(lán)色曲線，其甲基化程度位于25% 50%范圍內(nèi)；樣本2為綠色曲線，其甲基化 程度位于50% 75%的范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種定量檢測肝癌缺失因子1啟動(dòng)子甲基化水平的方法，其特征在于，對(duì)樣本 DNA作甲基化修飾，再采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出肝癌缺失因子1啟動(dòng)子的DNA片段； 加入飽和熒光染料，檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的熒光變化，進(jìn)行熔解曲線分析；根據(jù)樣 品曲線在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的位置，確定樣品中肝癌缺失因子1啟動(dòng)子甲基化水平。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)樣本DNA作甲基化修飾是將樣本DNA 中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為其它種類的堿基。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用100%甲基化的標(biāo)準(zhǔn)品和100%非甲 基化的DNA，調(diào)節(jié)兩者比例配成甲基化程度為0%-100%若干濃度的溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)于0%、1%,10%, 25%, 50%, 75%, 100%甲基化的溶液。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)行熔解曲線分析的條件為 950C 2min, 40°C 2min預(yù)處理后，熔解溫度72 90°C，每升高0.1°C采集一次數(shù)據(jù)。
6.權(quán)利要求1所述的方法用于制備腫瘤診斷試劑。
7.權(quán)利要求1所述的方法在制備前列腺癌診斷試劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的方法在結(jié)前列腺癌惡性程度診斷或治療監(jiān)測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和基因診斷領(lǐng)域，涉及腫瘤抑癌基因Deleted in Livercancer-1，肝癌缺失因子1，甲基化的檢測及用途。本發(fā)明提供了一種定量檢測肝癌缺失因子1啟動(dòng)子甲基化水平的方法對(duì)樣本DNA作甲基化修飾，再采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出肝癌缺失因子1啟動(dòng)子的DNA片段；加入飽和熒光染料，檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的熒光變化，進(jìn)行熔解曲線分析；根據(jù)樣品曲線在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的位置，確定樣品中肝癌缺失因子1啟動(dòng)子甲基化水平。該方法具有方便、快速、不需要電泳、無污染，非常靈敏的特點(diǎn)，可用于各種類型的標(biāo)本?？蓹z測到低至肝癌缺失因子1啟動(dòng)子1％的甲基化水平。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102021234SQ20091019605
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者關(guān)明, 姜昊文, 張心菊, 鄒和建, 陳宇明 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院