一種磁珠法提取游離核酸的方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸提取技術(shù)，特別涉及一種磁珠法提取游離核酸的方法及其試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 1948年Mandel和Metais首次報道游離核酸至今，游離核酸研究已有近70年歷 史，但因當(dāng)時核酸是否是遺傳物質(zhì)而沒有引起人們的廣泛關(guān)注。1970年，歐洲學(xué)者首次報道 腫瘤病人的血漿或血漿中存在游離DNA，其含量為健康人群的10倍左右，其為雙鏈DNA分 子，長度基本在500bp以下，大部分以核小體形式存在。大量研究證明，游離DNA與腫瘤基因 組DNA具有相同的遺傳變異，例如，基因突變、基因啟動子甲基化等，因此，游離核酸可被用 于一種預(yù)測腫瘤發(fā)生的新型標(biāo)記物。1997年，Lo等首次證明孕婦外周血存在胎兒游離DNA， 為非創(chuàng)傷產(chǎn)前診斷開辟了一條新途徑。存在于血漿或血清中來源于腫瘤細(xì)胞的游離DNA主 要來源于：腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死釋放到血液中和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖釋放到血液中。
[0003] 近年來，游離DNA研究成為基因組分子診斷研究的一個熱門領(lǐng)域，首先其可作為 一種無創(chuàng)診斷方法，可以隨時采集患者樣本進行相關(guān)檢測分析。其次，其可作為一類新型生 物標(biāo)志物，因其具有與腫瘤細(xì)胞基因組相同的遺傳變異，具有顯著的特異性，可以對腫瘤進 行分型及早期篩查。因此，循環(huán)游離DNA的檢測在臨床診斷上具有非常重要的應(yīng)用價值，如 癌癥早期篩查、腫瘤復(fù)發(fā)、療效監(jiān)控等。游離DNA研究的主要障礙為：游離DNA的分離純化 和高靈敏度檢測。因游離DNA在血液中的含量低，且片段長度短，為游離DNA研究帶來比較 大的困難。
[0004] 目前核酸提取方法主要有酚氯仿抽提、離心柱法和磁珠法。酚氯仿抽提因大量使 用有毒溶劑，對操作者毒性較大，且難于實現(xiàn)自動化操作。離心柱法因其游離核酸提取效率 低、成本高，且需要高速離心機，也難于實現(xiàn)自動化，均不能廣泛適用于大規(guī)模的臨床檢測。 近年發(fā)展起來的磁珠法提取核酸技術(shù)，其采用超順磁性納米顆粒，利用在高鹽低pH下吸附 核酸，然后在低鹽高pH下分離核酸的原理進行樣本核酸的分離純化，因其只需要在磁場作 用下就能將核酸分離純化出來，故其能實現(xiàn)高通量自動化標(biāo)準(zhǔn)化操作。而目前市場上的基 于磁珠法的商品化試劑操作過于復(fù)雜，并且需要一定溫度下使用蛋白酶K及carrierRNA 進行孵育，同時需要多步洗滌等步驟，導(dǎo)致其自動化程度偏低，核酸提取的重復(fù)性差及提取 效率低；而且提取的樣本量基本在0. 1-1. 2ml，難于滿足一些循環(huán)腫瘤DNA研究應(yīng)用。
[0005] 專利申請?zhí)枮?01410292018. 3的發(fā)明專利公開了一種外周血胎兒游離DNA提取 方法，包括以下步驟：1)取2~10ml孕婦外周血，3~6°C1600g離心8-12min，將上清液 于3~6°C16000g離心8-12min后再取上清液；2)取步驟1)中經(jīng)16000g離心得到的上清 液于離心管中，加等體積消化液和蛋白酶復(fù)合物，55~62°C孵育30min;3)把步驟2)得到 的樣品在冰上冷卻，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混勻，5000g離心4-6min;4)轉(zhuǎn)移步 驟3)上清液與0. 8倍體積磁珠混懸液混合，室溫孵育lOmin;5)將步驟4)得到樣品置于磁 力架上靜置吸附后，吸取上清；6)將步驟5)得到的上清與1. 5倍體積磁珠混懸液室溫孵育 lOmin，置于磁力架上靜置吸附后，棄掉上清液，用75%酒精洗滌2次，即得磁珠-目的DNA復(fù)合體；7)采用DNA洗脫液，將步驟6)獲得的磁珠-目的DNA復(fù)合體在DNA洗脫液中旋渦 振蕩，置于磁力架上靜置，吸取上清液，得到目的DNA。
[0006] 上述專利公開的游離DNA提取方法仍存在操作復(fù)雜、重復(fù)性差、提取效率低以及 提取的樣本量少的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種提取效率高、操作簡便且適用于大樣本 量的磁珠法提取游離核酸的方法，進一步針對上述方法提供一種磁珠法提取游離核酸的試 劑盒。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種磁珠法提取游離核酸的方法，于0. 2-5ml樣本中加入0. 3-7. 5ml裂解結(jié)合液 和20-40ul磁性納米顆粒，混合10-20min后進行第一次磁分離處理，2-5min后棄去第一次 磁分離處理后的上清液，然后加入0. 5-lml洗滌液，混合后進行第二次磁分離處理，2-5min 后棄去第二次磁分離處理后的上清液，然后加入40-100ul洗脫液，混合后靜置5-10min，所 述靜置的溫度為20-65Γ，然后進行第三次磁分離處理，l_2min后取第三次磁分離處理后 的上清液，即獲得所述游離核酸；
[0010] 所述裂解結(jié)合液包括0. 5-6M的A試劑、0. 5-10 %體積濃度的B試劑、10-50 %體積 濃度的C試劑混合制得，所述A試劑為異硫氰酸胍、鹽酸胍、碘化鈉和高氯酸鈉中的至少一 種，所述B試劑為tween20、triton-ΧΙΟΟ、SDS和NP40中的至少一種，所述C試劑為異丙醇 和無水乙醇中的至少一種，所述裂解結(jié)合液的pH值為5-7 ;
[0011] 所述洗滌液包括〇. 5-3M的D試劑和10-70 %體積濃度的E試劑混合制得，所述D 試劑為異硫氰酸胍、鹽酸胍和高氯酸鈉中的至少一種，所述E試劑為異丙醇和無水乙醇中 的至少一種，所述洗滌液的pH值為5-7。
[0012] 本發(fā)明還公開一種磁珠法提取游離核酸的試劑盒，包括裂解結(jié)合液、磁性納米顆 粒、洗滌液和洗脫液；
[0013] 所述裂解結(jié)合液包括0. 5-6M的A試劑、0. 5-10 %體積濃度的B試劑、10-50 %體積 濃度的C試劑混合制得，所述A試劑為異硫氰酸胍、鹽酸胍、碘化鈉和高氯酸鈉中的至少一 種，所述B試劑為tween20、triton-ΧΙΟΟ、SDS和NP40中的至少一種，所述C試劑為異丙醇 和無水乙醇中的至少一種，所述裂解結(jié)合液的pH值為5-7 ;
[0014] 所述洗滌液包括0. 5-3M的D試劑和10-70 %體積濃度的E試劑混合制得，所述D 試劑為異硫氰酸胍、鹽酸胍和高氯酸鈉中的至少一種，所述E試劑為異丙醇和無水乙醇中 的至少一種，所述洗滌液的pH值為5-7。本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] (1)采用磁珠法，通過裂解結(jié)合液、洗滌液和洗脫液，并結(jié)合三次磁分離處理的提 取方法的設(shè)計，具體的，A試劑、B試劑、C試劑分別具有裂解、變性和促進核酸結(jié)合的作用， 包含A試劑、B試劑、C試劑的裂解結(jié)合液通過三者的協(xié)同配合作用，從而獲得優(yōu)良的裂解、 變性和促進核酸結(jié)合的作用；裂解結(jié)合液和洗滌液的pH值為5-7,即通過高鹽低pH分離核 酸，再通過低鹽高pH的洗脫液洗脫核酸，通過優(yōu)化改進裂解結(jié)合液，得到最佳的配方，能在 不使用蛋白酶K及carrierRNA的情況下進行常溫提取低濃度游離核酸，且能在常溫下進 行提取，無需任何高溫孵育，具有操作簡便、提高提取效率和提取純度的優(yōu)點；同時結(jié)合一 種洗滌液，只進行一次洗滌過程得到高純度的核酸，最后的洗脫也可以在常溫下進行洗脫； 具有提取操作簡單方便且省時的優(yōu)點。
[0016] (2)由于游離核酸濃度低，其中的游離腫瘤核酸濃度更低，裂解結(jié)合液、洗滌液和 洗脫液的配方設(shè)計使得大樣本量提取試劑能富集更多的核酸以用于相關(guān)檢測，本發(fā)明的磁 珠法提取游離核酸的方法，可以增大樣本量至〇.2-5ml，相應(yīng)的裂解結(jié)合液按比例增大至 0. 3-7. 5ml，磁性納米顆粒的用量增大至20-40ul，具有大幅度提高樣本量的優(yōu)點，可滿足大 樣本量提取的需求；同時，對于低濃度樣本具有非常明顯的富集作用；
[0017] (3)可減少提取的時間，整個提取過程時間在半小時以內(nèi)，快速方便，易于全自動 化、標(biāo)準(zhǔn)化操作；
[0018] (4)適用于短片段的核酸的提取，能高效用于低至100bp游離核酸片段的分離純 化；同時，分離純化的游離核酸可直接應(yīng)用于下游的各類分子生物學(xué)檢測，尤其能應(yīng)用臨床 分子診斷；
[0019] (5)本發(fā)明的磁珠法提取游離核酸的方法可以同時適用于無細(xì)胞樣本和細(xì)胞樣本 的游離核酸的提取。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明磁珠法提取游離核酸的方法與采用進口Q公司磁珠法提取方法提取 獲得的核酸的對比檢測示意圖；
[0021] 圖2為本發(fā)明磁珠法提取游離核酸的方法用于不同樣本量的提取時獲得的核酸 的檢測不意圖；
[0022] 圖3為本發(fā)明磁珠法提取游離核酸的方法用于提取血漿和血清樣本時獲得的核 酸的檢測示意圖。
【具體實施方式】
[0023] 為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附 圖予以說明。
[0024] tween20 為吐溫-20 ;
[0025] triton-ΧΙΟΟ為聚乙二醇辛基苯基醚，分子式為C34H620 11;
[0026] SDS為十二烷基硫酸鈉；
[0027] NP40為乙基苯基聚乙二醇。
[0028] 裂解結(jié)合液中，異硫氰酸胍、鹽酸胍、碘化鈉、twe