一種多分散dna提取磁珠的制備方法及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及磁性納米微球制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其是多分散DNA提取磁珠的制備方法及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]磁珠是納米磁性微球的簡稱，具有磁性材料和納米材料的雙重特點，是20世紀70年代末興起的一種新型材料。其表面可連接多種化學官能基團，從而達到與各類生物大分子的吸附或偶聯(lián)的目的，由于磁珠本身具有較高的磁響應性，可通過控制外界磁場實現(xiàn)磁珠的集中與分離，這就使得整個操作過程變得簡單快捷，尤其針對DNA提取技術(shù)，磁珠配合帶有磁分離裝置的設(shè)備，可在最大程度上實現(xiàn)DNA提取的自動化。目前，磁珠法DNA提取已廣泛應用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學診斷、司法鑒定等各個領(lǐng)域中。
[0003]磁珠的制備方法有很多，如球磨法、沉淀法、微乳液法、水熱法等等，用這類方法的制備的磁珠可分為兩種:單分散磁珠和多分散磁珠。單分散磁珠的制備工藝復雜，操作繁瑣，耗時長，較難實現(xiàn)大批量的工業(yè)生產(chǎn)，且單分散磁珠的應用領(lǐng)域集中在細胞分離純化、免疫診斷及腫瘤靶向治療等方面，就DNA提取而言，單分散磁珠并無較大的優(yōu)勢，而且其成本較高，無法良好的推廣于實際應用中。多分散磁珠的制備工藝相對簡單，易于批量化生產(chǎn)，但磁珠本身較易團聚，使其懸浮性降低，而且在制備過程中，磁珠較易被其他化學試劑氧化，導致表面官能基團缺失，嚴重影響了 DNA提取效率，使其較難普及到整個DNA提取領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對【背景技術(shù)】中指出的磁珠本身較易團聚，使其懸浮性降低，而且在制備過程中，磁珠較易被其他化學試劑氧化，導致表面官能基團缺失，嚴重影響了 DNA提取效率的問題，本發(fā)明的目的是提供一種多分散DNA提取磁珠的制備方法，該方法操作簡單，穩(wěn)定，成本低，適于大批量的工業(yè)生產(chǎn)，制備得到的磁珠具有懸浮性好，官能基團穩(wěn)定，生物吸附性能較高等特點，本發(fā)明還對該類磁珠進行了自動化DNA提取的驗證，從而更好的證明其實用效果。
[0005]為了實現(xiàn)所述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種多分散DNA提取磁珠的制備方法，其制備步驟為:
s 1:多分散裸珠的制備:將FeCl3.6H20與FeS04.7H20按比例混合于去離子水中，300rpm機械攪拌至完全溶解后，通入氮氣，將機械攪拌轉(zhuǎn)速提至500rpm，持續(xù)攪拌20min ；加入反應制劑，繼續(xù)攪拌30min ;將上述溶液轉(zhuǎn)入2L反應釜中，在100°C _200°C條件下反應10-24小時；冷卻至室溫后，將反應物移出反應釜，用乙醇清洗后，用去離子水清洗，直至上清液PH值為7，真空干燥，得到固體粉末，即多分散裸珠；
S2:多分散磁珠的制備:稱取S1所述多分散裸珠10g，并將其加入含有表面活性劑的溶液中，300rpm機械攪拌30min后，用去離子水清洗；磁分離，將上清倒掉，加入lmol/L的鹽酸溶液50ml，300rpm機械攪拌30min，同時超聲處理30min，結(jié)束后用去離子水清洗；磁分離，將上清倒掉，加入100ml的無水乙醇，超聲處理30min ;加入質(zhì)量分數(shù)10%的檸檬酸鈉水溶液50ml，400rpm機械攪拌30min，同時輔助超聲處理30min ;加入20ml氨水，超聲處理20min ;加入體積比為1:1.5的娃酸乙酯和無水乙醇混合液20ml，超聲處理15min ;然后再次加入體積比為1:1.5的娃酸乙酯和無水乙醇混合液20ml，超聲處理15min ;300rpm機械攪拌12小時后，制得多分散磁珠。
[0006]本發(fā)明所述S1 中的 FeCl3.6H20 與 FeS04.7H20 的比例為 1-2.5mol:lmol。
[0007]本發(fā)明所述S1中的反應制劑為PEG2000、乙酸鈉、檸檬酸鈉中的一種或幾種。
[0008]本發(fā)明所述S2中的含有表面活性劑的溶液為質(zhì)量分數(shù)5%的檸檬酸鈉溶液或十六烷基三甲基溴化銨溶液。
[0009]—種多分散DNA提取磁珠的應用，所述多分散DNA提取磁珠在DNA自動化提取領(lǐng)域的應用。
[0010]本發(fā)明所述多分散DNA提取磁珠在DNA自動化提取領(lǐng)域的應用過程為:S1:人工操作:選取多分散DNA提取磁珠樣本，將樣本轉(zhuǎn)移到DNA提取設(shè)備AUT0MAG? 32的32孔板中；
52:機器操作:將2%CTAB自動轉(zhuǎn)移至AUT0MAG? 32的32孔板中，同時加熱，實現(xiàn)自動化裂解；
53:人工操作:裂解后將AUT0MAG? 32的32孔板取出進行離心；
54:機器操作:將520ul磁珠結(jié)合液轉(zhuǎn)移至32孔板中，吹吸10次，磁分離1分鐘，吸棄上清；將400ul洗滌液轉(zhuǎn)移至32孔板中，吹吸10次，磁分離1分鐘，吸棄上清；將150ul洗脫液轉(zhuǎn)移至32孔板中，吹吸10次，磁分離1分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至PCR八連管中；
55:然后將磁珠結(jié)合液、洗滌液及洗脫液自動轉(zhuǎn)移至AUT0MAG? 32的32孔板，同時伴隨升溫與降溫，實現(xiàn)DNA的自動化提取，最終DNA提取設(shè)備將提取好的DNA溶液轉(zhuǎn)移至PCR八連管中，進行下游的檢測與實驗。
[0011]本發(fā)明所述磁珠結(jié)合液為250ul無水乙醇、250ul異丙醇及20ul磁珠；所述洗滌液為400ul 80%無水乙醇；所述洗脫液為150ul去離子水。
[0012]由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明首先生產(chǎn)的是不含官能基團多分散裸珠，這使得接下來包覆官能基團的過程更為簡便、靈活，可根據(jù)實際需求，進行不同種類，不同濃度的官能基團包覆，且反應制劑采用了 PEG2000、乙酸鈉、檸檬酸鈉中的一種或幾種，使其制得裸珠在第一環(huán)節(jié)便具有較高的懸浮性，粒徑也更加均一。
[0013]對不含官能基團的多分散裸珠進行了表面改性，尤其以鹽酸溶液輔助改性過程，使裸珠表面與鹽酸發(fā)生初步反應，再配以檸檬酸鈉溶液，使得表面改性更加徹底。
[0014]對制備好的多分散磁珠進行了熟化處理，在氨水的作用下，連續(xù)攪拌12小時，使多分散磁珠的懸浮性及官能基團更加穩(wěn)固，從而使其理化性質(zhì)更加穩(wěn)定。
【具體實施方式】
[0015]通過下面的實施例可以詳細的解釋本發(fā)明，公開本發(fā)明的目的旨在保護本發(fā)明范圍內(nèi)的一切技術(shù)改進。
[0016]實施例1 (1)取 0.15mol 的 FeCl3.6H20 與 0.lmol 的 FeS04.7H20 混合于 500ml 去離子水中，300rpm機械攪拌至完全溶解后，通入氮氣，將機械攪拌轉(zhuǎn)速提至500rpm，持續(xù)攪拌20min。
[0017](2)加入40g PEG2000和25g檸檬酸鈉，繼續(xù)攪拌30min。
[0018](3)將上述溶液轉(zhuǎn)入2L反應釜中，在120°C條件下反應10小時。
[0019](4)冷卻至室溫后，將反應物移出反應釜，用500ml乙醇清洗3遍后，用去離子水清洗5遍以上，直至上清液PH值為7，真空干燥，得到不含官能基團的多分散裸珠。
[0020](5)稱取步驟(4)中的固體粉末10g，并將其加入100ml質(zhì)量分數(shù)為5%的檸檬酸鈉溶液中，300rpm機械攪拌30min后，用去離子水清洗3遍。
[0021](6)磁分離，將上清倒掉，加入lmol/L的鹽酸溶液50ml，300rpm機械攪拌30min，同時超聲處理30min，結(jié)束后用去離子水清洗3遍。
[0022](7)磁分離，將上清倒掉，加入100ml的無水乙醇，超聲處理30min。
[0023](8)加入質(zhì)量分數(shù)10%的檸檬酸鈉水溶液50ml，400rpm機械攪拌30min，同時輔助超聲處理30min。
[0024](9)加入20ml氨水，超聲處理20min。
[0025](10)加入娃酸乙酯和無水乙醇的混合液(體積比1:1.5) 20ml，超聲處理15min。
[0026](11)重復步驟(10)，300rpm機械攪拌12小時后，制得多分散磁珠。
[0027](12)將制好的多分散磁珠用500ml無水乙醇清洗3遍后，去離子水清洗10遍以上，直至上清液PH值為7，調(diào)整固含量為15%。
[0028]實施例2
(1)取 0.2mol 的 FeCl3.6H20 與 0.lmol 的 FeS04.7H20 混合于 700ml 去離子水中，300rpm機械攪拌至完全溶解后，通入氮氣，將機械攪拌轉(zhuǎn)速提至500rpm，持續(xù)攪拌20min。
[0029](2 )加入60g PEG2000，40g檸檬酸鈉，繼續(xù)攪拌30min。
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