Mlh1基因啟動子甲基化檢測引物探針體系及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因突變的檢測產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測引物和檢測體系， 屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)是人體細胞的一種能修復(fù)DNA堿基錯配的安全保障體系， 可保持遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性。1^!11、111012、111013是1^系統(tǒng)中重要的錯配修復(fù)基 因。DNA損傷修復(fù)基因的高甲基化引起的表達降低會導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)能力的下降和隨之發(fā) 生的基因突變。
[0003] MLH1基因 （MutL homologl)位于3ρ21·3,全長243%口。祖^1基因發(fā)生甲基化，會導(dǎo) 致這個基因表達失活或是表達的蛋白不能將錯配的堿基及時修復(fù)，這樣就有可能發(fā)生抑癌 基因失活，癌基因激活，最終會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。大量研究表明，腫瘤組織中的MLH1基因的 啟動子區(qū)域是高度甲基化的。對大腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、膽囊癌等的研究顯示， 它們的MLH1基因啟動子區(qū)域的CpG島發(fā)生甲基化，并且其甲基化程度明顯高于正常組織， MLH1基因啟動子區(qū)域的異常甲基化促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究還顯示MLH1基因甲基化差 異與白血病發(fā)生及進展惡化顯著相關(guān)。另外，MLH1基因啟動子過度甲基化現(xiàn)象在遺傳性非 息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)中發(fā)生率較 高，是HNPCC發(fā)病的相關(guān)因素之一。hMLHl基因的檢測對腫瘤診斷、浸潤和轉(zhuǎn)移等都具有重要 意義。
[0004] 目前，檢測甲基化的方法包括：1、甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶（Me thy 1 at ion-sensitive restriction Endonuclease ，MS_RE) 法。但識別的CG序列因酶的識別位點有限 故有局限性，且存在酶不完全消化引起的假陽性問題；2、甲基化特異性PCR法 (Methylation-specific PCR，MSP)，是目前較為常見的檢測基因甲基化的方法。MSP法的原 理是首先用亞硫酸鹽修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶， 而甲基化的胞嘧啶則不變。設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行PCR擴增，最后通 過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態(tài)。但是該方法對引物設(shè)計 要求非常高，一般會因為亞硫酸鹽過度的處理，使得模板很難擴增出來。MSP法目前多結(jié)合 巢式PCR法。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對PCR引物擴增。第一對PCR 引物擴增片段和普通PCR相似;第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段 的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的 好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴 增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。MSP法結(jié)合巢式PCR擴增的方法是設(shè)計針對 沒有變化的模板的一組引物;針對變化了的模板的一組引物;看哪組引物能擴增出來從而 判斷模板有沒有變化，如果模板沒變化，就表示模板被甲基化了。MSP法結(jié)合巢式PCR擴增的 方法能提高單一 MSP法的特異性，但操作時間長，且相比MSP法同樣存在重亞硫酸鹽處理不 完全導(dǎo)致的假陽性修飾過程中的pH值要絕對準確、所有試劑要求新鮮配置，并且需要反復(fù) 摸索找出合適的反應(yīng)時間，造成整個檢測過程繁瑣，且不能做到定量檢測，存在較高的假陽 性率;也存在亞硫酸鹽處理過度，造成擴增困難的情況；3、甲基化敏感性解鏈曲線分析法 (MS-High Resolution Melting Curve，MS_HRM)，操作繁瑣，假陽性率高，且不適于大量樣 本的檢測；4、熒光法(Methylight)，由于探針的局限性，一般沒有合適的對照體系，假陽性 率較高；5、亞硫酸氫鹽基因測序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)，是PCR聯(lián)合Sanger測 序技術(shù)，結(jié)果準確，但過程繁瑣，不適合大批量檢測，且價格昂貴不能廣泛使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種方案簡潔，靈敏度高，準確率高的MLH1基因 啟動子甲基化檢測試劑盒，以及其檢測引物探針和檢測體系。
[0006] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是:一種MLH1基因啟動子甲基化 檢測引物探針，包括用于判定基因組DNA質(zhì)量的引物探針組X、用于判定甲基化轉(zhuǎn)化率的引 物探針組Y和用于檢測MLH1基因啟動子甲基化情況的引物探針組Z;
[0007] 所述引物探針組X包括正向引物a、反向引物a和探針a;
[0008] 所述引物探針組Y包括正向引物b、反向引物b和探針b;
[0009] 所述引物探針組Z包括正向引物b、反向引物b和探針c;
[0010]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示；
[0011]所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0012]所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0013]所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0014] 所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0015] 所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0016] 所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
[0017] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有報告熒光基團，所述探針a、探針b和探針c的 3'端設(shè)有淬滅熒光基團。
[0018] 上述各引物應(yīng)用于PCR反應(yīng)中的終濃度為0.4μΜ;各探針應(yīng)用于PCR反應(yīng)中的終濃 度為0.2μΜ。
[0019] 上述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報告熒光基團。
[0020] 上述相互區(qū)別的報告熒光基團有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或 Cy3，第三種是Cy5或R0X;所述探針a和探針b的淬滅熒光基團是BHQ1;所述探針c的淬滅熒光 基團是MGB。
[0021] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種采用上述引物探針的 MLH1基因啟動子甲基化檢測試劑盒。
[0022]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是:一種MLH1基因啟動子甲基化 檢測體系，包括用于判定基因組DNA質(zhì)量的反應(yīng)體系X、用于判定甲基化轉(zhuǎn)化率的反應(yīng)體系Y 和用于檢測MLH1基因啟動子甲基化情況的反應(yīng)體系Z;
[0023] 所述反應(yīng)體系X包括正向引物a、反向引物a、探針a、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2和純 水；
[0024] 所述反應(yīng)體系Y包括正向引物b、反向引物b和探針b、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2和純 水；
[0025] 所述反應(yīng)體系Z包括正向引物b、反向引物b、探針c、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2和純 水；
[0026]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
[0027] 所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0028] 所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0029] 所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0030] 所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0031] 所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0032] 所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
[0033] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有報告熒光基團，所述探針a、探針b和探針c的 3'端設(shè)有淬滅熒光基團。
[0034]上述各反應(yīng)體系的組分中包括十倍濃度的PCR緩沖液1體積，2mM的dNTPs試劑1體 積，15mM的MgCh溶液1體