專利名稱：制備單核細(xì)胞型干細(xì)胞的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞分離，培養(yǎng)，擴(kuò)增的方法及應(yīng)用，具體是指單核細(xì)胞型干細(xì)胞的制
備方法及在制備藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多功能性的干細(xì)胞是人體的一種寶貴資源。干細(xì)胞被廣泛用來進(jìn)行研究，藥物生
產(chǎn)和藥物治療，其中包括骨髓干細(xì)胞移植。干細(xì)胞可以用來研究信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)分化過程，也
可以用來查明并測試藥物的有效性和毒副作用，或用于更換由于疾病或環(huán)境的影響而損壞
的組織。然而，當(dāng)前多能干細(xì)胞生物學(xué)和藥用前景存在著很大的缺點(diǎn)和爭議。 使用來自胎兒，臍帶或體外受精胚胎組織的多能干細(xì)胞會引起倫理和法律問題，
同時(shí)還會帶來感染的問題和免疫排斥的問題。特別是胚胎干細(xì)胞還有一些特定的缺點(diǎn)。舉
例來說，胚胎干細(xì)胞要通過若干中間階段才成為需要的細(xì)胞類型來治療某種特定疾病。此
外，胚胎干細(xì)胞可能會被受捐助人的免疫系統(tǒng)所排斥，因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞的捐助人和受捐助
人往往不是同一個(gè)人。 其中一個(gè)能規(guī)避這些問題的方法是利用自體干細(xì)胞，優(yōu)選外周血。骨髓細(xì)胞中有部分細(xì)胞能夠逆向分化成血液細(xì)胞系以外的其他細(xì)胞。然而，最近的研究提出對這一結(jié)果提出質(zhì)疑，這樣的逆向分化，可能是成熟細(xì)胞與干細(xì)胞融合產(chǎn)生的新的干細(xì)胞。重要的是，從骨髓中獲取干細(xì)胞往往是一個(gè)痛苦和繁瑣的過程。 因此，需要發(fā)明出一個(gè)分離，培養(yǎng)，保持，擴(kuò)增，分化為干細(xì)胞的方法(尤其是容易提取的成人干細(xì)胞)，并培養(yǎng)成各種細(xì)胞類型以用于多種用途。這些用途可能包括但不限于使用自體干細(xì)胞來治療疾病和改善疾病帶來的癥狀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一個(gè)由單核細(xì)胞制成干細(xì)胞的方法。本發(fā)明還包括制備，擴(kuò)增和使用該種單核細(xì)胞型干細(xì)胞和該種干細(xì)胞衍生物的方法。本發(fā)明中的單核細(xì)胞型干細(xì)胞來自于外周血，外周血轉(zhuǎn)化生成的干細(xì)胞具有很高的成本效益。這些單核細(xì)胞型干細(xì)胞可以很容易進(jìn)行體外擴(kuò)增。本發(fā)明中的單核細(xì)胞型干細(xì)胞可以用來治療疾病，改善與任何與此類疾病有關(guān)的癥狀。 本發(fā)明提供的分離單核細(xì)胞和轉(zhuǎn)化方法包括分離外周血單核細(xì)胞和用細(xì)胞因子處理單核細(xì)胞。這些細(xì)胞因子包括M-細(xì)胞集落剌激因子(M-CSF)，白介素-6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)。在這些細(xì)胞因子培養(yǎng)下，單核細(xì)胞擴(kuò)增分化成多功能性干細(xì)胞。處理前的單核細(xì)胞可以是經(jīng)過冷凍復(fù)蘇的細(xì)胞，而處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞也可以冷凍保存。
本發(fā)明中的單核細(xì)胞型干細(xì)胞具有明顯的干細(xì)胞表現(xiàn)型，這些表現(xiàn)型至少包括一種下面的細(xì)胞表面標(biāo)志(MAC-1， CD14， CD34， CD40和CD45)，或至少能夠生產(chǎn)一種細(xì)胞因子(IL-13, IL-6和IL-12p70)，或顯示出吞噬活性，或顯示淋巴細(xì)胞活化活性，或顯示對胰蛋白酶，乙二胺四乙酸的耐受性，或顯示對利多卡因的敏感性。獲取的單核細(xì)胞型干細(xì)胞的表現(xiàn)型中，優(yōu)選吞噬活性，其次是至少有一個(gè)以上細(xì)胞表面標(biāo)志，其次是生產(chǎn)上面的任意一 種細(xì)胞因子，其次是顯示淋巴細(xì)胞活化活性，其次是顯示對胰蛋白酶，乙二胺四乙酸的耐受 性，其次是顯示對利多卡因的敏感性。 本發(fā)明獲取的單核細(xì)胞型干細(xì)胞至少表達(dá)下面各種細(xì)胞表面抗原的一種MAC-1， CD14， CD34， CD40和CD45。本發(fā)明獲取的多功能干細(xì)胞優(yōu)選不表達(dá)CD la和CD83的細(xì)胞。
本發(fā)明提供的方法包括分離和獲取單核細(xì)胞型干細(xì)胞，和對干細(xì)胞用誘導(dǎo)分化劑 進(jìn)行有效的誘導(dǎo)分化。本發(fā)明優(yōu)選使用用于擴(kuò)增和維持的培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化。本發(fā)明優(yōu) 選人的單核細(xì)胞型干細(xì)胞，本發(fā)明也包括使用冷凍保存的單核細(xì)胞型干細(xì)胞和單核細(xì)胞型 干細(xì)胞分化的功能細(xì)胞。 本發(fā)明還提供了一種識別細(xì)胞類型的方法和根據(jù)上述方法鑒定出的分化的功能 細(xì)胞。本發(fā)明對細(xì)胞擴(kuò)增，分化的描述是本行業(yè)中具備普通技能的人士所通常理解的含義。 例如，本發(fā)明對單核細(xì)胞型干細(xì)胞的維持，增長和分化為神經(jīng)細(xì)胞所采用的神經(jīng)細(xì)胞生長 因子，維持，增長和分化的條件有非常詳細(xì)的描述。 本發(fā)明還對單核細(xì)胞型干細(xì)胞的維持，增長和分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞，T， NK淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞所采用的細(xì)胞生長因子，維持，增長和分化的條件有非常詳 細(xì)的描述。本發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞包括但不僅僅局限于人，也包括其它哺乳動物的來 源。 本發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞用于治療的疾病包括但不限于阿爾茨海默氏癥，帕金 森氏癥，老年癡呆癥，多發(fā)性硬化癥，與年齡有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，包括時(shí)間，日期， 位置或身份混亂，和/或最近的記憶喪失，獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)的相關(guān)性癡 呆，腦損傷，囊腫，自體免疫疾病，細(xì)菌感染，膿腫，病毒感染，腦腫瘤，癲癇，神經(jīng)創(chuàng)傷，手術(shù) 切口 ，糖尿病潰瘍，血友病潰瘍，靜脈曲張潰瘍，固體血管源性腫瘤，白血病，血管瘤，聽神經(jīng) 瘤，神經(jīng)纖維瘤，沙眼，化膿性肉芽腫，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn) 兒視網(wǎng)膜黃斑變性，角膜移植排斥反應(yīng)，新生血管性青光眼，晶狀體后纖維組織增生，虹彩， 毛細(xì)血管，韋伯綜合癥，心肌血管盲目性新生，新生血管，毛細(xì)血管擴(kuò)張，血友病，血管纖維 瘤，肉芽，上皮細(xì)胞新增生，克羅恩病，化學(xué)，熱，感染或自身免疫引起的腸道損傷，化學(xué)品， 熱，感染或自身免疫引起的皮膚損傷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，艾滋病，關(guān)節(jié)炎，胰島素依賴型糖尿 病，器官特異性自身免疫性疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腸炎病，橋本甲狀腺炎，甲亢病，接觸性皮 炎，牛皮癬，排斥反應(yīng)，移植物抗宿主疾病，結(jié)節(jié)病，胃腸道過敏，嗜酸細(xì)胞增多，結(jié)膜炎，腎 小球腎炎，驅(qū)蟲感染，瘤型麻風(fēng)病，糖尿病，高雪氏病，尼曼匹克癥，寄生感染，癌癥的免疫系 統(tǒng)紊亂，化工(包括毒品和酒精)，物理，感染，或自身免疫引起的肝，肝癌，肝損害，癌癥。本 發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞與單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化的功能細(xì)胞聯(lián)合使用，可用于治療上述 疾病或改善與上述疾病有關(guān)的癥狀。 本發(fā)明提供了分離來自外周血的單核細(xì)胞，以及培養(yǎng)，擴(kuò)增和分化成為單核細(xì)胞 型干細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了使用這種細(xì)胞治療各種疾病或改善至少一種或更多這類 疾病癥狀的方法。本發(fā)明的多功能成體干細(xì)胞來自于單核細(xì)胞，優(yōu)選人類，也可以是家畜， 寵物或其他哺乳動物。單核細(xì)胞來源的干細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化成仍具有分化能力的細(xì)胞，或 末端分化細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞，TNK淋巴細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞或肝細(xì)胞(即 具備這種細(xì)胞的特征)。
本發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是能夠進(jìn)行自體移植。使用能進(jìn)行自 體移植的單核細(xì)胞型干細(xì)胞可以降低免疫排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)和疾病的傳播。此外，單核細(xì)胞 型干細(xì)胞具有擴(kuò)增的能力，從而產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)胞，滿足治療疾病和改善與上述疾病有 關(guān)的癥狀的需要。因此，本發(fā)明提供的方法比現(xiàn)有的方法更加有效。本行業(yè)內(nèi)具有普通技 能的人士根據(jù)常規(guī)方法能夠很容易確定單核細(xì)胞型干細(xì)胞的劑量和給藥方式。因此，存儲， 擴(kuò)增和分化單核細(xì)胞型干細(xì)胞對于進(jìn)行自體移植具有非常寶貴的價(jià)值。 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是外周血來源豐富，可以安全，經(jīng)濟(jì)的得到。此外，外周血 很容易再生，可以能提供持續(xù)的自體來源。該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)好處是單核細(xì)胞型干細(xì)胞 來源于成人，不存在胚胎干細(xì)胞面臨的道德和倫理的爭議。本發(fā)明所涉及的專業(yè)術(shù)語是 本行業(yè)內(nèi)具備普通技能的人士所通常理解的含義。常用術(shù)語的定義在所有分子生物學(xué)書 中可以找至lj，例如，Benjamin Lewin， Genes VIII， Oxford University Press, 2004 (ISBN 0_13_145140_5);或者Ronald Hoffman, Hematology Basic Principles and Practice, E lsevier(ISBN978-0-443-06715-0)。 本發(fā)明提供了本行業(yè)內(nèi)具備普通技能的人士所能夠理解的制備單核細(xì)胞型干細(xì) 胞的步驟和方法( 一 )分離外周血單核細(xì)胞，(二 )用M-CSF， IL-6和LIF培養(yǎng)外周血單核 細(xì)胞(三)在合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件下擴(kuò)增單核細(xì)胞型干細(xì)胞。M-CSF的劑量是(25-200納 克/毫升)，IL-6的劑量是(10-50納克/毫升)，LIF的劑量是(100-2000活性單位/毫 升)。優(yōu)選50納克/毫升的M-CSF， 20納克/ml的IL-6和1000活性單位/毫升LIF。
用于本發(fā)明的M-CSF， IL-6或LIF可以是天然來源，可以是人工合成，也可以是 M-CSF， IL-6或LIF的具備功能的蛋白質(zhì)片斷。M-CSF， IL_6或LIF可單獨(dú)使用也可以加上 適當(dāng)?shù)木彌_劑后聯(lián)合使用。本行業(yè)內(nèi)具備普通技能的人士有能力決定出上述蛋白來源使用 的劑量。 本發(fā)明利用一個(gè)或多個(gè)生長因子來擴(kuò)增單核細(xì)胞型干細(xì)胞。同樣的，本發(fā)明也 利用一個(gè)或多個(gè)生長因子來分化單核細(xì)胞型干細(xì)胞成為功能細(xì)胞。本行業(yè)內(nèi)具備普通技 能的人士會認(rèn)識到一個(gè)或更多的用來擴(kuò)增的生長因子也可以用來分化單核細(xì)胞型干細(xì)胞。 本發(fā)明中的生長因子包括，但不僅限于，巨噬細(xì)胞集落剌激生長因子(M-CSF)，白細(xì)胞介 素-6 (IL-6)和白血病抑制因子(LIF)。作為生長因子和/或分化誘導(dǎo)的化合物包括但不限 于，脂多糖(LPS)，佛波13-脂(PMA)，干細(xì)胞生長因子(SGF)，重組人白細(xì)胞介素-2(IL-2)， 白介素-3(IL-3)，表皮生長因子(EGF)， P-神經(jīng)生長因子(NGF)，重組人血管內(nèi)皮生長因 子異構(gòu)體(VEGF)的，和肝細(xì)胞生長因子(HGF)。生長因子用來擴(kuò)增和分化的濃度為LPS， 0. 5-1. 0納克/毫升；PMA， 1-160納摩/升(翻1/L) 。 ;IL-2， 500-2400活性單位/毫升; bNGF， 50-1 ， 600納克/毫升；VEGF， 12. 5-100ng/ml ;EGF， 10-200納克/毫升；HGF， 25-200納 克/毫升。 細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞標(biāo)志的識別工作可以通過任何已知的方法來完成，其中包括 免疫標(biāo)記。下面所列的抗體可以單獨(dú)使用也可以混合使用MAC-1， CD14， CD34， CD40， CD45， CDla和CD83。免疫標(biāo)記的方法是本行業(yè)內(nèi)具備普通技能的人士所通常使用的方法。
熒光成像用于監(jiān)測或檢測細(xì)胞的方法是是本行業(yè)內(nèi)具備普通技能的人士所通常 使用的方法。例如，自動激發(fā)和發(fā)射裝置，多維成像裝置，和許多軟件可用于熒光成像。通 常熒光強(qiáng)度與細(xì)胞中蛋白或其他的分子的量成正比。
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本發(fā)明采用但不限于下面所列出的針對以下抗原的單克隆抗體IL-1， IL-3， IL-6， IL-IO， CD14， CD34， CD40分子，CD45， HLA-DR， CDla， CD83，血管性血友病的因子 (vWF)，角蛋白(Pan Ab_l)，細(xì)胞角蛋白7，微管相關(guān)蛋白IB，白介素_12p70，腫瘤壞死因 子-1 (TNF-a)，腫瘤壞死因子-受體1。此外，IgG15， IgG2A， IgG2B，神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (NSE)，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)VEGF R2也在本發(fā)明中使用。
經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆只T導(dǎo)，單核細(xì)胞型干細(xì)胞有能力分化成多種細(xì)胞類型。例如，將 200納克/毫升bNGF加入單核細(xì)胞型干細(xì)胞培養(yǎng)后，在適當(dāng)?shù)纳L條件下，單核細(xì)胞型干細(xì) 胞分化成神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的因子可能包括，但不僅限于，神經(jīng)生長因子，腦 源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長因子，色素上皮細(xì)胞衍生因子，或維甲酸。
又例如，將50納克/毫升血管內(nèi)皮生長因子加入單核細(xì)胞型干細(xì)胞培養(yǎng)后，在適 當(dāng)?shù)纳L條件下，單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的因 子可能包括，但不僅限于胰島素樣生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
又例如，將100納克/毫升上皮細(xì)胞表皮生長因子加入單核細(xì)胞型干細(xì)胞培養(yǎng)后， 在適當(dāng)?shù)纳L條件下，單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化成上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的因子可 能包括，但不僅限于高濃度鈣離子，視黃酸，酸鈉，維生素C， PMA，干擾素Y 。
又例如，將1納克/毫升LPS和1200活性單位/毫升IL-2加入單核細(xì)胞型干細(xì) 胞培養(yǎng)后，在適當(dāng)?shù)纳L條件下，單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。上皮細(xì) 胞的誘導(dǎo)分化的因子可能包括，但不僅限于IL-4和IL-12和IL-18，CDS抗體，PMA，干擾素 Y 。 又例如，將50納克/毫升肝細(xì)胞生長因子加入單核細(xì)胞型干細(xì)胞培養(yǎng)后，在適當(dāng) 的生長條件下5-7天，單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞。肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的因子可能包 括，但不僅限于視黃酸，苯巴比妥，二甲基亞砜，地塞米松，地塞米松和丁酰環(huán)磷酸腺苷。
本發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞除了其他用途外，還可以用來補(bǔ)充因?yàn)榧膊∫鸬募?xì) 胞減少的癥狀(例如癌癥治療)，或者更換損壞的組織。舉例來說，帕金森癥引起的神經(jīng)組 織中破壞；手術(shù)切口引起的內(nèi)皮細(xì)胞受損；高雪氏病引起的巨噬細(xì)胞受損；皮膚燒傷引起 的上皮細(xì)胞受損；萊姆病引起的T淋巴細(xì)胞減少；肝硬化引起的肝細(xì)胞受損。此外，患先天 遺傳疾病的人可以移植經(jīng)過基因重組技術(shù)修正后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞。具備的增殖能力單 核細(xì)胞型干細(xì)胞能夠提供數(shù)量充足的干細(xì)胞用于移植。這比目前所采用的干細(xì)胞移植程序 更加有效。
有益效果本發(fā)明使用的原料來源廣泛，使用效果好，以及在治療過程中更安全、 可靠。而且能夠進(jìn)行自體移植。
說明書附圖

圖1人單核細(xì)胞體外分化線性圖顯示單核細(xì)胞在M-CSF， LIF， IL_6經(jīng)過5天的培 養(yǎng)分化成為單核細(xì)胞型干細(xì)胞；A，未分化的單核細(xì)胞；B，分化后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞。
圖2單核細(xì)胞型干細(xì)胞擴(kuò)增圖顯示單核細(xì)胞型干細(xì)胞在M-CSF， LIF， IL_6的作用 下呈現(xiàn)性增長；對照組中未經(jīng)細(xì)胞因子作用的單核細(xì)胞數(shù)量沒有變化。
圖3HLA-DR染色圖顯示脂多糖處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞；
A， HLA-DR抗體陰性對照；B， HLA-DR抗體染色。 圖4脂多糖處理后單核細(xì)胞型干細(xì)胞HLA-DR， HLA-DQ， IL_10， TNF- a染色圖顯示脂多糖(LPS)處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。 圖5單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化的NK和T細(xì)胞對K562血液腫瘤細(xì)胞殺傷作用圖；對 照組中的細(xì)胞未經(jīng)分化；單核細(xì)胞型干細(xì)胞在IL-2， IL-2和IL-15的分化作用下培養(yǎng)4天 后，與K562血液腫瘤細(xì)胞按照5 : 1的比例共同培養(yǎng)6小時(shí)。 圖6Cadherin和Keratins染色圖顯示表皮生長因子處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞 分化為上皮細(xì)胞；A， Cadherin染色，B， Keratins染色，C， Cadherin染色，和Keratins染色 重疊效果圖，D，表皮生長因子處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞的Cadherin和Keratins染色圖； 對照組未經(jīng)表皮生長因子處理。 圖7神經(jīng)絲蛋白染色圖顯示神經(jīng)細(xì)胞生長因子處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞分化 為神經(jīng)細(xì)胞；神經(jīng)細(xì)胞生長因子處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞呈現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞的形狀，神經(jīng) 絲蛋白染色進(jìn)一步確認(rèn)分化的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施作具體說明 實(shí)施例1從外周血中分離和培養(yǎng)單核細(xì)胞型干細(xì)胞。 抽取200毫升外周血，用RPMI 1640稀釋同等體積，加入Ficoll-Hypaque，然后用 貝克曼離心機(jī)離心(550g)30分鐘，4t:。收獲的白細(xì)胞層用RPMI 1640洗滌2_3次。這些 細(xì)胞可以立即保存在液氮中，也可以進(jìn)行培養(yǎng)分離單核細(xì)胞。按照2百萬個(gè)細(xì)胞/毫升的 濃度加入培養(yǎng)液稀釋后，把細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)8-12小時(shí)(37°C，8% C02)，去掉浮動細(xì) 胞，RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗5次。加入5-10毫升含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，強(qiáng)力 吹洗附著在培養(yǎng)皿上的細(xì)胞，得到90-95%純的單核細(xì)胞。用抗體結(jié)合磁珠法可以進(jìn)一步得 到99%純的單核細(xì)胞。單核細(xì)胞加入50納克/毫升的M-CSF， 1000活性單位/毫升LIF， 20納克/毫升的IL-6經(jīng)過5天的培養(yǎng)，50%左右的細(xì)胞呈現(xiàn)出拉長的細(xì)胞形態(tài)，類似于纖 維細(xì)胞，這些逆向分化的單核細(xì)胞被稱為單核細(xì)胞型干細(xì)胞(圖1)。 在這個(gè)例子中，單核細(xì)胞型干細(xì)胞的特征是對胰蛋白酶和/或EDTA或中性蛋白酶 的消化作用有很強(qiáng)的耐受性。胰蛋白酶和/或EDTA，或中性蛋白酶處理60分鐘也不能將 單核細(xì)胞型干細(xì)胞從培養(yǎng)皿的表面剝離。因此，為了獲得培養(yǎng)的單核細(xì)胞型干細(xì)胞，在加入 利多卡因5-8分鐘后，需要用移液管強(qiáng)力吹洗。本行業(yè)內(nèi)具有普通技能的人士能夠認(rèn)識到 M-CSF， LIF和IL-6可以在不同的生長條件被用來擴(kuò)增單核細(xì)胞型干細(xì)胞(圖2)，另外，雖 然本發(fā)明所披露的特征足以區(qū)別單核細(xì)胞型干細(xì)胞于其他類型的細(xì)胞，本發(fā)明預(yù)計(jì)還會有 更多的單核細(xì)胞型干細(xì)胞特征會被未來的工作所發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例2巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的分化 為了證實(shí)單核細(xì)胞型干細(xì)胞具備分化為T淋巴細(xì)胞的能力，經(jīng)過50納克/毫升的 M-CSF， 1000活性單位/毫升LIF， 20納克/毫升的IL-6處理14天的單核細(xì)胞加入5納克/ 毫升的脂多糖(巨噬細(xì)胞激活因子)處理兩天。經(jīng)過這樣處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞被轉(zhuǎn) 化為巨噬細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)變通過以下的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，形態(tài)特征，HLA-DR，HLA-DQ的增加，IL-IO 和TNF-a的免疫染色(圖3，圖4)。 為了證實(shí)單核細(xì)胞型干細(xì)胞具備分化為T淋巴細(xì)胞的能力，經(jīng)過50納克/毫升的 M-CSF， 1000活性單位/毫升LIF， 20納克/毫升的IL-6處理14天的單核細(xì)胞加入1200活性單位/ml的IL-2 (T淋巴細(xì)胞激活因子)培養(yǎng)4天。經(jīng)過這樣處理后的單核細(xì)胞型干細(xì) 胞被轉(zhuǎn)化為T淋巴細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)變通過以下的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。94X的干細(xì)胞表達(dá)CD3，在表達(dá) CD3的細(xì)胞中有70X的細(xì)胞表達(dá)CD8。 IL_2誘導(dǎo)的細(xì)胞獲得了殺死靶細(xì)胞能力。具備細(xì)胞 毒性是功能性T淋巴細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)記。按照5 : 1的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例，IL-2 的誘導(dǎo)產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞裂解40±7%，而對照組中只有5±3%的耙細(xì)胞被裂解(圖5)。
為了證實(shí)單核細(xì)胞型干細(xì)胞具備分化為NK細(xì)胞的能力，經(jīng)過50納克/毫升的 M-CSF， 1000活性單位/毫升LIF， 20納克/毫升的IL-6處理14天的單核細(xì)胞加入1200活 性單位/ml的IL-2和20納克/毫升的IL-15 (NK細(xì)胞激活因子)培養(yǎng)4天。經(jīng)過這樣處 理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為NK細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)變通過以下的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。82%的干 細(xì)胞表達(dá)CD56，在表達(dá)CD3的細(xì)胞中有70X的細(xì)胞表達(dá)CD16。 IL-2和IL-15誘導(dǎo)的細(xì)胞 獲得了殺死靶細(xì)胞能力。具備細(xì)胞毒性是NK細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)記。按照5 : l的效應(yīng)細(xì) 胞與靶細(xì)胞的比例，IL-2的誘導(dǎo)產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞裂解60±7%，而對照組中只有10±3%的 靶細(xì)胞被裂解(圖5)。
實(shí)施例3上皮細(xì)胞分化 為了證實(shí)單核細(xì)胞型干細(xì)胞具備分化為上皮細(xì)胞的能力，經(jīng)過50納克/毫升的 M-CSF， 1000活性單位/毫升LIF， 20納克/毫升的IL-6處理14天的單核細(xì)胞加入100納 克/毫升表皮生長因子(EGF)，培養(yǎng)4天。經(jīng)過這樣處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞75%顯示 一個(gè)上皮細(xì)胞形態(tài)，71士4X的細(xì)胞在免疫染色后顯示，68士5X的細(xì)胞顯示E-cadherin陽 性，這兩種蛋白都是上皮細(xì)胞標(biāo)記性蛋白。對照組只有4±1% pan-keratins陽性，3±2% E-cadherin陽性(圖6)。因此，本發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化成非血細(xì)胞的 其他類型細(xì)胞。本行業(yè)中具備普通技能的人士利用已知的常規(guī)技術(shù)能夠確定合適的誘導(dǎo)分 化劑量。 實(shí)施例4神經(jīng)細(xì)胞分化 為了證實(shí)單核細(xì)胞型干細(xì)胞具備分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力，經(jīng)過50納克/毫升的 M-CSF， 1000活性單位/毫升LIF， 20納克/毫升的IL-6處理14天的單核細(xì)胞加入200納 克/，毫升bNGF(神經(jīng)細(xì)胞生長因子)培養(yǎng)4天。經(jīng)過這樣處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞90% 顯示出神經(jīng)元形態(tài)，這些細(xì)胞有一個(gè)更小的細(xì)胞體和顯示出軸狀突起。5-8天之后，其中一 些極長的軸狀突起形成細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，并建立了一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。這些成熟的神經(jīng)細(xì)胞 免疫特征為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，神經(jīng)絲蛋白(NF)和微管相關(guān)蛋白-IB染色呈陽 性，這些蛋白是眾所周知的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記(圖7)。對照組很少或幾乎沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞分 化。本發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞能夠被其他的誘導(dǎo)因子分化成神經(jīng)細(xì)胞。本行業(yè)中具備普 通技能的人士利用已知的常規(guī)技術(shù)能夠確定合適的誘導(dǎo)分化劑量。
實(shí)施例5內(nèi)皮細(xì)胞分化 為了證實(shí)單核細(xì)胞型干細(xì)胞具備分化為內(nèi)皮細(xì)胞的能力，經(jīng)過50納克/毫升的 M-CSF， 1000活性單位/毫升LIF，20納克/毫升的IL-6處理14天的單核細(xì)胞加入50納 克/毫升血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)培養(yǎng)4天。經(jīng)過這樣處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞90% 顯示出內(nèi)皮細(xì)胞排列形態(tài)。這些成熟的神經(jīng)細(xì)胞免疫特征為VEGF-R2， VEGF-R3和von Willebrand' sFactor(vWF)染色呈陽性，這些蛋白是眾所周知的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記。對照組很 少或幾乎沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞分化。本發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞能夠被其他的誘導(dǎo)因子分化
9成內(nèi)皮細(xì)胞。本行業(yè)中具備普通技能的人士利用已知的常規(guī)技術(shù)能夠確定合適的誘導(dǎo)分化 劑量。 實(shí)施例6肝細(xì)胞分化 為了證實(shí)單核細(xì)胞型干細(xì)胞具備分化為肝細(xì)胞的能力，經(jīng)過50納克/毫升的 M-CSF， 1000活性單位/毫升LIF， 20納克/毫升的IL-6處理14天的單核細(xì)胞加入100納克 /毫升重組人肝細(xì)胞生長因子(HGF)培養(yǎng)4天。經(jīng)過這樣處理后的單核細(xì)胞型干細(xì)胞81% 顯示出圓形或橢圓形扁平形態(tài)。75±7%的細(xì)胞albumin染色呈陽性，35±4%的細(xì)胞染色 cytokeratin 7呈陽性，這些蛋白是眾所周知的肝細(xì)胞標(biāo)記。對照組只有8±5%和3±5% 的細(xì)胞albumin和cytokeratin 7染色呈陽性。本發(fā)明的單核細(xì)胞型干細(xì)胞能夠被其他的 誘導(dǎo)因子分化成肝細(xì)胞。本行業(yè)中具備普通技能的人士利用已知的常規(guī)技術(shù)能夠確定合適 的誘導(dǎo)分化劑量。
權(quán)利要求
制備單核細(xì)胞型干細(xì)胞的方法，其特征在于包括下述步驟a)從人的血液中分離單核細(xì)胞；b)在含有細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和擴(kuò)增單核細(xì)胞，其中的生長因子為M-CSF、LIF或IL-6中的一種或幾種，或在上述生長因子中加入緩沖劑，或具備M-CSF，IL-6或LIF功能的蛋白質(zhì)片斷的生長因子；c)從培養(yǎng)基中分離得到單核細(xì)胞型干細(xì)胞，單核細(xì)胞型干細(xì)胞至少表達(dá)下面各種細(xì)胞表面抗原的一種MAC-1、CD14、CD34、CD40或CD45；或者至少能夠生產(chǎn)一種細(xì)胞因子IL-13、IL-6或IL-12p70；或者顯示出吞噬活性；或者顯示淋巴細(xì)胞活化活性；或者顯示對胰蛋白酶，乙二胺四乙酸的耐受性；或者顯示對利多卡因的敏感性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為MDM、 RPMI或DMEM。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述生長因子為25-200納克/毫升的M-CSF、10-50納克/毫升的IL-6、或100-2000活性單位/毫升的LIF中的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于所述生長因子為50納克/毫升的M-CSF、20納克/毫升的IL-6或1000活性單位/毫升的LIF中的一種或幾種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于所述生長因子中分化誘導(dǎo)的化合物為、佛波13-脂、干細(xì)胞生長因子、重組人白細(xì)胞介素_2、白介素_3、表皮生長因子、13 -神經(jīng)生長因子、重組人血管內(nèi)皮生長因子異構(gòu)體、或肝細(xì)胞生長因子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于所述生長因子中分化誘導(dǎo)的化合物脂多糖的濃度為0. 5-1. 0納克/毫升，佛波13-脂的濃度為1-160納摩/升，重組人白細(xì)胞介素_2的濃度為500-2400活性單位/毫升，表皮生長因子的濃度為10-200納克/毫升，肝細(xì)胞生長因子的濃度為25-200納克/毫升，重組人血管內(nèi)皮生長因子異構(gòu)體的濃度為12. 5-100納克/毫升。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的單核細(xì)胞型干細(xì)胞顯示出吞噬活性和不表達(dá)CDla和CD83的細(xì)胞。
8. 單核細(xì)胞型干細(xì)胞在制藥中的應(yīng)用，其特征在于，用于制備巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞。
9. 根據(jù)根據(jù)權(quán)利8所述的單核細(xì)胞型干細(xì)胞在制藥中的應(yīng)用，其特征在于單核細(xì)胞型的干細(xì)胞在制備治療下列疾病的藥物組合物中的用途阿爾茨海默氏癥，帕金森氏癥，老年癡呆癥，多發(fā)性硬化癥，與年齡有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)混亂，腦損傷，囊腫，自體免疫疾病，細(xì)菌感染，膿腫，病毒感染，腦腫瘤，癲癇，神經(jīng)創(chuàng)傷，手術(shù)切口 ，糖尿病潰瘍，血友病潰瘍，靜脈曲張潰瘍，固體血管源性腫瘤，白血病，血管瘤，聽神經(jīng)瘤，神經(jīng)纖維瘤，沙眼，化膿性肉芽腫，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜黃斑變性，角膜移植排斥反應(yīng)，新生血管性青光眼，晶狀體后纖維組織增生，虹彩，毛細(xì)血管，韋伯綜合癥，心肌血管盲目性新生，新生血管，毛細(xì)血管擴(kuò)張，血友病，血管纖維瘤，肉芽，上皮細(xì)胞新增生，克羅恩病，化學(xué)、熱、感染或自身免疫引起的腸道損傷，化學(xué)品、熱、感染或自身免疫引起的皮膚損傷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，艾滋病，關(guān)節(jié)炎，胰島素依賴型糖尿病，器官特異性自身免疫性疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腸炎病，橋本甲狀腺炎，甲亢病，接觸性皮炎，牛皮癬，排斥反應(yīng)，移植物抗宿主疾病，結(jié)節(jié)病，胃腸道過敏，嗜酸細(xì)胞增多，結(jié)膜炎，腎小球腎炎，驅(qū)蟲感染，瘤型麻風(fēng)病，糖尿病，高雪氏病，尼曼匹克癥，寄生感染，癌癥的免疫系統(tǒng)紊亂，化工、物理、感染、或自身免疫引起的肝癌、肝損害、癌癥。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種細(xì)胞分離，培養(yǎng)，擴(kuò)增的方法及應(yīng)用，具體是指單核細(xì)胞型干細(xì)胞的制備方法及在制備藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過從人的血液中分離單核細(xì)胞，在含有細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和擴(kuò)增單核細(xì)胞，從培養(yǎng)基中分離得到單核細(xì)胞型干細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是使用的原料來源廣泛，使用效果好，以及在治療過程中更安全、可靠。而且能夠進(jìn)行自體移植。本發(fā)明對醫(yī)療的發(fā)展、疾病的治療具有廣泛的用途。
文檔編號C12N5/0789GK101760446SQ20091015591
公開日2010年6月30日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者吳忠福, 徐以兵, 董升炬 申請人:浙江中贏控股集團(tuán)有限公司