專利名稱：抗fgf23抗體和含有該抗體的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可以與FGF23抗原特異性結合的抗FGF23抗體。而且， 本發(fā)明還涉及一種可用于預防或治療FGF23過量引起的或其他原因引起的 礦物質代謝紊亂的藥物，其包含抗FGF23抗體作為活性成分。尤其是，本 發(fā)明涉及一種用于治療低血磷癥性詢僂病(hypophosphatemic ricket)和軟骨 病(osteomalachia)的藥物。
背景技術：
作為一種可以刺激成纖維細胞系NIH3T3細胞增長的物質，成纖維細胞 生長因子首次分離純化自牛垂體。然后，從不同組織中分離出多種類似的蛋 白質，這些蛋白質產(chǎn)物組成了一個多肽家族(FGF家族)。到目前為止，在 脊推動物中，得到分離純化的FGF家族成員已有22種蛋白質。關于這些蛋 白質的生物學活性，目前已知，其不僅具有成纖維細胞生長活性，還具有多 種其它不同功能如中胚層和神經(jīng)外胚層生長活性，血管生成活性，特定發(fā)育 階段肢芽形成活性等。FGF的基因表達也具有位置和時間差異性。它通常僅 僅表達于特定發(fā)育階段或成人的某些位點。目前已知，至少有四個編碼FGF 受體的基因，F(xiàn)GFR1,FGFR2， FGFR3，和FGFR4。另夕卜，關于FGFR1, FGFR2， FGFR3,已知的是，對于每一種受體，由于不同的剪切方式，產(chǎn)生的受體蛋 白具有不同的胞外結構域。另外，目前已知，肝素和疏酸乙酰肝素蛋白聚糖 通過與FGF和FGF受體的相互作用而控制其活性。另外，還有很多雖因具 有與FGF相似的結構，而屬于FGF家族，但其生物學活性和受體結合特性 等幾乎不明。有一篇綜述(詳情請看文獻Ornitz, D.等，Genome biology, 2: 3005.1-3005.12， 2001)總結了這些FGF家族成員的特性。
FGF23 ( —般來講，有時候也被記作FGF-23 )的首次克隆是利用FGF15 同源性的數(shù)據(jù)庫搜索和PCR方法自小鼠獲得的。隨后，利用小鼠FGF23同 源序列，人FGF23也得到克隆。人FGF23是一條由251個氨基酸殘基組成 的多肽。另外，預計，作為分泌信號序列，在蛋白質分泌時，多肽N-末端由多達24個氨基酸組成的氨基酸序列被剪切(詳情請看文獻Yamashita, T 等，Biochem.Biophy. Res. Commun.， 277: 494-498, 2000)。然后，對常染色體 顯性型低血磷癥性詢僂病/軟骨病(以下稱作ADHR)的研究發(fā)現(xiàn)，ADHR 病人的基因突變區(qū)域變窄(narrow down)，隨著相關基因鑒定的進展，發(fā) 現(xiàn)ADHR病人的FGF23基因發(fā)生了 一個導致此現(xiàn)象的特有的錯義突變(詳情 請看文獻White, K.E.等，Nature Genet.， 26: 345-348， 2000)。這些發(fā)現(xiàn)強烈 表明，F(xiàn)GF23在體內(nèi)具有重要的生理學意義。另一方面，是什么在決定FGF23 的生物學活性，這通過低血磷癥性佝僂病和軟骨病的一種類型-腫瘤性軟骨 病(neoplastic osteomalacia)得到了研究。在這些疾病中，惡性腫瘤產(chǎn)生和 分泌一種液態(tài)疾病起始因子，正如所想的那樣，像低血磷癥性鉤僂病和軟骨 病等疾病是由此疾病起始因子導致的。
在對所述由惡性肺瘤產(chǎn)生的疾病起始因子的研究中，F(xiàn)GF23作為一種在 腫瘤中過量表達的基因被克隆。此外，通過給予這種因子，低血磷癥性佝僂 病/軟骨病被重現(xiàn)(詳情請看文獻Shimada， T.等，Proc. Natl. Acad. Sci., 98: 6500-6505, 2001 以及 International Publication Number WO02/14504 pamphlet)。基于以上研究表明，在體內(nèi)，F(xiàn)GF23表現(xiàn)出與磷和鈣元素相關的 的代謝控制有關的生物學功能。另外，由此表明，作為系統(tǒng)性因子，F(xiàn)GF23 通過體內(nèi)循環(huán)來實現(xiàn)自己功能。此外，最近的研究顯示與健康人相比，肺瘤 性軟骨病患者血管中FGF23濃度更高(詳情請看文獻Yamazaki, Y.等，J. Clin. Endocrinol. Metab.， 87: 4957-4960， 2002以及Jonsson， K. B.,等，N. Engl. J. Med" 348: 1656-1663, 2003)。
此外，已知X染色體-連鎖遺傳的低血磷癥性狗僂病(以下稱為XLH) 是一種在臨床上與ADHR和腫瘤性軟骨病患者具有相似表現(xiàn)的疾病?；加?這種疾病的患者血液中也含有高水平的FGF23 (詳情請看文獻Yamazaki, Y. 等，J. Clin. Endocrinol. Metab.， 87: 4957-4960， 2002以及Jonsson, K. B.，等,N. Engl. J. Med., 348: 1656-1663， 2003)。
換句話說，在腫瘤性軟骨病和XLH等疾病中發(fā)現(xiàn)的維生素D耐受性佝 僂病和軟骨病的病因先前并不清楚，但而今表明此分泌性致病因子正是 FGF23。此外，在關于其它類型的礦物質代謝性疾病如骨纖維性結構不良、 麥-奧二氏綜合征、常染色體隱性低血磷癥性詢僂病等疾病的研究中，也有 過有關血液中高濃度的FGF23與4氐血石辨癥(hypophosphatemia)、佝4婁病和軟骨病的相關性報道(詳情請看文獻Riminucci, M.等，J. Clin. Invest., 112: 683-692， 2003; Yamamoto, T.等，J. Bone Miner. Metab" 23: 231-237， 2005; Lorenz-Depiereux， B.等，Nat. Genet.， 38: 1248-1250， 2006)。
以上報道表明，體內(nèi)過量表達FGF23會導致低血磷癥、低血磷癥伴隨 性佝僂病和軟骨病等疾病。此外，有報道表明，慢性腎功能不全性高血磷癥 患者的血清中出現(xiàn)反常高水平FGF23。有證據(jù)證明FGF23的過量表達可能 與慢性腎功能不全時發(fā)生的部分礦物質代謝疾病有關(詳情請看文獻Gupta, A.等，J. Clin. Endocrinol. Metab.， 89: 4489-4492, 2004, Larsson, T.等，Kidney Int., 64: 2272-2279， 2003)。
由于引起這些疾病的原因是FGF23的過量表達，那么抑制FGF23的活 性或消除FGF23就可能成為治療這些疾病的辦法。到目前為止，已見有抗 -FGF23小鼠單克隆抗體用于抑制FGF23活性的研究報道(詳情請看文獻 Yamashita, T.等，Biochem. Biophy. Res. Commun.， 277: 494-498， 2000)。在這 篇報道中，當將抗-FGF23鼠單克隆抗體2C3B和3C1E給予正常小鼠時， 小鼠內(nèi)源性FGF23功能被抑制，通過腎完成的磷排泄也被抑制。通過干擾 腎中維生素D代謝酶的表達，干擾結果表明血清中磷和la， 25-二羥維生素 D (以下記作1，25D)的濃度升高。此外，將抗-FGF23鼠單克隆抗體重復給 予Hyp小鼠，所述Hyp小鼠是一種具有高水平FGF23血清，低血磷癥， 骨延長機能障礙和鉀化機能障礙的XLH疾病的模型小鼠，其結果，可以看 到小鼠血液中磷濃度升高，而且，骨延長機能障礙和鈣化機能障礙癥狀得到 改善。通過這些結果可以看到，F(xiàn)GF23活性抑制性抗體作為一種用于FGF23 過量表達型疾病的治療藥物是可行的。然而，在文獻報道中所用到的2C3B 和3C1E抗體是鼠源抗體。鼠源抗體會被人宿主當做異物從而導致人宿主產(chǎn) 生一種所謂的"人抗鼠抗體"(也即是HAMA)反應，這可能會導致嚴重的副 作用(詳情請看文獻Van Kroonenbergh， M. J.等，Nucl. Med. Commun.9: 919-930， 1988)。
為避免產(chǎn)生這種問題， 一種解決方法是研制嵌合型抗體(詳情請看歐洲 專利申請公告號120694說明書和歐洲專利申請公告號125023說明書)。
和人源抗體恒定區(qū)等)。這種類型的嵌合型抗體的優(yōu)勢是原鼠源抗體的對抗 原的結合特性得到保留。但是，另一方面，嵌合型抗體仍然會誘導人宿主產(chǎn)生"人抗嵌合型抗體，，(也即是"HACA")反應(詳情請看文獻Bruggemann， M. 等，J. Exp. Med.， 170: 2153-2157， 1989)。
此外，已經(jīng)有重組型抗體被研制出來，其中，只有取代型抗體的一部分 是互補決定區(qū)(complementarity determining region ， CDR)(詳情請看英國專 利號GB2188638 A專利說明書和美國專利號5585089專利說明書)。應用 CDR移植技術，制成一種由鼠CDR、人可變構架區(qū)和恒定區(qū)組成的抗體(也 即是人源化抗體)(詳情請看文獻Riechmann, L.等，Nature, 332: 323-327, 1988)。目前已經(jīng)知道，使用上述方法，抗-FGF23鼠源抗體(如2C3B抗體 等)可通過人抗體序列取代鼠源抗體而被人源化。然而，在發(fā)生人源化時， 有可能導致對抗原的親和性降低。
另外，目前對由XLH等類似疾病引起的低血癥性佝僂病的主要治療方 法是定期口服給藥維生素D制劑和磷酸。但是，這種治療手段會導致一個 問題，也即是這會導致患者及其家庭要承受由每天用藥次數(shù)和劑量決定的相 當大的負擔。因此，為減輕患者及其家庭承受的這種負擔，需要對血清磷酸 鹽濃度和血清1，25D濃度有長時間持續(xù)性增長作用的(sustained raising action)低血磷癥治療性藥物，從而延長給藥之間的間隔時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人抗FGF23抗體及其藥物組合物，所述藥物組合 物例如用于預防或治療等作用并且?guī)缀鯖]有副作用的藥物，其通過利用所述 抗體抑制FGF23作用并由此預防和治療疾病。
此外，本發(fā)明的目的是提供一種抗體，所述抗體是能用作低血磷癥治療 藥物的抗-FGF23抗體，與現(xiàn)有的抗-FGF23抗體相比，它僅使用單一劑量即 可產(chǎn)生對血清磷酸鹽(phosphate)濃度和血清1，25D濃度的更長時間的持續(xù)增 長作用。本發(fā)明的另一個目的是提供一種藥物組合物，例如使用所述抗體用 于預防和治療FGF23相關性疾病的藥物。
目前，低血磷癥性佝僂病的主流治療手段是每天數(shù)次定期口服維生素E 和磷酸鹽的給藥方式。然而，每天數(shù)次的大劑量口服藥物，產(chǎn)生一個問題， 也即病人被迫承受一個大的負擔。本發(fā)明荻得的抗-FGF23人單克隆抗體， C10抗體，被證實具有對血清磷酸鹽濃度和血清1,25D濃度的更長時間持續(xù) 增長作用。這些表明，與目前已有的低血磷癥治療性藥物相比，C10抗體可望在治療上具有明顯的優(yōu)越性。
本發(fā)明如下 一種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有雜交瘤細胞 CIO(索取號FERMBP-10772)產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。 —種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有SEQ ID NO: 12 的從第20位Q到第136位S的氨基酸序列所示的重鏈氨基酸序列和/或SEQ ID NO:14的從第23位A到第128位K的氨基酸序列所示的輕鏈氨基酸序 列。 —種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其中，所述抗人FGF23 抗體或此抗體的功能性片段含有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 且此重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:12的從第20位Q到第136位S 的氨基酸序列所示，此輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:14的從第23 位A到第128位K的氨基酸序列所示。由雜交瘤細胞C10 (索取號FERM BP-10772)產(chǎn)生的抗人FGF23 抗體或此抗體的功能性片段。 —種抗體或此抗體的功能性片段，其結合于人FGF23上的全部或部 分表位，所述人FGF23上的全部或部分表位結合由雜交瘤細胞C10 (索取 號FERMBP-10772)產(chǎn)生的抗體。 —種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有在上述[3]中 所述的重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)具有任何一個或所有以下互補決定區(qū) (CDR):由SEQIDNO:40的氨基酸序列所示的互補決定區(qū)(CDR) 1，由 SEQIDNO:41的氨基酸序列所示的CDR2,以及由SEQIDNO:42的氨基酸 序列所示的CDR3。 —種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有在上述[3]中 所述的輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)具有任何一個或所有以下互補決定區(qū) (CDR):由SEQIDNO:43的氨基酸序列所示的互補決定區(qū)(CDR) 1,由 SEQ ID NO:44的氨基酸序列所示的CDR2，以及由SEQ ID NO:45的氨基酸 序列所示的CDR3。 —種抗人FGF23抗體或該抗體的功能性片段，所述抗人FGF23抗 體或該抗體的功能性片段含有重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)具有任何一個或所 有以下互補決定區(qū)(CDR):由SEQIDNO:40的氨基酸序列所示的互補決定區(qū)(CDR)l，由SEQIDNO:41的氨基酸序列所示的CDR2,以及由SEQ ID NO:42的氨基酸序列所示的CDR3;所述抗人FGF23抗體或該抗體的功 能性片段還含有輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)具有任何一個或所有以下互^^卜決 定區(qū)(CDR):由SEQIDNO:43的氨基酸序列所示的互補決定區(qū)(CDR ) 1, 由SEQIDNO:44的氨基酸序列所示的CDR2,以及由SEQIDNO:45的氨 基酸序列所示的CDR3。[9]如[1]-[8]中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段， 其中所述功能性片段是選自Fab、 Fab'、 F (ab')2、 二硫鍵穩(wěn)定的Fv (dsFv)、 二聚化的V區(qū)域(雙體)、單鏈Fv (scFv)和CDR的肽段。[10〗如[1]-[8]中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段， 其包含重鏈和/或輕鏈，所述重鏈和/或輕鏈具有的氨基酸序列中一個或幾個 氨基酸殘基被缺失、取代或添加。[11]如[1]-[10]中任何一項所述抗人FGF23抗體，其中，所述抗體的種 類是IgG、 IgA、 IgE或IgM。[12]如[ll]所述抗人FGF23抗體，其中，所述抗體的亞類是IgGl、 IgG2、 IgG3、或IgG4。[13] —種藥物組合物，其含有如[1]-[12]中任何一項所述抗人FGF23抗 體或此抗體的功能性片段作為活性成分。[14] 一種藥物組合物，其可通過FGF23控制磷代謝和/或維生素D4戈謝 并含有如[1]-[12]中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片4殳作 為活性成分。[15] —種用于礦物質代謝紊亂相關性疾病的預防或治療的藥物組合物， 其含有如[1]-[12]中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片^:作 為活性成分。[16]如[15]所迷藥物組合物，其中，所述礦物質代謝紊亂相關性疾病選 自腫瘤性軟骨病、ADHR、 XLH、骨纖維性結構不良、麥-奧二氏綜合征和常 染色體隱性低血磷癥。[17] —種藥物組合物，其用于預防或治療選自骨質疏松癥、佝僂病、 高鈣血癥、低鈣血癥、異位鈣化癥、骨硬化、派杰病、曱狀旁腺機能亢進癥、 曱狀旁腺機能減退癥和搔癢癥的疾病，此藥物組合物含有如[1]-[12]中任何 一項所述的抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段作為活性成分，[18〗雜交瘤細胞CIO (索取號FERM BP-10772)。[19] 一種編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列的核酸，其中，此重鏈可變區(qū)氨 基酸序列由SEQ ID NO:ll所示從第58位C到第408位A的義威基序列編碼。[20] —種編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的核酸，其中，此輕鏈可變區(qū)氨 基酸序列由SEQ IDNO:13所示從第67位G到第384位A的堿基序列編碼。[21] —種載體，其含有如[19]或[20]中所述核酸。[22] —種宿主細胞，其含有如[21]中所述載體。[23] —種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段的制造方法，包^^步 :段。 、 ' 、 -、 、 -附圖簡要說明

圖1為C10表達載體構建過程示意2顯示的是N5KG1—C10—LH中抗體重鏈基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:30)和氨基酸序列(SEQIDNO:31)。圖中矩形框標記的氨基酸序列為分泌 信號序列(前導序列)。圖3顯示的是N5KG1—C10—LH中抗體輕鏈基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)和氨基酸序列(SEQ IDNO:33)。圖中矩形框標記的氨基酸序列為分泌 信號序列(前導序列)。圖4顯示的是C10表達載體的結構。圖5A顯示的是用夾心酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)對純化得到的全長人 FGF23蛋白進行檢測所得到的測定結果，其中利用2C3B抗體或C10抗體作 為固定抗體，3C1E抗體為沖企測抗體。圖5B顯示的是用夾心酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)對表達FGF23的獼猴 (cynomolgus monkey)細胞培養(yǎng)物上清液檢測后所得到的測定結果，其中 利用2C3B抗體或C10抗體作為固定抗體，3C1E抗體為檢測抗體。圖6中圖表所顯示的是對獼猴作2C3B抗體或C10抗體給藥時，隨時間 推移在不同時間點獼猴血清磷濃度的檢測結果。測定值以平均值+/-標準誤差 表示。此外，用斯氏T檢驗法(Student-test)檢驗其與溶劑給藥組的顯著差 異，對有顯著差異(p0.05)的測定值在圖表中標上*號。圖7中圖表所示為以對獼猴溶劑給藥5天后，獼猴血清磷濃度為基準，對獼猴作可溶性2C3B抗體或C10抗體給藥5天后，獼猴血清磷濃度的升高。圖8中圖表所示為對獼猴作溶劑、2C3B抗體或C10抗體給藥時，隨 時間推移在不同時間點獼猴血清1,25D濃度的檢測結果。測定值以平均值+A 標準誤差表示。此外，用斯氏T檢驗法在同一天進行測試組與溶劑給藥組之 間的顯著性差異測試時，對有顯著差異^<0.05)的測定值在圖表中標上*號。圖9中圖片顯示的是用C15抗體和蛋白質雜交(Western blotting )技術， 檢測非強制性表達的細胞培養(yǎng)物上清液(作為對照)、表達FGF23的人細 胞培養(yǎng)物上清液和表達FGF23的獼猴細胞培養(yǎng)物上清液。圖10顯示的是pPSsFGF23載體的結構。圖11顯示的是pUSFGF23KI載體的結構。圖12所示為3種等位基因結構 一種等位基因結構為其中的藥物抗性 基因(loxp-peo，被定向， 一種等位基因結構為其中的人FGF23 (-SP) +藥 物抗性基因(loxp-pecO通過pUS hFGF23 KI載體被定向， 一種等位基因結 構為其中的藥物抗性基因Uoxp-pec/、 loxpv-puro")被敲除，以及DNA印跡 分析用探針的位置。對圖中出現(xiàn)的專有名詞的詳細解釋如下hFGF23(-SP》缺少特定的信號肽編碼區(qū)的人FGF23基因。CK:小鼠Ig, 基因恒定區(qū)。loxpv-puro:其兩端帶有l(wèi)oxpv序列的嘌呤霉素抗性基因，所 述loxpv序列是具有部分突變的loxp序列。loxp-neo"":其兩端帶有l(wèi)oxp序列的新霉素磷酸轉移酶抗性基因。Ck3'探針DNA印跡(Southern blotting )分析探針，用于篩選hFGF23 (-Sf + loxpv-puror基因的轉入和1oxpv-puro'基因的敲除克隆。3'KO-探針DNA 印跡分析探針，用于篩選1oxp-ne(/基因的轉入和敲除克隆。E: EcoRI限制酶切位點。圖13中圖表顯示的是對照抗體或C10抗體給藥處理前7天的血清 FGF23濃度的檢測結果。測定值以平均值+A標準誤差表示。此外，用斯氏1 檢驗法(Student's t-test)檢驗測試組與野生型小鼠組的顯著差異，對有顯著 差異(p0.001)的組在圖表中標上***號。圖14中圖表顯示的是對照抗體或C10抗體給藥處理前7天和對照抗偉 或C10抗體首次給藥處理3天后的血清磷酸鹽濃度檢測結果。測定值以平均 值+/-標準誤差表示。此外，用斯氏T檢驗法檢驗測試組與野生型小鼠組的 顯著差異，對有顯著差異(p0.001)的組在圖表中標上***號。另外， 一天中檢驗hFGF23KI型小鼠對照抗體給藥組與測試組之間的顯著差異時，對有顯 著差異(pO.OOl)的hFGF23KI型小鼠C10抗體給藥組在圖表中標上并# #號。圖15中圖表顯示的是第五次對照抗體或C10抗體給藥處理1天后血清 磷濃度檢測結果。測定值以平均值+A標準誤差表示。此外，用斯氏T^r驗 法檢驗測試組與野生型小鼠組的顯著差異，對有顯著差異(pO.OOl)的組在 圖表中標上***號。另外，檢驗hFGF23KI型小鼠對照抗體給藥組與測試組 之間的顯著差異時，對有顯著差異(pO.OOl)的hFGF23KI型小鼠C10抗體 給藥組在圖表中標上# # #號。圖16中圖表顯示的是第四次對照抗體或C10抗體給藥處理1天后動物 握力試驗檢測結果。測定值以平均值+A標準誤差表示。此外，用斯氏T檢 驗法檢驗測試組與野生型小鼠組的顯著差異，對有顯著差異(pO.OOl )的組 在圖表中標上***號。此外，檢驗hFGF23KI型小鼠對照抗體給藥組與測試 組之間的顯著差異時，對有顯著差異(pO.OOl)的hFGF23KI型小鼠C10抗 體給藥組在圖表中標上# # #號。圖17所示的是小鼠股骨組織染色圖像，所用的股骨來自于第五次對照 抗體或C10抗體給藥處理1天后的小鼠，其中使用的染色方法為 Villanueva-Goldner染色法。圖18中圖表顯示的是小鼠脛骨灰燼重量占脛骨干重的比值測定結果， 其中所用的股骨來自于第五次對照抗體或C10抗體給藥處理1天后的小鼠。 測定值以平均值+/-標準誤差表示。此外，用斯氏T 4企驗法4企驗測試組與野 生型小鼠組的顯著差異，對有顯著差異(pO.OOl)的組在圖表中標上***號。 另外，檢驗hFGF23KI型小鼠對照抗體給藥組與測試組之間的顯著差異時， 對有顯著差異(pO.OOl)的hFGF23KI型小鼠C10抗體給藥組在圖表中標上 # # #號。[序列表純文本]SEQIDNO: 1-3、 5-27、 30-33、 44-50 合成 優(yōu)選實施方式詳述下面，通過對本發(fā)明中所用到的專有名詞定義的闡述，對本發(fā)明作詳纟B說明。I、本發(fā)明中的抗體1.抗-FGF23抗體和它的功能性片段本發(fā)明所述抗體是抗-FGF23抗體，其是成纖維細胞生長因子(FGF) 家族的成員。在本發(fā)明中，抗FGF23抗體與FGF23或其部分相結合，對FGF23或其 部分具有反應活性，或識別FGF23或其部分?？笷GF23抗體也被稱為抗 -FGF23抗體。在本發(fā)明中，抗體是免疫球蛋白，其中，組成該免疫球蛋白 的重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)的所有結構區(qū)域均來 自于編碼此免疫球蛋白的基因。此抗體優(yōu)選單克隆抗體。在這里，F(xiàn)GF23的 部分表示SEQ ID N0:4所示的FGF 23全長氨基酸序列的一部分氨基酸序 列，且此部分是包括連續(xù)性氨基酸序列的FGF 23肽段。優(yōu)選此抗體含有 SEQ ID NO:12中從第20位Q到第136位S的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:14中從第23位A到第128位K的氨基酸序列。此抗體更優(yōu)選是由雜交 瘤細胞C10產(chǎn)生的抗體。SEQ ID NO:12是包含前導序列在內(nèi)的抗FGF 23 抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，SEQ ID NO:12中從第20位Q到第136 位S的氨基酸序列是此氨基酸序列被剪去前導序列后形成的成熟氨基酸序 列片段。另外，SEQIDNO:14是包含前導序列在內(nèi)的抗FGF23抗體的輕鏈 可變區(qū)的氨基酸序列，SEQ ID NO:14中從第23位A到第128位K的氨基 酸序列是此氨基酸序列被剪去前導序列后形成的成熟氨基酸序列片段。關于 抗體類型，免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白A (IgA)、免疫球蛋白E (IgE) 和免疫球蛋白M(IgM)均可被使用。優(yōu)選免疫球蛋白G(IgG)，進一步地， 對于免疫球蛋白G(IgG)的亞類，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4均可被使用，優(yōu) 選IgGl、 IgG2和IgG4。更優(yōu)選IgGl。本發(fā)明所述抗體也包括抗FGF23抗體，此抗體含有新型互補決定區(qū) (CDR)氨基酸序列。CDR存在于抗體可變區(qū)，這部分結構提供抗原識別特異性?？勺儏^(qū)的(framework region ， FR)。恒定區(qū)存在于重鏈和輕鏈的C-末端，且分別稱 為重鏈恒定區(qū)(CH)和輕鏈恒定區(qū)(CL)。出現(xiàn)在重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)是互補決定區(qū)1 (CDR1)、互補決定區(qū) 2 (CDR2)和互補決定區(qū)3 (CDR3)。在重鏈可變區(qū)的這3種互補決定區(qū)一起 被稱為重鏈互補決定區(qū)。同樣地，出現(xiàn)在輕鏈可變區(qū)的的3種互補決定區(qū)是 互補決定區(qū)1 (CDR1)、互補決定區(qū)2 (CDR2)和互補決定區(qū)3 ( CDR3)。在 輕鏈可變區(qū)中的這3種互補決定區(qū)一起被稱為輕鏈互補決定區(qū)。這些互補決 定區(qū)的序列可利用在美國公共衛(wèi)生和人類服務部(1991)的"具有免疫學重 要性的蛋白質序列"(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Depl Health and Human Services (1991))等中所描述的方法獲得。本發(fā)明所述抗體優(yōu)選具有SEQIDNO:40中所示的CDRl、 SEQ ID NO: 41中所示的CDR2和SEQ ID NO:42中所示的CDR3中的至少任意一種或 所有互補決定區(qū)作為抗體的重鏈互補決定區(qū)。另外，本發(fā)明所述抗體優(yōu)選具 有SEQ IDNO:43中所示的CDRl、 SEQ IDNO:44中所示的CDR2和SEQ ID NO:45中所示的CDR3中的至少任意一種或所有互補決定區(qū)作為抗體的 輕鏈互補決定區(qū)。本發(fā)明所述抗體優(yōu)選是與FGF23結合的抗體，并具有SEQ IDNO:40中所示的CDR1、 SEQ ID NO:41中所示的CDR2和SEQ ID NO:42 中所示的CDR3作為抗體的重鏈互補決定區(qū)，且具有SEQIDNO:43中所示 的CDR1、 SEQIDNO:44中所示的CDR2和SEQ ID NO:45中所示的CDR3 作為抗體的輕鏈互補決定區(qū)。本發(fā)明所述抗體的CDR序列沒有特別限制。然而，本發(fā)明所述抗體優(yōu) 選包含SEQ ID NO:40 -45所示的互補決定區(qū)序列中^f壬一種或多種互補決定 區(qū)，更優(yōu)選包含3種重鏈互補決定區(qū)，更進一步優(yōu)選包含所示6種互補決定 區(qū)。對互補決定區(qū)以外的其他氨基酸序列沒有特別限制。本發(fā)明所述抗體包 括所謂的CDR移植型抗體，其中，所述移植型抗體中互補決定區(qū)以外的氨 基酸序列來自于其它抗體，尤其是來源于其它物種的抗體。在這些CDR移 植型抗體中，優(yōu)選CDR以外的氨基酸序列來源于人的人源化抗體或人抗體。 才艮據(jù)需要，可以對FR進行一個或多個氨基酸殘基的添加、缺失、取代和, 或插入。用于制造人源化抗體或人抗體的方法可用公知的方法。"功能性片段"指抗體的部分(部分片段)，具有此抗體對抗原的一種或 多種活性(action)。換句話說，指保留了與抗原的結合能力、對抗原的反 應活性或者對抗原的識別能力的片段。例如，F(xiàn)v、 二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dsFv)、 單鏈Fv (scFv)、及其聚合物等。更具體的例子包括那些含有Fab、 Fab'、 F14(ab')2、 scFv、雙體(diabody) 、 dsFv和CDR的肽[D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.， 1998 T. J. International Ltd]。
利用木瓜蛋白酶處理與FGF23結合的抗體得到這些片段中，F(xiàn)ab片段為 具有與抗原結合活性，分子量約為50，000的抗體片段。Fab片段中單條重鏈 (H鏈)的氨基酸末端一側將近一半?yún)^(qū)段和單條完整輕鏈(L鏈)通過二硫鍵連 接在一起。
本發(fā)明中的Fab片段可通過木瓜蛋白酶處理與FGF23結合的抗體而制 得?；蛘咄ㄟ^將編碼此抗體Fab片段的DNA序列插入原核生物用表達載體 或真核生物用表達栽體中，再將此載體轉入原核生物和真核生物中后，表達 此栽體后獲得。
利用胃蛋白酶處理IgG得到的片段中，F(xiàn) (ab')2片段為具有與抗原結合活 性，分子量約為100,000的抗體片段。F(ab')2片段比通過絞鏈區(qū)二硫鍵結合 在一起的Fab片段還要大。
本發(fā)明中的F(ab')2片段可通過胃蛋白酶處理與FGF23結合的抗體而制 得，或者通過以下所述的利用二疏鍵或硫醚鍵將Fab'連接一起而制得。
Fab'是一種分子量約為50,000，具有抗原結合活性的抗體片段。其中， 所述F (ab')2鉸鏈區(qū)的二硫鍵被切斷。
本發(fā)明中的Fab'可通過用還原劑二疏蘇糖醇處理本發(fā)明中能與所述 FGF23結合的F(ab')2而得?；蛘咄ㄟ^將編碼此抗體Fab'片段的DNA序列插 入原核生物用表達載體或真核生物用表達栽體中，再將此載體轉入原核生物 和真核生物中后，表達此載體后獲得。
scFv是一種具有抗原結合活性的抗體片段，它是由單條重鏈可變區(qū)(以 下記作VH)和單條輕鏈可變區(qū)(以下記作VL)通過合適的肽段連接物(以下記 作P)連接組成的VH-P-VL或VL-P-VH型多肽。
本發(fā)明中的scFv片段可通過獲取與FGF23結合的本發(fā)明所述抗體中編 碼VH和VL的cDNA,構建編碼scFV的DNA序列，并將編碼此抗體片段 的DNA序列插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將此載 體轉入原核生物和真核生物中后，表達此栽體后獲得。
雙體是一種由scFv二聚化形成的抗體片段，它具有雙價抗原結合活性。 雙《介抗原的結合活性可以相同也可以不同。
本發(fā)明的雙體的制備，可通過獲取與本發(fā)明FGF23結合的所述抗體中編碼VH和VL的cDNA,按照使肽段連接物的氨基酸序列的長度在8個殘 基以下的方式，構建編碼scFV的DNA序列，并將所述DNA序列插入原核 生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將此載體轉入原核生物和真核 生物中后，表達此載體后獲得。
在dsFv中，組成sFv的VH和VL片段中各有一個氨基酸殘基被半胱氨 酸殘基取代，這兩個多肽片段通過這些半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵連接 在一起。被半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基的選擇，可按照Reiter等(Protein Engineering, 7: 697-704, 1994)所用方法，基于對抗體的三維結構預測來進行。
本發(fā)明中的dsFv片段的制備，可通過獲取與FGF23結合的本發(fā)明所述 抗體中編碼VH和VL的cDNA,構建編碼dsFv的DNA序列，并將編碼此 抗體片段的DNA序列插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中， 再將此載體轉入原核生物和真核生物中后，表達此載體后獲得。
構建的含有互補決定區(qū)的肽段至少含有一種以上的VH或VL互補決定
接。 、，、 P 、、、、'、 、 、、、
本發(fā)明中包含互補決定區(qū)的肽段的制備，可以通過構建編碼與FGF23 結合的本發(fā)明所述抗體VH和VL互補決定區(qū)(CDR)的DNA序列，并 將所述DNA序列插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將 此載體轉入原核生物和真核生物中后，表達此載體后獲得。
此外，包含互補決定區(qū)的所述肽段的制備，也可通過諸如Fmoc法(芴 曱氧豐炭基法，fluorenylmethyloxycarbonyl method)和tBoc法(#又丁氧，炭基法， t-butyloxycarbonyl method)等化學合成法制得。
此外，"功能性片段"是能與抗原(FGF23)結合的抗體的片段。這種"功 能性片段"優(yōu)選可與FGF23結合的片段并包含SEQIDNO:12中從第20位Q 到136位S的氨基酸序列，和/或SEQ IDNO:14中從第23位A到第128位 K的氨基酸序列。這種"功能性片段，，優(yōu)選是包含SEQ ID NO:40-45中所示至 少一種或全部互補決定區(qū)并可與FGF23結合的片段。這種"功能性片段"更 優(yōu)選衍生自C10雜交瘤產(chǎn)生的抗體可變區(qū)并可與FGF23結合。
本發(fā)明所述抗體包括抗體衍生物，其中，將放射性同位素、低分子量藥 物、大分子藥物和蛋白等，通過化學方法或基因工程使之結合于本發(fā)明的抗 FGF23抗體或此抗體的功能性片段上。
16本發(fā)明所述抗體衍生物的制備，可以通過化學等方法將放射性同位素、
低分子量藥物、大分子藥物和蛋白等使之結合于本發(fā)明的抗FGF23抗體或 此抗體的"功能性片段"的重鏈或輕鏈的N-末端或C-末端，此抗FGF23抗體 或此抗體的"功能性片段"的合適的取代基團或側鏈，此抗FGF23抗體或此 抗體的"功能性片段"的糖鏈等而制得(Koutai Kogaku Nyuumon, Osamu Kanamitsu, Chijin shokan， 1994)。
此外，結合了蛋白的抗體衍生物的制備，可通過將編碼本發(fā)明的抗 FGF23抗體或此抗體的"功能性片段"的DNA序列與編碼使之被結合蛋白的 DNA序列相連后，將此DNA序列插入表達載體后，再將此表達載體轉入合 適的宿主細胞中并表達此栽體的方法制得。
對于放射性同位素，其實例包括1311、 1251等。比如，放射性同位素可 通過氯胺T標記法等方法使之與所述抗體相連在一起。
低分子量藥物包括包括氮芥(nitrogen mustard)、環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide)在內(nèi)的烷基化藥物(alkylating agents ); 抗代謝藥物 (antimetabolites)如5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)、曱氨蝶呤(methotrexate ) 等；抗生素(antibiotics )如道諾霉素(daunomycin)、爭光霉素(bleomycin)、 絲裂霉素C (mitomycin C)、柔紅霉素(daunombicin)和阿霉素(doxorubicin ) 等；植物堿(plant alkaloids)類，如長春新堿(vincristine)、 長春花堿 (vinblastine)和長春地辛(vindesine)等；抗癌藥物如激素類藥物三苯氧胺 (tamoxifenand )和地塞米松(dexamethasone) (Clinical oncology; Japanese Clinical Oncology Research Meeting, Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Co., 1996);甾族化合物(steroids)如皮質醇(hydrocortisone) 和強的+> ( prednisone)等；包4舌阿司匹4木(aspirin)和消炎痛(indomethacin) 在內(nèi)的非甾族化合物；免疫調節(jié)劑(immunomodulators )如硫代蘋果酸金 (gold thiomalate )和青霉胺(penicillamine )等；免疫抑制劑 (immunos卿ressors )如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide )和咪峻硫噪呤 (azathioprine )等；抗炎藥(anti-inflammatories )如抗組胺類(anti-histamines ) 藥物樸爾敏(chlorpheniramine maleate )和氯馬斯'汀(clemastine )等 (Inflammation and anti-inflammatory treatment method, Ishiyaku Publishing Corp. Ltd.， 1982).可用公知的方法使所述這些低分子量藥物和抗體結合，例 如，用于道諾霉素和抗體結合的方法的實例包括通過戊二醛使道諾霉素和抗
17體的氨基基團間相結合的方法，通過水溶性碳化二亞胺使道諾霉素的氨基基 團和抗體的羧基基團結合在一起的方法。通過將低分子量藥物和抗體結合在 一起，可制得具有該低分子量藥物功能的抗體衍生物。
對于大分子藥物，其實例包括聚乙二醇(以下記作PEG)、白蛋白、右旋 糖酐、聚環(huán)氧乙烷、苯乙烯-馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、 羥丙基曱基丙烯酰胺等。通過將這些大分子化合物結合在抗體或抗體的"功 能性片段"上，預期獲得以下幾種效果(l)提高其對各種化學、物理和生物 因子的穩(wěn)定性。(2)顯著延長其在血液中的半衰期，(3)免疫原性消失，抗體 產(chǎn)生被抑制等(Bioconjugate Pharmaceutical, Hirokawa Shoten, 1993)。用于結 合PEG和抗體的一種方法的實例是與PEG修飾性試劑反應的方法。PEG修 飾性試劑的實例包括e-氨基基團修飾劑賴氨酸(Laid-Open Patent Publication Number S61-178926)、羧基基團修飾劑天冬氨酸和谷氨酸(Laid-Open Patent Publication Number S56-23587)、胍基基團修飾劑精氨酸(Laid-Open Patent Publication Number H2-l 17920)等。
結合了蛋白的所述抗體也可以作為一種融合抗體被制得。換句話說，將 編碼所述抗體或此抗體的功能性片段的cDNA與編碼特異性蛋白的cDNA連 接在一起，則編碼由所述抗體和特異性蛋白組成的融合蛋白的DNA即被構 建。這^爻DNA^L插入原核生物用或真核生物用表達栽體中。將此表達載體 轉入原核生物和真核生物中后，表達此載體后，即可生產(chǎn)得到與特異性蛋白 相結合的所述融合抗體。
關于本發(fā)明中所述抗FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其對人FGF23 結合活性或對人FGF23的功能抑制活性的評估，可通過免疫學方法檢測如 ELISA法(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996)，或通過生物傳感技術如Biacore生物傳感器測定其結合 解離常數(shù)(Journal of Immunological Methods, 145: 229-240, 1991)，以及通過 檢測用klothoc表達細胞對人FGF23刺激引起的早期生長反應基因-1啟動子 活性的抑制作用(Nature，444:770-774，2006)等來進行。
在本發(fā)明中，"人抗體，，被定義為來源于人的抗體基因的基因表達產(chǎn)物的 抗體。正如下面所描述的那樣，可以通過將此人抗體基因位點轉入動物，從
而將抗原給予有產(chǎn)生此人源抗體能力的轉基因動物后獲得。這些轉基因動物的實例包括小鼠。能產(chǎn)生人抗體的小鼠的已建立的方法描述在，如國際專利
出版號WO02/43478中。
對于本發(fā)明所述抗體的實例包括下面實施例中所述的由C10雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體(C10抗體)。在2007年2月2日，C10雜交瘤細胞已經(jīng)進行基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏在專利有機體保藏中心(Centra16， 1-1Higashi l-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,日本)獨立的4亍政才幾構"先進工業(yè)科學和技術研究院(Advanced Industrial Science and Technology )，，， 索取號為FERMABP-10772 (識別表示CIO)。
本發(fā)明抗體或其功能性片段也包括包含重鏈和/或輕鏈的單克隆抗體或其功能性片段，組成所述重鏈和/或輕鏈的氨基酸序列各具有一個或幾個氨基酸缺失、取代和添加。在此，"1個或幾個"、"幾個"指的是9個以下，優(yōu)選5個以下，更優(yōu)選3個以下，尤其優(yōu)選2個。如先前所描述氨基酸序列的部分修飾(缺失、取代、插入、添加)可通過對編碼此氨基酸序列的核苷酸序列的部分修飾而被引入組成本發(fā)明所述抗體或功能性片段的氨基酸序列。這些核苷酸序列的部分修飾可通過已知的位點特異性突變引入法的常規(guī)方法被引入[ProcNatl Acad Sci USA., 81: 5662-5666, 1984]。本發(fā)明所述抗體包括所有免疫球蛋白類型和同種型的抗體。
本發(fā)明所述抗FGF23抗體可通過以下生產(chǎn)方法制得。如將FGF23 ,或FGF23的一部分，或者FGF23的一部分和合適的能引起其抗原的抗原性增長的藥物載體物(例如，牛血清白蛋白等)所形成的偶合物(conjugate)，必要時與相應的佐劑(弗氏完全或不完全佐劑等)一起免疫所需的非人哺乳動物如人抗體生成轉基因小鼠。對于FGF23，天然型或重組型FGF23均可使用?；蛘?，通過將編碼FGF23的基因轉入表達載體并在此動物體內(nèi)表達此FGF23蛋白的方法來產(chǎn)生免疫致敏作用。通過雜交瘤(由來自免疫致敏動物的抗體生成細胞和沒有抗體生產(chǎn)能力的骨髓瘤細胞融合而成)的培養(yǎng)，產(chǎn)生與用于免疫作用的抗原有特異親和性的單克隆抗體，篩選產(chǎn)生所述單克隆抗體的克隆，由此制得了單克隆抗體。
本發(fā)明所述抗體包括那些通過利用所屬領域技術人員熟知的基因工程修飾技術(例如，參見歐洲專利申請EP314161)而被轉換成不同亞類的抗體。也即是說，通過基因工程技術，利用編碼本發(fā)明所述抗體可變區(qū)的DNA,可以制得一種不同于原有亞類的亞類抗體。
192.本發(fā)明所述抗體的生產(chǎn)
生產(chǎn)一種單克隆抗體包括以下幾個步驟。也即是
(l)用作免疫原的抗原蛋白或該抗原蛋白表達載體的制備，(2)通過動物體內(nèi)抗原注射或動物體內(nèi)抗原表達，免疫動物后，抽取動物血樣和分析血樣中抗體滴度，且在確定脾臟分離時間后，制備抗體生產(chǎn)細胞(3)制備骨髓瘤細胞(4)融合抗體生產(chǎn)細胞和骨髓瘤細胞(5)篩選能產(chǎn)生目標抗體的雜交瘤細胞團(6)雜交瘤細胞團被打散成單個細胞克隆(7)可任選地培養(yǎng)雜交瘤或飼養(yǎng)已被移植雜交瘤的動物以用于大量單克隆抗體的生產(chǎn)(8)檢測分析以此種方法生產(chǎn)的單克隆抗體的生物活性和識別特異性，或檢測作為標記性試劑的特性。
下文將按上面步驟對抗-FGF23單克隆抗體的生產(chǎn)方法作詳細描述。然而，這種抗體的生產(chǎn)方法并不限于此種方法。如，也可使用脾臟細胞以外的抗體生成細胞和骨髓瘤細胞(此抗體的生產(chǎn))。
(1) 抗原的純化
作為抗原，可使用利用基因重組技術，將編碼FGF23的DNA序列整合到一個合適的表達質粒上，在FGF23于宿主如大腸桿菌或動物細胞等中產(chǎn)生后，已純化的FGF23蛋白。因為人FGF23蛋白的一級結構是公知的[GenBank索取號No. AAG09917, SEQIDNO:4],利用本領域技術人員熟知的方法化學合成的來源于FGF23氨基酸序列組成的不完全肽段也可當作此抗原使用。
(2) 抗體生成細胞的制備步驟
已制得的上述(l)所提到的抗原與佐劑如弗氏完全或不完全佐劑或鋁鉀等混合，且混合物作為免疫原免疫實驗動物。對于所述實驗動物，最適合使用具有人源抗體生產(chǎn)能力的轉基因小鼠。此類小鼠在參考文獻[Tomizuka.等，Proc Natl Acad Sci USA., 97: 722-727, 2000]中被Tomizuka等描述。
免疫小鼠時，免疫原的給藥方法可以是皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射、足趾注射等方法中的任意一種。優(yōu)選腹腔注射、足趾注射或,f"3永注射。
可進行一次免疫或在一個合適的時間間隔內(nèi)進行多次免疫。隨后，測量存在于免疫動物血清的抗所述抗原的抗體滴度。當使用具有很高抗體滴度的動物作為抗體生成細胞的生產(chǎn)原料時，后續(xù)操作步驟的效率將得到提高。一般來講，優(yōu)選使用來源于最終免疫后3-5天的動物的抗體生成細胞用于后續(xù)
的細胞融合。
在這里，用于抗體滴度檢測方法的例子包括如^:射性同位素免疫定量測定法(以下記作"RIA法")、固定酶免疫定量測定法(以下記作"ELISA法")、熒光抗體法、被動血凝反應法等各種公知技術。從檢測靈敏度、快速性、精確性和自動化操作的可行性來看，RIA法或ELISA法是合適的方法。
本發(fā)明所述抗體的滴度檢測，例如使用ELISA檢測法，可通過以下步驟進行。首先，將抗人抗體的抗原被吸附于ELISA96孔板等的固定表面。然后，用與此抗原無關的蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，封閉沒有吸附抗原的此固定表面。漂洗此表面后，與作為一抗的連續(xù)濃度梯度稀釋的試劑(如來自于具有人抗體生產(chǎn)能力的轉基因小鼠的血清)接觸反應，以使所述抗原與樣品中的抗-FGF23抗體相結合。再然后，作為二抗的酶標記抗人抗體被加入，此二抗可與所述人抗體結合。漂洗后，加入所述酶的底物。然后，檢測因底物降解引起的顏色變化所導致的光吸收改變，以計算抗體滴度。
(3) 骨髓瘤制備步驟
對于骨髓瘤，可使用來源于哺乳動物如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人等自身不具有抗體生產(chǎn)能力的細胞。 一般來講，優(yōu)選使用來自于小鼠的細胞系，如8-氮鳥嗓呤抗性小鼠骨髓瘤細胞系P3X63Ag8U.1 (P3-U1) [Yelton, D.E.等，Current Topics in Microbiology and Immunology, 81: 1-7, 1978]，P3/NSI/l-Ag4畫l (NS-1) [Kohler, G.等，European J. Immunology, 6: 511-519，1976]， Sp2/0-Agl4 (SP2/0) [Shulman, M.等，Nature, 276: 269-270， 1978],P3X63Ag8.653 (653) [Kearney, J. F.等，J. Immunology, 123: 1548-1550, 1979],P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K.和Harris, A. W" Nature, 256: 495-497, 1975]等。這些細胞系的繼代培養(yǎng)要用合適的培養(yǎng)基，如8-氮鳥嘌呤培養(yǎng)基[一種補充有谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素和胎牛血清(FCS)、還有8-氮鳥嘌呤的RPMI-1640培養(yǎng)基]、Iscove's Modified Dulbecco's培養(yǎng)基(IMDM)或Dulbecco，s改良(Modified) Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)。然而，在細胞融合前3-4天，細胞系的繼代培養(yǎng)要用正常培養(yǎng)基(如包含有10% FCS的DMEM培養(yǎng)基)，為細胞融合準備的細胞數(shù)目不低于2xl07。
(4) 細力包融合
抗體生成細胞是漿細胞和其前體細胞的淋巴細胞。這些細胞可以從生物
21個體任意位置獲得。 一般來講，脾臟、淋巴結、骨髓、扁桃體、外周血、或者它們的合適組合均可被融合。
一般來講，最常使用脾臟細胞。.
最后一次免疫動物后，存在抗體生成細胞的部位，如脾臟，從能得到指定的抗體滴度的小鼠中分離出來，從而制得作為抗體生成細胞的脾臟細胞。下一步，融合脾臟細胞和骨髓瘤細胞。對于脾臟細胞和步驟(3)中得到的骨髓瘤細胞的融合方法，最常用的方法是使用聚乙二醇。這種方法的細胞毒性相
對較低，融合操作也筒單容易。這種方法有以下步驟，比如
將脾臟細胞和骨髓瘤細胞用無血清培養(yǎng)基(如DMEM)或磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)漂洗好，脾臟細胞和骨髓瘤細胞以5:1-10:1的比例混合并離心。移去上清液，打散沉淀的細胞團，邊攪拌邊加入1 mL含500/。 (w/v)聚乙二醇(分子量1000-4000)的無血清培養(yǎng)基。然后，緩慢加入10mL的無血清培養(yǎng)基,隨后離心。棄去上清液，在正常培養(yǎng)基(以下稱HAT培養(yǎng)基)中懸浮沉淀的細胞，所述正常培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)含有合適量的次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶脫氧核苷(以下稱HAT)溶解物和人白細胞介素-6 (以下稱IL-6)。這些細胞被等量均分至培養(yǎng)板各孔(以下稱培養(yǎng)板)，并在37。C和存在5%C02的條件下培養(yǎng)約兩個星期。在培養(yǎng)期間，根據(jù)需要補充HAT培養(yǎng)基。(5)雜交瘤細胞團的篩選
上述所提到的骨髓瘤細胞為8-氮鳥噤呤抗性抹時，也即是說，如果它是一種次黃嘌呤-鳥噤呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺陷性細胞株時，沒有融合的骨髓瘤細胞或僅由骨髓瘤細胞融合形成的融合型細胞，在含有HAT的培養(yǎng)基中不能存活。而另一方面，僅由抗體生成細胞形成的融合型細胞，或由抗體生成細胞與骨髓瘤細胞形成的融合型細胞雜交瘤細胞是能夠生存的。但是僅由抗體生成細胞融合形成的融合型細胞的生存周期是有限的。因此，通過在含HAT培養(yǎng)基中的持續(xù)培養(yǎng)，僅僅由抗體生成細胞與骨髓瘤細胞形成的融合型細胞雜交瘤細胞能夠生存。從而，雜交瘤細胞可被篩選出來。
對于正在克隆中生長的雜交瘤，培養(yǎng)基被換成不含氨基蝶呤的培養(yǎng)基(以下稱作HT培養(yǎng)基)。然后，收集部分培養(yǎng)基上清液，用如ELISA法檢測抗-FGF23抗體滴度。
上面，為利用8-氮鳥噤呤抗性細胞系的方法示例。但是，其他細胞系也可相應地應用于雜交瘤細胞的篩選方法。在這些情況下，所使用的培養(yǎng)基組合物也可變化。(6) 克隆步驟
通過利用與(2)中所用相同的抗體滴度檢測方法檢測抗體滴度，決定用于生產(chǎn)所述特異性抗體的雜交瘤細胞被移至另一個培養(yǎng)板，并進行克隆。克隆方法的實例包括限制性稀釋法，在此方法中，雜交瘤細胞被稀釋至培養(yǎng)板中每個培養(yǎng)孔僅含有一個雜交瘤細胞，并被培養(yǎng)；軟瓊脂培養(yǎng)法，在這種方
法中，雜交瘤細胞被培養(yǎng)在軟瓊脂培養(yǎng)基中，克隆被收集； 一種在此方法中用顯微操作器每次轉移一個細胞并對其培養(yǎng)的方法；分類機分揀克隆法，在這種方法中，利用細胞分揀機分離單個細胞等。限制性稀釋法較為簡單和常用。
關于培養(yǎng)孔，在培養(yǎng)孔里抗體滴度被觀察到，如，當利用限制性稀釋法重復克隆2-4次時，產(chǎn)生具有穩(wěn)定的抗體滴度的細胞系被篩選出來，以用作抗-FGF23單克隆抗體生成雜交瘤細胞系。
(7) 通過雜交瘤細胞培養(yǎng)制備單克隆抗體
將HT培養(yǎng)基換成正常培養(yǎng)基，以培養(yǎng)已完成克隆的雜交瘤細胞。對于大規(guī)模培養(yǎng)，有利用大容量培養(yǎng)瓶的循環(huán)培養(yǎng)、旋轉器培養(yǎng)，或利用中空纖維系統(tǒng)的培養(yǎng)等。通過用本領域技術人員熟知的方法如凝膠過濾等方法對大規(guī)模培養(yǎng)上清液的純化，獲得抗-FGF23單克隆抗體。此外，通過將所述雜交瘤在相同品系小鼠(如BALB/c)或nu/nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔等腹膜中的生長，獲得含有大量抗-FGF23單克隆抗體的腹膜液。簡單的抗體純化方法是使用商品化的單克隆抗體純化試劑盒(比如，MAbTrap Gil kit; GEHealthcare Bioscience Co.)等。
以這些方法獲得的單克隆抗體具有高抗FGF23抗原特異性。
此外，重組型抗體的制備可通過利用基因重組技術(Delves, P. J.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.， 1997 WILEY,Shepherd, P. 和 Dean C., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORDUNIVERSITY PRESS, Goding， J. W.， Monoclonal Antibodies: principles andpractice., 1993 ACADEMIC PRESS),從骨髓瘤等抗體生成細胞中克隆編碼所述抗體的基因，將此基因整合到一種合適的載體并轉入一種宿主(如哺乳動物細胞系、大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞等)而得到。
本發(fā)明包括含有由產(chǎn)生本發(fā)明抗體的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的基因序列的核酸，尤其包括下述的含有由本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)和輕
23鏈可變區(qū)的核酸。在這里，核酸包括DNA和RNA。此外，本發(fā)明也包括本 發(fā)明中所述的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)成熟片段的核酸，在此，所述成熟片 段是指去除所述信號肽序列后剩余的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)肽段。此外， 除上述的核酸外，本發(fā)明中所述核酸還包括具有與本發(fā)明中所述抗體氨基酸 序列的氨基酸和所述抗體重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸相對應的密 碼子的核酸。
為制備編碼來自于所述雜交瘤的單克隆抗體的基因， 一種方法被運用， 按照這種方法，編碼所述單克隆抗體每條輕鏈可變區(qū)，輕鏈恒定區(qū)，重鏈可 變區(qū)，重鏈恒定區(qū)的DNA可通過PCR等方法得到制備。在此制備方法中， 根據(jù)抗-FGF23抗體基因或其氨基酸序列設計的寡DNA被用作引物。對于模 板，從雜交瘤中制得的DNA可用作模板。所述這些DNA被整合到一個合 適的載體上并被轉入宿主細胞后，得到表達，或者將這些DNA—起整合到 一個合適的載體后共表達。
對于載體，可以使用能在微生物宿主中自主生長的噬菌體或質粒。對于 質粒DNA，其實例包括來源于大腸桿菌、枯草桿菌或酵母等的質粒。對于噬 菌體DNA，其實例包括人噬菌體。
所有能表達目的基因的宿主均可用作轉化宿主。其實例包括細菌(大腸 桿菌、枯草桿菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)和昆蟲 細胞等。
將基因轉入宿主中所用的方法是眾所周知的，可例舉出許多方法(如鈣 離子法、電穿孔法、原生質體法、乙酸鋰法、磷酸鈣、脂質體轉染法等)。 此外，將基因轉入下述動物中所用的方法，其實例包括以下所述方法顯微 注射法、應用電穿孔技術或脂質體轉讓法將基因轉入胚胎細胞的方法、以及 核移植法等。
在本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)轉化子，以及對培養(yǎng)產(chǎn)物的收集，獲得抗-FGF23 抗體。在這里，"培養(yǎng)產(chǎn)物，，表示以下的任何一種(a)培養(yǎng)物上清液，(b)培 養(yǎng)的細胞或培養(yǎng)的菌體或它們的勻漿，以及(c)轉化子分泌物。為了培養(yǎng)轉 化子，要使用適合所用宿主的培養(yǎng)基，并使用靜止培養(yǎng)法、滾瓶培養(yǎng)法等培 養(yǎng)方法。
培養(yǎng)完畢后，當所述目標抗體產(chǎn)生于細菌菌體或細胞內(nèi)時，所述抗體通 過細菌菌體或細胞的勻漿得到收集。此外，當所述目標抗體產(chǎn)生于細菌菌體或細胞外時，培養(yǎng)物溶液被直接使用，或者是通過離心等方法除去細菌菌體 或細胞。隨后，通過單獨使用或適當組合使用各種用于蛋白質分離純化的色 譜技術的常規(guī)生物化學方法，從所述培養(yǎng)產(chǎn)物中分離純化所述目標抗體
此外，利用轉基因動物構建技術，構建所述目標抗體基因被整合為內(nèi)源 基因的動物宿主如轉基因牛、轉基因山羊、轉基因綿羊或轉基因豬等。從這 些轉基因動物分泌的奶中可以得到大量的來源于所述目標抗體基因的單克
隆抗體(Wright， G.,等，Bio/Technology 9: 830-834， 1991)。當在體外培養(yǎng)雜交 瘤時，按照培養(yǎng)細胞的特性、試驗研究的目的和培養(yǎng)方法等各種條件，使所 述雜交瘤得到生長、保持和儲存。已知營養(yǎng)培養(yǎng)基或各種來源和制備于已知 基礎培養(yǎng)基的營養(yǎng)培養(yǎng)基可被用于在培養(yǎng)上清液中生產(chǎn)所述單克隆抗體。 (8)所述單克隆抗體的分析
在這些方法中制得的所述單克隆抗體的同型類和亞類分析可通過以下 方法進行。首先，筌定方法的實例包括平板雙向擴散(Ouchterlony)法、ELISA 法或RIA法等。平板雙向擴散法較簡單，但當所述單克隆抗體濃度低時， 必需進行濃縮操作。另一方面，當使用ELISA法或RIA法時，培養(yǎng)上清液 可直接與被吸附于固定表面的抗原反應，且通過使用與各種免疫球蛋白的同 型類和亞類反應的抗體作為二抗抗體，可對所述單克隆抗體的同型類和亞類 進行鑒定。
此外，可用Folin/Lowry法，以及通過計算其在280 nm的光吸收[1.4 (QD280)-免疫球蛋白lmg/mL]的方法，進行蛋白質定量。
所述單克隆抗體識別表位的鑒定(表位作圖)按如下進行。首先，構建單 克隆抗體識別的分子的各部分結構。對于部分結構的構建，其方法如下一 種方法是采用眾所周知的寡肽合成技術，制取分子的各部分肽段;一種方法 是利用基因重組技術將編碼所述目標部分肽段的DNA序列整合到一個合適 的表達質粒，所述肽段在宿主如大腸桿菌等體內(nèi)或體外制得。然而，為實現(xiàn) 上述目的， 一般是將上述兩種方法組合使用。例如，利用本領域技術人員熟 知的基因重組技術構建以隨才幾長度從羧基末端或氨基末端開始連續(xù)性縮短 的抗原蛋白多肽系列。然后，研究所述單克隆抗體與這些多肽的反應活性， 并大致確定其識別位點。
以下，作更詳細的說明，利用本領域技術人員眾所周知的寡肽合成技術， 合成這些肽的相應部分的寡肽或變體等。為了確定表位，研究單克隆抗體與
25這些多肽的結合能力，所述單克隆抗體含有在本發(fā)明用于預防或治療的藥物 中作為活性成分，或者研究這些多肽對所述單克隆抗體與相應抗原的結合能 力的竟爭性抑制活性。作為獲得各種寡肽的簡單方法，可使用商品試劑盒(如
SPOTs kit (Genosis Biotechnologies),利用多肽合成技術的多肽系列合成試劑 盒(Chiron Co)等)
(9)所述抗體片段的生產(chǎn)
基于上述(7)中所描述抗體，利用基因工程或蛋白質化學方法生產(chǎn)所述抗 體片段。
對于基因工程技術方法，其實例是構建編碼目的抗體片段的基因，并 用合適的宿主如動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌等表達此基因， 純化所述抗體片段。
對于蛋白質化學方法，其實例是蛋白酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等) 被用于特異性位點剪切并進行純化。
對于所述抗體片段，其實例是含有Fab、 F (ab')2、 Fab'、 scFv、雙體、 dsFv、 CDR的肽段等。每一種抗體片段的生產(chǎn)方法將在下面得到詳細描述。
(i) Fab的生產(chǎn)
Fab可用蛋白質化學方法，通過利用木瓜蛋白酶處理IgG制得。木瓜蛋 白酶處理后，如果所述初始抗體是具有蛋白A結合能力的IgG亞類，則通 過蛋白A層析柱，分離IgG分子和Fc片段，回收均質Fab(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第三版，1995)。如果所述抗體為不具有蛋 白A結合能力的IgG亞類抗體，利用離子交換層析，F(xiàn)ab從被洗脫在低鹽濃 縮液的片斷中得到回收(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第三 版，1995)。 此外，對于利用基因工程技術獲得Fab,在大多數(shù)情況下使用大 腸桿菌，或者使用昆蟲細胞和動物細胞等來生產(chǎn)Fab。如，在上面2(7)中被 描述的編碼所述抗體可變區(qū)的DNA被克隆到Fab表達載體中，以構建Fab 表達載體。對于所述Fab表達載體，任何可使Fab的DNA得到整合和表達 的質粒都可使用。 一個實例是pIT106 (Science, 240: 1041-1043, 1988)等。Fab 表達載體被轉入合適的大腸桿菌，并可生成并聚集于包涵體或外周質中。對 于來自于包涵體的Fab，可通過被常用于蛋白質的重折疊的方法而被激活。 此外，當Fab表達于外周質時，具有活性的Fab被釋放到培養(yǎng)上清液中。利 用結合有抗原的層析柱，經(jīng)過重折疊處理或來自于培養(yǎng)上清中的Fab被純化得到均質Fab (Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992).
(ii)F(ab')2的生產(chǎn)
F(ab')2可用蛋白質化學方法，通過利用胃蛋白酶處理IgG制得。胃蛋白 酶處理后，利用與Fab相同的純化操作，可回收得到均質F (ab')2 (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第三版，1995)。此外，也可通過馬來酰亞 胺類(如o-PDM或雙馬來酰亞胺己烷等)處理以下(iii)所述的Fab',形成硫 醚鍵，或者通過DTNB (5,5'-二硫代-雙(硝基苯曱酸))處理，形成S-S鍵的 方法，得到F (ab')2 (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(iii) Fab'的生產(chǎn)
Fab'可通過用還原性試劑(如二硫蘇糖醇等)處理上述(ii)中所述的F (ab')2制得。此外，F(xiàn)ab'的生產(chǎn)可用基因工程技術，在大多數(shù)情況下使用大腸 桿菌，或者使用昆蟲細胞和動物細胞等。例如，在上述2(7)中的編碼所述抗 體可變區(qū)的DNA被克隆到Fab'表達栽體中，以構建Fab'表達載體。對于所 述Fab'表達載體，任何可使Fab'的DNA得到整合和表達的質粒都可使用。 一個實例是pAK19 (BIO/TECHNOLOGY， 10: 163-167, 1992)等。Fab'表達載 體被轉入合適的大腸桿菌。Fab'可生成并聚集于包涵體或外周質中。對于來 自于包涵體的Fab',可通過被常用于蛋白質的重折疊的方法而被激活。此外， 當Fab'表達于外周質時，通過溶菌酶部分消化、滲透壓休克、超聲波裂解等 方法，勻漿細菌，這些(Fab')可從菌體外得到回收。利用G蛋白層析柱等， 經(jīng)過重折疊處理或來自于細菌勻漿液中的Fab'被純化得到均質 Fab'(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。 (iv) scFv的生產(chǎn)
利用基因工程技術，可用噬菌體或大腸桿菌或昆蟲細胞或動物細胞等來 生產(chǎn)scFv。如，在上述2(7)中的編碼所述抗體可變區(qū)的DNA被克隆到scFv 表達載體中，以構建scFv表達載體。對于所述scFv表達載體，任何可使scFv 的DNA得到整合和表達的質粒都可使用。其實例包括pCANTAB5E (GE Healthcare Bioscience Co.)， pHFA (Human Antibodies & Hybridomas, 5: 48-56, 1994)等。將scFv表達載體轉入合適的大腸桿菌，通過使輔助性噬菌體感染， 可得到其中scFv以與噬菌體表面蛋白融合的形式而被表達于噬菌體表面的
27噬菌體。此外，scFv可生成并聚集于轉入有scFv表達載體的大腸桿菌的包 涵體或外周質中。對于來自于包涵體的scFv,可通過被常用于蛋白質的重折 疊的方法而被激活。此外，當scFv表達于外周質時，通過溶菌酶部分消化、 滲透壓休克、超聲波裂解等方法，勻漿細菌，這些(scFv)從菌體外被回收。 利用陽離子交換層析等，經(jīng)過重折疊處理或來自于細菌勻漿液中的scFv被 純化得到均質scFv (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(v) 雙體的生產(chǎn)
利用基因工程技術生產(chǎn)雙體時，主要使用大腸桿菌，也可使用昆蟲細胞 和動物細胞。例如，制備DNA,其中連接上述2 (7)中所述抗體的VH和 VL,從而接頭(linker)編碼的氨基酸殘基為8個殘基或更少，并將其克隆 到雙體表達載體上，從而構建了雙體表達載體。任何可使雙體DNA得到整 合和表達的質粒都可用作雙體表達載體。其實例包括pCANTAB5E (GE Healthcare Bioscience)、pHFA (Human Antibodies Hybridomas， 5, 48， 1994)等， 雙體可產(chǎn)生和聚集在轉入雙體表達載體的大腸桿菌包涵體或外周質中。從包 涵體中獲得的雙體，可通過常被用于蛋白質的重折疊法而被激活。此外，當 (雙體)被表達于外周質時，通過溶菌酶部分消化、滲透壓休克、超聲波裂 解法等方法，勻漿細菌，這些(雙體)從菌體外被回收。通過使用陽離子交 換層析等技術(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996) 處理,經(jīng)過重折疊處理或來自細菌勻漿液的雙體被純化得到均質雙體。
(vi) dsFv的生產(chǎn)
利用基因工程技術生產(chǎn)dsFv時，主要使用大腸桿菌，也使用昆蟲細胞 和動物細胞。首先，將突變引入到在上述(ii)、 (iv)和(v)中編碼抗體VH和 VL的DNA的合適位點，從而得到所述編碼的氨基酸殘基被半胱氨酸取代 的DNA。所述制得的每條DNA均可被克隆于dsFv表達載體中以構建VH和 VL表達載體。任何可使dsFv的DNA得到整合和表達的質粒均可用作dsFv 表達載體。例如pUL19 (Protein Engineering, 7: 697-704, 1944)等。所述VH 和VL表達載體可被轉入合適的大腸桿菌中，且其可在包涵體或外周質中產(chǎn) 生和聚集。獲得來自包涵體或外周質的VH和VL,并使之混合，dsFv可通 過常被用于蛋白質的重折疊法而被激活。經(jīng)過重折疊法處理后，可通過離子 交換層析法和凝膠過濾法進一步純化(Protein Engineering, 7: 697-704， 1994)。(vii) CDR肽的生產(chǎn)
含有CDR的肽可通過化學合成法(如Fmoc法或Boc法等)制得。此 外，CDR肽表達載體可通過制備編碼含有CDR肽的DNA,并克隆于合適 的表達載體后獲得。任何可使編碼CDR肽的DNA得到整合和表達的質粒均 可用作所述表達載體。如pLEX (Invitrogen)和pAX4a+ (Invitrogen)等。所 述表達栽體可被轉入合適的大腸桿菌中，且其可在包涵體或外周質中產(chǎn)生和 聚集。從包涵體或外周質中得到CDR肽，并可通過離子交換層析法和凝膠 過濾法對其進行純化(Protein Engineering, 7: 697-704, 1994)。 3.本發(fā)明中所述抗體和此抗體的功能性片段的特征 本發(fā)明中所述抗體和此抗體的功能性片段具有任何以下特征
(a) FGF23結合試驗；與具有SEQ IDNO:4中從第25位到第251位的氨 基酸殘基的全長FGF蛋白序列結合。
(b) 體外試驗；一種檢測方法中FGF23的活性受抑制，利用此檢測方法 可以;險測FGF23活性。體外檢測FGF23活性的一個方法的實例是用FGF23 剌激引起早期生長反應基因-1的啟動子活化(Nature, 444: 770-774, 2006)。
(c) 體內(nèi)實-瞼；對人給藥時，抑制內(nèi)源性FGF23活性，增加血清磷濃度 和血清1,25D濃度。與常規(guī)抗體(2C3B抗體(抗FGF23蛋白的小鼠單克隆 抗體，公開于WO03/057733,由索取號為FERMBP-7838的雜交瘤細胞產(chǎn)生 的抗-FGF23抗體)相比，血清磷濃度和血清1，25D濃度增加程度更大，且增 加血清磷濃度和血清1，25D濃度的持續(xù)時間長。比如，當給予獼猴時，其引 起血清磷濃度升高的持續(xù)時間約是2C3B抗體的約3倍以上，優(yōu)選約5倍， 其引起血清1,25D濃度升高的持續(xù)時間約是2C3B抗體的約1.5倍以上，優(yōu) 選約2.5倍。
本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的抗FGF23抗體的氨基酸序列的核酸。此核 酸可以是DNA或RNA。本發(fā)明中的核酸，優(yōu)選編碼C10雜交瘤產(chǎn)生的抗 體的氨基酸序列的核酸。 一個實例是編碼重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核酸 (C10抗體的重鏈核酸序列)，所述氨基酸序列由SEQIDNO:ll中從第58 位C到第408位A的核香酸序列編碼。此外，另一個實例是編碼輕鏈可變 區(qū)的氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列由SEQ ID NO: 13中從第67位G 到第384位A的核苷酸序列編碼。
29II.藥物組合物
制劑，即含有本發(fā)明的人抗-FGF23抗體或此抗體的功能性片段的藥物 組合物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這種制劑，除所述抗體或此抗體的功能性片段 之外，優(yōu)選包括生理上可接受的稀釋劑或藥物載體，或可以是一種與其他藥 物(如其它抗體或抗生素)的混合物。合適的藥物載體包括生理鹽水、磷 酸鹽緩沖生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水葡萄糖溶液、緩沖生理鹽水，但不 限于這些載體。此外，抗體可以是凍干的和在必要時添加上述緩沖液后得到 重建。給藥方法包括口服給藥、或腸胃外給藥如口腔內(nèi)、氣管支氣管內(nèi)、 直腸內(nèi)、皮下注射、肌肉注射、靜脈注射等給藥，優(yōu)選給藥方法優(yōu)選靜脈注 射給藥?？赏ㄟ^各種制劑形式進行給藥，這些劑型包括氣霧劑、膠嚢、藥 片、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏劑和膠布制劑(tapes)。
被制成液態(tài)制劑如乳劑和糖漿劑時，可使用添加劑如:水;糖類如蔗糖、 山梨醇和果糖等;醇類如聚乙二醇、丙二醇等;油類如芝麻油、橄攬油和大豆 油等;防腐劑如對羥基苯曱酸酯類等；調味劑如草莓調味劑和薄荷等。
被制備膠嚢、藥片、粉劑、顆粒劑等時，可使用添加劑如賦形劑如乳 糖、葡萄糖、蔗糖、和甘露(糖)醇等；崩解劑如淀粉、海草酸鈉等；潤滑劑 如硬脂酸鎂和滑石粉等;粘合劑如聚乙烯醇、羥丙基纖維素和凝膠等；表面活 性劑如脂肪酸酯等；增塑劑如丙三醇等。
注射制劑可使用的添加劑包括水；糖類如蔗糖、山梨醇、木糖、海藻 糖、果糖等；糖醇如甘露(糖)醇、木糖醇和山梨糖醇等；緩沖液如磷酸鹽緩 沖液、檸檬酸鹽緩沖液和谷氨酸鹽緩沖液等；表面活性劑如脂肪酸酯等。
腸胃外給藥的合適制劑包括注射劑、栓劑、氣霧劑等。在使用注射劑 時，通常以單劑量安瓿或多劑量容器的形式被提供。它可能是合適的粉劑， 在使用時以合適的藥物載體，如不含熱源質的無菌水重新溶解。這些制劑含 有常被用于制劑配制的添加劑如乳化劑、懸浮劑等。注射劑使用方法包括, 如靜脈輸注、靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射等。 此外，給藥劑量隨給藥對象的年齡、給藥方式、給藥頻率而不同，并能在很 寬范圍內(nèi)調整。.
栓劑可用藥物載體(如可可脂、氫化脂肪、羧酸等)進行配制。氣霧劑 可用載體所述抗體或此抗體的功能性片段本身進行配制，或者用載體進行配 制，所述載體對給藥對象(患者)的口部和呼吸道粘膜不產(chǎn)生刺激作用，且
30能使所述抗體或此抗體的功能性片段擴散成微粒，使其容易吸收。
載體的具體實例包括乳糖、丙三醇等。根據(jù)所述抗體或此抗體的功能性 片段的特性和所用載體的特性，可選用氣霧劑、干粉等劑劑。此外，在口服 制劑中所用的添加劑組分也可添加到這些腸胃外給藥制劑中。
所用劑量一般因癥狀、年齡、體重等而異，但是一般來說，對成年人的
口服給藥，約為每天0.01 mg-1000mg。此劑量可一次給藥或分成幾次給藥。 在腸胃外給藥時，可通過皮下注射、肌肉注射或靜脈注射每次的給藥量為 0.01 mg - 1000 mg。
本發(fā)明包括本發(fā)明所述抗體，或此抗體的功能性片段，或使用包含本發(fā) 明所述抗體、或此抗體的功能性片段的藥物組合物預防或治療下述疾病的方 法，此外，本發(fā)明還包括本發(fā)明所述抗體、或此抗體的功能性片段在制備用 于預防或治療下述疾病的藥物中的用途。
可被本發(fā)明所述抗體、或此抗體的功能性片段預防和治療的疾病包括 具有FGF23過度活性的疾病，如肺瘤引起的軟骨病(tumor-induced osteomalachia ) 、 ADHR 、 XLH 、骨纖維性結構不良、麥-奧二氏 (McCune+Albright)綜合征，以及伴隨有異常礦物質代謝的疾病如常染色 體隱性低血磷癥。此外，(本發(fā)明)還有望提高對低血磷癥、骨鹽沉積衰竭、 骨骼疼痛、肌肉無力、骨骼畸形、成長障礙、低1,25D血癥等疾病相關的綜 合征的療效。由于FGF23在生理條件下具有重要作用，被磷代謝和維生素D 代謝控制所介導的FGF23鉀代謝控制活性，可通過本發(fā)明所述抗體、或此 抗體的功能性片段來調控，因此，它們(本發(fā)明所述抗體、或此抗體的功能 性片段)可用于預防和治療由礦物質代謝和維生素D代謝異常所導致的疾 病，如骨質疏松癥、佝僂病(包括低血磷癥性佝僂病和維生素D抗性佝僂 病)、高4丐血癥、低鈞血癥、異位鉤化癥(ectopic calcification)、骨硬化、 派杰(Paget，s)病、甲狀旁腺機能亢進癥、曱狀旁腺機能減退癥、搔癢癥等。 此外，本發(fā)明所述抗體或此抗體的功能性片段也可用于以腎病性骨營養(yǎng)不 良、透析性骨病、腎小管功能障礙為代表的由腎衰竭透析和腎衰竭并發(fā)癥引 起的疾病的預防和治療。另一方面，據(jù)^艮道，1,25D不^f義具有上述的對礦物 質代謝(如鈣代謝等)的活性，也具有細胞生長抑制作用、細胞分化活性等。 因此，本發(fā)明所述抗體或此抗體的功能性片段也可用于其生長分化由1，25D 調控的細胞引起的疾病的預防和治療。此外，眾所周知，在腫瘤引起的軟骨病中，由腫瘤引起的FGF23過量 表達可導致病變。因此，可以想到，通過使用連接有放射性物質(如放射性 同位素等)、或者連接有各種毒素治療試劑(如低分子量藥物等)的本發(fā)明 抗體，和所述抗體在過量產(chǎn)生FGF23的胂瘤中的聚集，會導致肺瘤回縮。
III.制劑實例
包含本發(fā)明所述抗體或此抗體的功能性片段的制劑,以溶解在水或除水 以外的藥理上可接受的溶液中的無菌溶液或懸浮液的安瓿形式供使用。此 外，也可將無菌粉劑(優(yōu)選凍干的本發(fā)明所述抗體分子)填充在安瓿中，使 用時用藥理上可接受的溶液稀釋后供使用。
實施例
下面是通過實施例對本發(fā)明作更詳細描述，但這并不意味著本發(fā)明僅受 限于實施例的這些描述。
實施例1
重組人FGF23表達載體的制備。
(1)人FGF23H蛋白表達載體的構建。
使用可造成腫瘤引起的軟骨病(tumor-induced osteomalachia)的腫瘤的 人cDNA文庫為模板，擴增編碼人FGF23基因的cDNA,所述操作過程使 用FlEcoRI引物(SEQ ID NO:l)和LHisNot引物(SEQ ID NO: 2)和 LA-TaqDNA聚合酶，進行35個PCR循環(huán)，每個PCR循環(huán)的組成為96°C 保溫1 min,然后96。C 30秒，55。C 30秒和72。C 30秒。所述FlEcoRI引物在 退火后與存在于編碼人FGF23基因的核苷酸片段5'上游遠端的序列結合， 并在擴增獲得的編碼人FGF23基因的核苷酸片段5'端處引入EcoRI限制性 酶切位點。所述LHisNot引物中含有可與編碼人FGF23基因的核苷酸序 列中的終止密碼子5'端發(fā)生退火的序列、編碼末端(terminal)密碼子的序 列(其在編碼His6標記序列(His- His- His- His- His- His )和Notl限制性位 點的序列之后)。結果，擴增片段編碼人FGF23蛋白，在所述FGF23蛋白 的羧基末端被加入一段His6-標記的序列，其下游處有一個Notl限制酶位點。 所述擴增片^:經(jīng)EcoRI和Not I消化后，與同樣經(jīng)EcoRI和Notl消化的動
32物細胞表達載體pcDNA3.IZeo (Invitrogen)相連接。以這種方法構建的所述表 達載體被克隆且其核苷酸序列得以確定， >匸人而確認該表達載體編碼添加有 His6標記序列的目標蛋白，即人FGF23蛋白。所述載體被稱為 pcDNA/hFGF23H。
FlEcoRI: CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG ( SEQ ID
LHisNot:
CGAA ( SEQ ID NO:2)
(2)人FGF23蛋白表達載體的構建
用pcDNA/hFGF23H作為模板擴增片段，其中使用FlEcoRI引物和LNot 引物(SEQIDNO:3)和LA-TaqDNA聚合酶，進行25個PCR循環(huán)，每個PCR 循環(huán)的組成為94°C保溫lmin,然后94°C 30秒，55°C 30秒和72°C lmin。結 束反應后，所述編碼人FGF23片段用EcoRI和Notl進行消化處理，然后純化。 通過將其插入到pEAK8/IRES/EGFP載體的EcoRI和Notl限制酶位點，這些 純化得到的片段被克隆，所述pEAK8/IRES/EGFP載體是動物細胞表達載體， 其是通過在pEAKS (Edge Biosystem)內(nèi)連接分子內(nèi)核糖體進入序列 (intramolecular ribosomal entry sequence , IRES)和增強型綠色熒光蛋白(EGFP) 而得到的。由此獲得的質粒的核苷酸序列得以確定，從而確認其編碼人FGF23 蛋白。所述載體被稱為pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23。
LNot: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA ( SEQ ID NO:3)
(實施例2)
(l)重組人FGF23蛋白和重組突變型人FGF23 H蛋白的表達。 通過對所述載體中氨千青霉素抗性基因上Fspl限制酶位點的剪切，使 pcDNA/hFGF23H被線性化并被純化，然后與鼠CHO克隆-1細胞(Shirahata, S.,等，Biosci Biotech Biochem， 59: 345-347， 1995)混合，并利用Gene Pulser II (Bio Rad)穿孔儀，使用電穿孔法被轉染到此細胞內(nèi)。在用含有10% FCS的 MEM a培養(yǎng)基(Gibco BRL)培養(yǎng)這些細胞24小時后，培養(yǎng)基中加入Zecocin (Invitrogen)到終濃度0.5 mg/ml，然后(用此培養(yǎng)基)培養(yǎng)所述細胞1個星期。胰酶消化后，貼壁生長的細胞被釋放，并通過有限稀釋法，使其在Zecocin 終濃度為0.3 mg/ml的條件下被克隆，以得到很多的細胞克隆。利用蛋白質 印跡(Westem blotting)技術，表達人FGF23H效率最高的細胞被鑒定出來。 每個細胞克隆的培養(yǎng)上清液都被收集并對其進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳，然后將(電泳得到的)蛋白轉移到PVDF膜(Millipore)上。通過使用抗 -His-tag(羧基末端)抗體和ECL光致發(fā)光系統(tǒng)(photo-luminescent, GE Healthcare Bioscience),檢測出來自約32kDa附近的FGF23 H蛋白的信號。 因此，具有最高表達能力的被稱為#20的細胞克隆被發(fā)現(xiàn)，此細胞克隆被命 名為CHO-OST311H，并于2000年8月11日保藏于位于日本的國際專利生 物體保藏中心國立先進工業(yè)科學和技術研究院(International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)) ， Tsukuba Central 6， 1-1-1 Higashi, Tsukuba， Ibaraki (保藏 號FERM BP-7273)。在本說明書中，CHO-OST311H被稱作CHO-hFGF23H。
(2) 人FGF23表達細胞的獲得
pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23載體對CHO Ras克隆-1細胞的轉染通過使 用膜融合脂的基因轉染方法完成。當培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中的CHO Ras克隆-l 細胞已經(jīng)覆蓋住所述6孔培養(yǎng)板底部約60%時，移去所述培養(yǎng)基，并加入l ml無血清的MEMa培養(yǎng)基。2.5 (tig轉入載體和10 pi Transfectam(注冊商標) (Promega)分別與50 pi MEMa無血清培養(yǎng)基混合，兩種溶液混合后，靜置 10min。將混合物加入事先準備好的6孔板的培養(yǎng)孔中。孵育2小時后，移 去含有DNA的培養(yǎng)基，換上含有10%FCS的培養(yǎng)基，孵育培養(yǎng)物一整夜。 第二天，加入嘌呤霉素(Sigma)至終濃度5 pg/ml，以選擇具有藥物抗性的 細胞。通過有限稀釋法，由此獲得的具有藥物抗性的細胞被克隆。此外，利 用蛋白質印跡技術，得到表達目標蛋白效率最高的細胞系。所述細胞被稱為 CHO-hFGF23。
(3) 重組人FGF23蛋白在動物細胞中的表達和檢測。 用抗羧基端-His6標記序列的抗體對培養(yǎng)物上清液中CHO-hFGF23H重
組物的蛋白質印跡，檢測到兩條約為32kDa和10kDa的條帶。將這兩條帶 從凝肢中切出，并測定其N-末端氨基酸序列。在較大分子量條帶(約為32kDa) 中，所檢測到的序列是從SEQ ID NO: 4中第25位氨基酸開始的氨基酸序 列，它可被視為是在分泌過程中其信號肽段序列已被切除的人FGF23蛋白。
34另一方面，在較小分子量條帶中，所^r測序列被確認是從SEQ IDNO:4中第 180位氨基酸開始的氨基酸序列，事實證明此片段是179與180位氨基酸 之間發(fā)生剪切后產(chǎn)生的羧基末端片段。此外，通過利用可識別所述人 FGF23N-末端一側的多克隆抗體對其的檢測，具有從第179位氨基酸開始到 N-末端氨基酸序列的多肽(氨基酸末端肽段)的存在也得到確認(國際專利 出版號WO02A4504)。
相似地，在所述不具His6標記序列的CHO-hFGF23培養(yǎng)上清液中，發(fā) 生于第179與180位氨基酸殘基之間的剪切也得到確認(國際專利出版號 WO02/14504)。因此，以下的操作被用于分離和純化沒有發(fā)生剪切的全長人 FGF23蛋白，所述全長人FGF23蛋白具有SEQ ID NO: 4中從第25位到第 251位的氨基酸序列(有時稱作全長FGF23)。
(4)重組全長人FGF23蛋白的純化
所述CHO-hFGF23培養(yǎng)上清液用SuperCap (注冊商標)(Pall Gelman Laboratory)過濾，所使用的SuperCap是一種孔徑為0.2 pm的膜過濾裝置， 過濾所得濾液通過SP-Sepharose FF (GE Healthcare Bioscience)。與層析柱結 合能力較弱的物質被50mM的磷酸鈉鹽緩沖液(pH6.7)漂洗和洗脫下來。 所述(洗脫)成分包括發(fā)生于第179與180位氨基酸殘基之間的剪切作用 產(chǎn)生的所述羧基末端片段。吸附在層析柱中的蛋白被濃度梯度為0-0.7M的 NaCl溶液洗脫下來，全長人FGF23蛋白在約0.3 M NaCl溶液的洗脫成分中 被觀察到。下一步，全長人FGF23蛋白被吸附到金屬親和性層析柱Talon Superflow (注冊商標)(Clonetech)中，并經(jīng)50 mM的磷酸鈉鹽緩沖液(pH 6.7)漂洗，通過加入不同濃度咪唑，將所述全長人FGF23蛋白洗脫純化。
包含目標蛋白的所述(洗脫)成分被SP-Sepharose FF柱吸收，洗脫后 純化。
人FGF23氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY
SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR
AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR R函PLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQELPSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF I (實施例3)
生產(chǎn)人抗體的小鼠的產(chǎn)生(KM小鼠)
用于制備人單克隆抗體的生產(chǎn)完全人抗體的小鼠具有內(nèi)源性Ig重鏈和 K-輕鏈都被破壞的純合體遺傳背景，同時具有包含人Ig重鏈基因位點的第 14號染色體片段(SC20)和人IgK-輕鏈轉基因(KCo5)。所述小鼠通過A品系 小鼠和B品系小鼠的雜交育種獲得，其中A品系小鼠具有人Ig重鏈基因位 點，B品系小鼠具有人IgK-輕鏈轉基因(KCo5)。所述A品系小鼠為內(nèi)源性 Ig重鏈和K-輕鏈都被破壞的純合體，且具有可被傳遞給后代的第14號染色 體片段(SC20)的小鼠品系。此小鼠品系在如Tomizuka等作出的報道中被描 述(Tomizuka,等，ProcNatl. Acad. Sci. USA., 97: 722-727， 2000)。此外，所述 B品系小鼠為內(nèi)源性Ig重鏈和K-輕鏈都被破壞的純合體，且具有所述人Ig K-輕鏈轉基因(KCo5)的轉基因小鼠品系。此小鼠品系在如Fishwild等作出的報 道中被描述(Nat. Biotechnol., 14; 845-851， 1996)。
在以下的免疫實驗中所用的小鼠個體是由雄性A品系小鼠和雌性B品 系小鼠或雄性B品系小鼠和雌性A品系小鼠雜交所獲得的小鼠，并且，在 此所用的小鼠血清中可同時檢測到人Ig重鏈和K-輕鏈[Ishida & Lonberg， IBCs 1 lth Antibody Engineering, Abstract 2000]。此外，所述產(chǎn)生人抗體的小 鼠也可通過締結合約的方法從Kirin Beer Company公司獲得。
(實施例4)
抗人FGF23的人單克隆抗體的制備 (l).產(chǎn)生抗人FGF23的人單克隆抗體的雜交瘤的獲得。 本實施例中所用單克隆抗體可用普通方法制備，如，由TamioAndo等 編寫的"單克隆抗體實驗室操作說明"("Introduction to monoclonal antibody experimental manipulation" ) ， (Kodansha出版，1991)。實施例2中制備的全 長人FGF23蛋白被用作免疫原，使用可產(chǎn)生實施例3中制得的人免疫球蛋 白的人抗體生成小鼠。
為制備人抗FGF23單克隆抗體，首先，將實施例2中得到的經(jīng)純化的 全長人FGF23蛋白與RIBI佐劑(Corixa)在腹腔內(nèi)混合，并在首次免疫時以
36每只小鼠20pg的劑量，將其腹腔接種于人抗體生成小鼠。與首次免疫相類 似，在兩周的時間間隔內(nèi)，將純化得到的FGF23蛋白與RIBI佐劑(Corixa) 混合物共接種小鼠3次。五只小鼠被用于免疫作用，第三次免疫后，抽取血 液樣本，利用下述酶標識免疫吸附法(ELISA法)，血清中抗FGF23人IgG 抗體的存在得到確認。利用ELISA方法，使用由用抗FGF23蛋白單克隆鼠 抗體—3CIE抗體而固定化的FGF23,血清中含有最高(抗FGF23人IgG抗 體)濃度值的小鼠被篩選出來，其中，所用抗FGF23蛋白單克隆鼠抗體—3CIE 抗體被公開于國際專利出版號WO03/057733 (作為FERM BP-7839被保藏 的雜交瘤產(chǎn)生的抗-FGF23抗體)。在進行如下所描迷的脾臟分離之前3天， 通過鼠尾靜脈(接種)給藥，以每個小鼠給藥20 pg全長人FGF23蛋白免疫小 鼠。
所述脾臟用外科手術從經(jīng)免疫的小鼠中分離出來，并被浸入含有350 mg/mL碳酸氬鈉、50單位/mL青霉素、50 ng/mL鏈霉素的10mL無血清 DMEM培養(yǎng)基中(Invitrogen，以下稱作無血清DMEM培養(yǎng)基)，然后用刮勺 (spatula)將其碾碎在濾網(wǎng)(mesh)上(細胞濾器Falcon)。通過此濾網(wǎng)(mesh) 的所述細胞懸浮液經(jīng)離心后，生成細胞沉淀，然后，用無血清DMEM培養(yǎng) 基漂洗這些細胞兩次，接著，對懸浮在無血清DMEM培養(yǎng)基中的這些細胞 進行細胞計數(shù)。當骨髓瘤細胞SP2/0 (ATCC No. CRL-1581)在含有10% FCS (Sigma)的DMEM(Invitrogen)培養(yǎng)基(以下稱作含血清DMEM培養(yǎng)基)中，于 37。C和存在5%(302條件下進行培養(yǎng)時，要使其細胞密度不高于1 x 106細 胞/mL。同樣，用無血清DMEM培養(yǎng)基漂洗這些骨髓瘤細胞，并懸浮在無 血清DMEM培養(yǎng)基中進行細胞計數(shù)?；厥盏玫降钠⑴K細胞懸浮液與鼠骨髓 瘤細胞懸浮液按5:1的細胞數(shù)目比例混合并離心后，將上清液完全去除。對 所述細胞團，在一邊用移液管尖端攪拌此細胞團時， 一邊緩慢加入作為融合 介質的1 mL 50% (w/v)的聚乙二醇1500 (Boehringer-Manheim),然后分兩次 緩慢加入預熱到37。C的1 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，再加入7 mL無血清 DMEM培養(yǎng)基。離心后，去除上清液，得到融合細胞。由此所得的融合細 胞用如下所述的有限稀釋法進行篩選。雜交瘤的篩選通過在含10% FCS 、 IL-6 (10 ng/mL)(或10%雜交瘤克隆因子(以下稱作HCF): Biobase)、次黃 嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶脫氧核苷(T)(以下稱作HAT Sigma)的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)來完成的。此外，用含HT(Sigma)、 10%FCS和10%HCF的DMEM培養(yǎng)基，并通過有限稀釋法，進行單個克隆。(細胞的)培 養(yǎng)在96孔微量滴定板(Becton， Dickinson)上進行。生成抗-FGF23人單克隆抗 體的雜交瘤克隆的選擇(篩選)和由各個產(chǎn)生雜交瘤的人單克隆抗體的品質 鑒定，通過如下所述的酶標識免疫吸附法(ELISA法)進行。結果，得到許多 雜交瘤，所述雜交瘤包含人免疫球蛋白Y鏈(hlg力和人免疫球蛋白輕鏈K,并 且可產(chǎn)生具有與人FGF23特殊反應活性的人單克隆抗體。從這些所得到的 許多雜交瘤中，作為產(chǎn)生識別FGF23蛋白的抗體的雜交瘤，特別獲得2個 克隆(CIO和C15)。此外，在包括本實施例在內(nèi)的以下所有實施例中，生成 本發(fā)明的抗-FGF23人單克隆抗體的各雜交瘤克隆用符號代表。在所述符號 的前或后所出現(xiàn)的"抗體"意指由雜交瘤生成的抗體，或由宿主細胞產(chǎn)生的 重組抗體，所述宿主細胞帶有從所述雜交瘤中分離出來的抗體基因(全長或 可變區(qū))。在本文明確指出的范圍內(nèi)，有時雜交瘤克隆的名稱可表示抗體的 名稱。在2007年2月2日，C10雜交瘤克隆已保藏于位于日本的國際專利 生物體保藏中心國立先進工業(yè)科學和技術研究院(International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) ), Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki ) (保藏號為FERMABP-10772) (ID標簽C10)。
(2)來自于所述雜交瘤培養(yǎng)物上清液的C10和C15抗體的純化 實施例4(1)中得到的C10和C15雜交瘤被限制培養(yǎng)在含有胰島素 (5 |ng/ml， Invitrogen)、人轉鐵蛋白(5 pg/ml， Invitrogen)、 二磷脂酰甘油(O.Ol mM， Sigma)、亞竭酸鈉(2.5 x 10-5 mM， Sigma)、 1% Low IgG胎牛血清 (Hyclone)的eRDF培養(yǎng)基(Kyokuto Seiyaku)中。所述雜交瘤被培養(yǎng)在長頸瓶 中，所得培養(yǎng)物上清液被回收。利用Protein G Fast Flow凝膠(GE Healthcare, Bioscience),使所述培養(yǎng)物上清液被親和性純化，此法使用PBS(-)為吸附緩 沖液，0.1 M甘氨酸緩沖液為洗脫緩沖液(pH2.8)。通過加入1 MTris(pH 9.0),將洗脫成分的pH值調整到約為pH7.2。使用Sephadex G25脫鹽層析 柱(NAP column; GE Healthcare Bioscience),由此制得的所述抗體溶液被 PBS所置換，然后通過孔徑為0.22 pm膜過濾器MILLEX-GV (Millipore)的 過濾滅菌作用，使其無菌化，從而得到純化的C10和C15抗體。通過測定 經(jīng)純化的抗體在280 nm的吸光值，來測定其濃度，其中，計算基準為1.4 OD= 1 mg/mL。
38(實施例5)
編碼C10抗體的抗體基因的獲得及其序列的測定 (1). C10抗體的cDNA序列的合成
為獲得表達于C10雜交瘤的含有人抗體重鏈和輕鏈的抗體可變區(qū)的所 述DNA片段，應用5'RACE法(5'cDNA末端快速擴增技術)進行克隆， 所述5'RACE法使用可與人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)特異性結合的引物。具體 是，進行克隆時所用的試劑盒為BD SMART RACE cDNA擴增試劑盒 (Becton Dickinson Bioscience Clonetech)，克隆按試劑盒所附的l喿作說明進 行。
根據(jù)操作說明，將RNA抽提試劑ISOGEN (Nippon Gene)加入到C10 雜交瘤中，取15 pg純化得到的總RNA用作cDNA合成的原料。以各個約 1 的純化獲得的總RNA為模板，制得第一鏈cDNA。除RNA之外的所有 試劑和酶均由BD SMART RACE cDNA擴增試劑盒(cDNA擴增試劑盒)提 供。
在第一鏈cDNA的合成中， 總RNA 1 |il
5'CDS 1 |iil
SMART Oligo 1 nl 由上述組分組成的反應混合物于70。C孵育2分鐘，然后，加入 5 x Buffer 2 pi DTT 1 pi dNTP Mix 1 pi
接著,于42。C孵育1.5小時。 進一步地，加入50 pi Tricine-EDTA緩沖液，然后于72°C孵育7分鐘， 獲得第一鏈cDNA。
(2)PCR方法擴增所述重鏈和輕鏈基因，并確認其核苷酸序列 (2)-l; PCR方法擴增所述重鏈和輕鏈基因
為擴增編碼所述C10抗體的基因的cDNA,下述的反應混合物被制備并 被用于PCR，所使用的一組PCR引物包括3'引物和5'引物，其中，所述3'引物序列具有對人抗體基因的特異性序列(所述特異性序列將在下面被描
述)，所述5'引物(通用引物A混合物)與添加于所述cDNA的5'末端的序列 特異性雜交結合，所述cDNA用BD SMART RACE cDNA擴增試劑盒合成， 此外，PCR所用酶為KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)。
無菌水H2028 pi
第1鏈cDNA2.5 pi
KOD-Plus-緩沖液(10X)5
dNTP Mix (2 mM)5 pi
MgS04 (25 mM)2
KOD-Plus-(l單位/pl)1 nl
通用引物A混合物(UPM)(10X)5 Ml
基因特異性引物(GSP)(10jiM)1.5 pi
總體積50 ^
對于所述重鏈基因的擴增反應，所使用的引物為SMART RACE cDNA 擴增試劑盒中的UPM引物和IgGlp引物(SEQIDNO:5)，而對于所述輕鏈 基因的擴增，所使用的引物為SMART RACE cDNA擴增試劑盒中的UPM 引物和hk-2引物(SEQIDNO: 6)。
hk-2: GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC (SEQ ID NO:引物6) 此外，所用的反應條件如下
重復5個循環(huán)，每個循環(huán)包括94。C/30秒，72°C/3 min, 重復5個循環(huán)，每個循環(huán)包括94。C/30秒，70。C/30秒，72。C/3 min 重復25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94。C/30秒，68。C/30秒，72°C/3 min 進一步地，2 pi所述反應混合物通過加入98 (il Tricine-EDTA緩沖液得 到稀釋，所得5pl稀釋液作為模板用于第二次(巢式)PCR反應
所述PCR反應溶液的組成如下
無菌水H20 30 pi
第一次PCR反應溶液(50倍稀釋) 5 pi
KOD-Plus-緩沖液(10X) 5 pi
dNTP Mix (2 mM) 5 pi
MgS04 (25 mM) 2 piKOD-Plus-(l單位/inl) 巢式通用引物A (NUP; 10 fiM) 基因特異性引物(GSP)(IO, 總體積
1 pi
1 pi 1 pi 50 ^
在上述反應中，用于所述重鏈基因擴增的一組引物為NUP引物(在 SMART RACE cDNA擴增試劑盒中；Becton Dickinson Bioscience Clonetech) 和hh2引物(SEQIDNO:7)。用于所述輕鏈基因擴增的一組引物為UPM引 物和hk-5引物(SEQ ID NO:8)。所述反應溫度條件如下起始溫度94°C lmin,然后重復20個循環(huán)，每個循環(huán)由94°C/5sec， 68。C/10秒和72°C/3min 組成，最后，72。C加熱7min。
hh2: GCTGGAGGGCACGGTCACCACGC ( SEQ ID NO:7)
(2)-2;所述抗原基因的核苷酸序列的測定
經(jīng)擴增的重鏈PCR片段(以下稱作HV[C]:由H鏈的5'-非翻譯區(qū)的 前導序列，可變區(qū)(HV)和恒定區(qū)的部分區(qū)域[C]組成)和經(jīng)擴增的輕鏈PCR 片段(以下稱作LV[C]:由L鏈的5'-非翻譯區(qū)的前導序列，可變區(qū)(LV)和 所述恒定區(qū)的部分區(qū)域[C]組成)通過乙醇沉淀法被回收，然后用瓊脂糖凝 膠電泳法回收。再通過使用膜的DNA純化試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen))進行純化。經(jīng)純化的HV[C]擴增片段或LV[C]擴增片段分別 被亞克隆到Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒(Zero Blunt TOPO PCR克隆 盒)(Invitrogen)的PCR 4 Blunt-TOPO載體上，對所獲得的克隆的質粒 DNA,作插入DNA的核苷酸序列分析。DNA的核苷酸序列測定所用的引物 是M13-20FW (SEQ ID NO: 9)和M13RV ( SEQ ID NO: 10)。
M13-20FW: GTAAAACGAC GGCCAGTG (SEQ ID NO:9)
M13RV: CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO: 10)
編碼C10抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA核苷酸序列，以及重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列展示如下
<C10重鏈核酸序列> (可變區(qū)從ATG起始密碼子到編碼羧基末端氨基 酸殘基的DNA序列)(SEQIDNO:ll)
41102030405060
A丁GGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCTGTAGCTCCAGGTGCTCACTCCCAG
708090100110120
GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCC
130140150160170180
TGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAACCACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCT
190200210220230240
GGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTATTAGTGGTAGCACAAGTAACGCA
250260270280290300
CAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATG
310320330340350360
GAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGATATTGTG
370380390400408
GATGCTTTTGATTTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
<(310重鏈氨基酸序列> (到前導序列和可變區(qū))(SEQ ID NO:12)(劃線 部分氨基酸殘基代表作為分泌信號的前導序列)
10 20 30 40 50 60
MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN HYMHWVRQAP 70 80 90 100 110 120
GQGLEWMGII NPISGSTSNA QKFQGRVTMT RDTSTSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCARDIV
130 136 MFDFWGQGT MVTVSS
<C10輕鏈核酸序列> (可變區(qū)從ATG起始密碼子到編碼羧基末端氨基
酸殘基的DNA序列)(SEQ ID NO: 13)
102030405060
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCC
708090100110120
AGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGA
130140150160170180
GTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGTCTGGTATCAGCAG
190200210220230240
AAACCAGGGAAAGCTCCTMGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTC
250260270280290300
CCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTG
310320330340350360
CAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATGATTACTTCACTTTCGGC
370380384
CCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
42<C10輕鏈氨基酸序列> (到前導序列和可變區(qū))(SEQ ID N0:14)(劃線 部分氨基酸殘基代表作為分泌信號的前導序列)
10 20 30 40 50 60
MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA匹AIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSALVWYQQ 70 80 90 100 110 120
KPGKAPKLLI YDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQFNDYF丁FG
128 PGT麵K
此外，在亞克隆于載體PCR4Blunt-TOPO的C10抗體的基因序列中， 所述人抗體恒定區(qū)的部分序列被克隆，且此區(qū)域的DNA核苷酸序列也得到 分析。其結果，可確認編碼由Kabat等編寫的EU index中所示的重鏈恒定 區(qū)118位到191位氨基酸殘基的序列，在此區(qū)域中，此序列被確認與人IgGl 的氨基酸序列完全一致，且C10抗體亞類為IgGl。此外，通過使用同樣的 方法，編碼C15抗體的抗體基因也被獲得，此抗體所屬序列也得到確定。
(實施例6)
重組C10抗體表達載體的構建 C10表達載體的產(chǎn)生(技術方案顯示在圖1)
利用PCR技術，使用KOD-Plus-DNA聚合酶，以獲得的含有C10抗體 LV[C]鏈的質粒DNA為模板，使用在其末端被設計成連上限制酶切位點(5' 末端BglII,3'末端BgIII )的引物CIO—L5—Bgl (SEQ ID NO: 15)和 C10—L3—Bsi ( SEQ ID NO:16),所述C10抗體的LV (輕鏈的前導序列+可 變區(qū))DNA被擴增。所述反應溫度條件為起始溫度94。C加熱1 min，每 個循環(huán)包括94。C/5秒和68。C/45秒重復此循環(huán)35次，最后，72°C加熱3min。 經(jīng)擴增的DNA片段用限制性內(nèi)切酶BglII和BsiWI消化處理后，再用瓊脂 糖凝膠電泳法純化，回收得到約400 bp DNA。另一方面，所述載體， N5KG1-Val Lark載體(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1修飾型載體(美國專利 6001358))同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglII和BsiWI消化處理，并經(jīng)>喊性磷酸酶 (E. coli C75) (Takara Shuzo Co.， Ltd.)去磷酸化作用處理，然后用瓊脂糖凝膠 和DNA純化試劑盒純化，回收得到稍小于9kb的DNA。這兩條DNA片段 經(jīng)T4DNA連接酶連接后，轉染到大腸桿菌DH10B,以獲得轉化子。對含 有插入DNA的轉化子的質粒DNA作DNA核苷酸序列分析后，獲得質粒DNA, N5KG1—C10_Lv，其中，C10抗體的LV被插入到編碼N5KG1 -Val Lark 人抗體輕鏈恒定區(qū)的5'上游處的框架內(nèi)。下一步，所述C10抗體的HVDNA (重鏈前導序列+可變區(qū))被插入質粒載體(N5KG1一C10-一Lv)，其中,此質粒 載體中已被插入LV。以含有所述C10抗體的HV[C]的被亞克隆于 pCR4Blunt-TOPO栽體的質粒DNA為模板，使用設計成末端連有限制酶切 位點(SalI位于5'末端，Nhel位于3'末端)的引物CIO—H5_Sal (SEQ ID NO:17)和C10—H3—Nhe(SEQIDNO:18)，用PCR擴增HV。所述反應溫度 條件為起始溫度94。C加熱1 min，每個循環(huán)包括94。C/5秒和68。C/45 秒，重復此循環(huán)35次，最后，72。C加熱7min。經(jīng)純化的擴增的HV DNA 片段被亞克隆于pCR4Blunt-TOPO載體，對由此獲得的克隆的質粒DNA, 作插入DNA的核苦酸序列分析。DNA的核苦酸序列測定所用的引物是上 面所述的M13-20FW和M13RV。對亞克隆，作插入部分DNA的核苷酸序 列的分析，這與作為模板的HV沒有差異，此外，選擇的質粒DNA (TOPO—C10一Hv),其中的引物部分具有所i殳計的序列。這些DNA被限制酶 Sail和Nhel消化后，用瓊脂糖凝月交電泳法純化，回收得到約420 bp的DNA ， 此DNA片段用T4 DNA連接酶連接到同樣地經(jīng)限制酶(SalI和Nhel)處理 和去磷酸化處理的N5KG1—C10—LvDNA(約9kb)上，然后，將所得連接產(chǎn) 物轉入到大腸桿菌DH10B，從由此得到的轉化子中篩選出所述目標的質粒 DNA。大量純化由上述方法得到的抗體表達質粒DNA -N5KG1—C10—IH (克 隆#1),并證實在克隆過程中，L鏈和H鏈整個區(qū)域，及其插入位點周圍 的DNA核芬酸序列沒有被引入變化(圖2,圖3)。進行DNA核苷酸序列的 確認時，使用SEQIDNO:19-25的各種引物。制得的所述C10抗體表達載 體的簡圖見圖4。此外，使用同樣的方法，構建重組C10抗體表達載體。 C10—L5—Bgl:
GAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT (SEQ ID NO: 15)
C10—L3一Bsi:
AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC (SEQ ID NO: 16)
C10—H5一Sal:
44ID NO:17)
C10—H3—Nhe:
AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC (SEQ ID NO: 18)
hh-4: GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG (SEQ ID NO: 19) hh-1: CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC (SEQ ID NO:20) CMV腦3F: GACACCCTCATGATCTCCCGGACC (SEQ ID NO:21) CMVHR1303: TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT (SEQ ID NO:22)
hk-1: TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC (SEQ ID NO:24) SEQU1783: GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA (SEQ ID NO:25)
(實施例7)
重組型CIO抗體的制備
通過將所述構建完成的CIO抗體表達栽體轉入宿主細胞，制得CIO抗 體表達細胞。對于表達宿主細胞，使用在無血清培養(yǎng)基-EX-CELL325PF培 養(yǎng)基(JRH,含有2 mM谷氨酰胺，100單位/ml青霉素，100 pg/ml鏈霉素，次 黃嗓呤和胸腺嗜啶脫氧核苷(HT)補充物(1:100) (Invitrogen))中條件性 (conditioned)培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶(DHFR)缺失的突變型CHO DG44細 胞系(以下稱作CHO細胞，IDEC Pharmaceuticals)。用電穿孔法進行所述 載體對宿主細胞的轉入。通過電穿孔法，用限制酶AscI使約2pgC10表達 載體線性化，并在350 V， 500 條件下，使用BioRad Electroporator( BioRad 電穿孔儀)，將所迷基因轉入4x 106CHO細胞中，然后，將所得細胞接種 于96孔細胞培養(yǎng)板。載體被轉入宿主細胞后，加入G418并繼續(xù)培養(yǎng)。對 克隆進行確認檢驗后，篩選得到抗體表達林系。篩選得到的CHO細胞系在 EX-CELL-325 PF培養(yǎng)基(含有2 mM谷氨酰胺，100單位/ml青霉素，100 pg/ml鏈霉素，次黃噪呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(HT)補充物(1:100) (Invitrogen))中，于5% C02條件下進行培養(yǎng)。所得培養(yǎng)物上清液被吸收在 Mabselect Protein A column (GE Healthcare Bioscience)中，用PBS漂洗后， 再用20 mM檸檬酸鈉鹽(citrate- Na )和50 mM NaCl (pH 3.4)緩沖液洗 脫。用50 mM pH 7,0磷酸鈉鹽緩沖液中和洗脫液。用去離子水稀釋1.5倍，將經(jīng)稀釋的洗脫液的導電率調整到4.0ms/cm以下。緊接著，所得樣品 進料后凈皮吸收到由Q-Sepharose (Hitmp Q HP, GE Healthcare Bioscience)和 SP-Sepharose (Hitrap SP FF， GE Healthcare Bioscience)連接組成的層析柱上， 用20 mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH5.0)漂洗，然后用PBS(-)洗脫。因此制得的 抗體溶液通過孔徑為0.22lim的膜過濾器，MILLEX-GV(Millipore),過濾除 菌。通過檢測其在280nm的光吸收值，計算經(jīng)純化的C10抗體濃度，計算 基準為[1.4OD280= 1 mg/mL]。另夕卜，通過使用同樣的方法，制備重組C15 抗體。
(實施例8)
獼猴FGF23蛋白表達載體的構建
將經(jīng)EDTA處理后的獼猴靜脈血和懸浮在PBS (-)中的5% Dextran T-2000 (GE Healthcare Bioscience)以2:1的比例混合，以沉淀血紅細胞。隨 后，上清液分層在淋巴細胞分離液(Ficoll-Plaque) (GE Healthcare Bioscience) 的上層，離心得到淋巴細胞成分。由此所得的淋巴細胞被懸浮在ISOGEN-LS (Nippon Gene),按照所附的實驗方案，得到獼猴總淋巴細胞RNA。按照所 附的實驗方案，利用所制得獼猴總淋巴細胞RNA和第一鏈cDNA合成試劑 盒(Invitrogen),制備得到獼猴淋巴細胞cDNA文庫。通過實施以下搡作過 程使編碼獼猴FGF23的cDNA擴增所述獼猴淋巴細胞cDNA文庫為模板， 使用猴yFGF23FW引物(SEQ ID NO:26)和猴FGF23RV引物(SEQ ID NO:27),以及KOD plus DNA聚合酶(Toyobo), 94。C孵育5 min,然后進 行45個PCR循環(huán)，每個PCR循環(huán)由94。C /20秒，55°C/30秒和72°C /50秒 組成。所述猴FGF23FW引物退火后與存在于編碼人FGF23的核苷酸序列 5'上游區(qū)域的序列相結合，并在擴增得到的DNA片段FGF23編碼區(qū)的5'處 加入EcoRI限制酶位點。所述猴FGF23RV引物包含一段退火后可與包括編 碼人FGF23編碼區(qū)終止密碼子的序列相結合的序列，并包含有Notl限制酶 位點。擴增所得的片段經(jīng)EcoRI和NotI消化，再插入在pEAK8/IRES/EGFP 載體的EcoRI和Notl限制酶位點處而#皮克隆，其中，所述 pEAK8/IRES/EGFP載體在表達載體pEAKS (Edge Biosystem)內(nèi)連接了內(nèi)核 糖體進入序列(IRES)和增強型綠色萸光蛋白(EGFP)。對由此得到的質粒的核 苦酸序列測序，以確定其編碼獼猴FGF23蛋白，此載體被稱為pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23。此外，在本實施例中獲得的獼猴FGF23的核 酸序列和氨基酸序列分別顯示于SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29中。
猴FGF23FW: CGGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCT (SEQ ID NO: 26)
猴 FGF23RV: ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGC (SEQ ID NO: 27)
獼猴FGF23核酸序列(SEQ ID NO:28)
ATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCCTTGTGCAGC
ACGGGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG 獼猴FGF23氨基酸序列(SEQ ID NO:29)
MLGARLRLWV CALCSVCSMS VIRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFGG NIFGSHYFNP ENCRFRHWTL ENGYDVYHSP QHHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR R麗PLIHFN TPRPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRA畫T PAPASCSQEL PSAEDNSPVA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEACRPFAKF I
(2)獼，吳FGF23表達細胞上清液的制備通過磷酸鈣法，將pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23瞬時轉染到PEAK快 速細胞(rapid cells) (Edge Biosystem)中，從而獲得它們的培養(yǎng)物上清液。
(實施例9)
CIO抗體對獼猴FGF23結合能力的研究。
通過以下用夾心ELISA的方法，研究了 CIO抗體不僅結合于人FGF23, 同樣也與獼猴FGF23結合。將實施例4中制得的C10抗體、2C3B抗體和人 IgGl對照抗體稀釋在50 mM NaHC03溶液中，得到濃度為5 pg/ml的稀釋溶 液，然后被加到96孔微孔板的各個孔中，4。C孵育12小時，以用于ELISA (Maxisorp(注冊商標)，Nunc)反應。由此，C10抗體、2C3B抗體和作為對照 的人IgGl對照抗體被吸收到微孔板中。接下來，除去所述這些溶液，并在 每個孔中加入阻斷劑(SuperBlock(注冊商標)阻斷緩沖液，PIERCE),室溫孵 育30 min,然后用含有0.1%Tween20的Tris緩沖生理鹽水(T-TBS)漂洗各個 孔兩次。將實施例2中純化制得的全長人FGF23蛋白或實施例8中制得的 表達獼猴FGF23的細胞上清液稀釋到合適的濃度后，加到被抗-FGF23抗體 覆蓋的微孔板的各個孔中，與固定化的抗體反應兩個小時，然后用含有0.1% Tween20的Tris緩沖生理鹽水(T-TBS)漂洗每個孔兩次。接下來加入3 (ig/ml 生物素標記的3C1E抗體，室溫孵育1.5小時，以使生物素標記的3C1E抗 體與人或獼猴FGF23結合，其中，所述人或獼齊吳FGF23被結合在固定化抗 體上。用T-TBS漂洗后，加入5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈親合 素(DAKO),使之反應l小時，并用T-TBS漂洗3次。每孔加入含有四曱基 聯(lián)苯胺(DAKO)的底物緩沖液，室溫孵育30min。每孔中加入0.5 M的硫酸， 終止反應。以570 nm波長為參照波長，用微孔板讀出機(MTP-300， Colona Electric Co.)檢測其在450 nm波長的吸光度。比較人全長FGF23蛋白和獼猴 FGF23表達細胞培養(yǎng)物上清液在以3倍的稀釋比進行稀釋時的反應活性。所 得結果顯示在圖5A和圖B。正如圖5A清楚顯示的那樣C10抗體或2C3B 抗體固定化時，對人全長FGF23蛋白的反應活性是相同的。在此條件下， 對于獼猴FGF23表達細胞培養(yǎng)物上清液的稀釋系列的反應性，在CIO抗體 反應活性和2C3B抗體反應活性之間，沒有觀察到太大差異(圖5B)。也即是, C10抗體，與2C3B抗體相同，^皮證明能夠結合于人和獼猴FGF23。(實施例10)
C10抗體和2C3B抗體對正常獼猴血中磷濃度和血中l(wèi)a,25-二羥基維生 素D濃度的作用效果比較。
FGF23具有以下的作用促進腎磷排泄和降低血液磷濃度，抑制腎中 維生素D活化酶和降4氐血中l(wèi)a,25-二羥基維生素D(以下稱作1,25D)濃度(國 際專利出版號WO02/14504 )。已證實將對2C3B抗體等FGF23，具有抑制作 用，也即是，中和活性的抗體，給藥于正常鼠，導致內(nèi)源性FGF23活性的 抑制、血清磷酸鹽濃度和血清1，25D濃度升高(國際專利出版號 WO03/057733 )。由此，這強烈表明對FGF23具有中和活性的抗體對由過量 FGF23導致的包括腫瘤引起的軟骨病、XLH等在內(nèi)的人類疾病具有治療作 用。因此，研究了本發(fā)明中得到的人抗體—C10抗體在體內(nèi)對FGF23的中和 活性。尤其是，由于對它在人體上的藥理作用的期望，通過使用猴的內(nèi)源性 FGF23功能的抑制、以及猴的血清磷酸鹽濃度和血清1,25D濃度的升高為指 標，測定其中和活性能，其中，猴與其它動物種如嚙齒類動物等相比，猴在 進化上與人更接近。進行實驗時，使用小鼠抗體-2C3B抗體，作為C10抗 體的比較對照。
使用下面的方法，在未經(jīng)處理的正常獼猴體內(nèi)C10抗體和2C3B對血 清磷酸鹽濃度的增長效果進行比較。使用實施例4中生產(chǎn)的C10抗體。所用 實驗動物為2-3歲的雌性獼猴，體重2-4kg。各有3只動物被用于所述溶劑 給藥組和2C3B抗體給藥組，4只動物被用于C10抗體給藥組。C10抗體和 2C3B抗體分別用PBS (-)配制成濃度為3 mg/ml的抗體溶液,以此作為給藥 溶液。所述PBS(-)溶劑被用作陰性對照。C10和2C3B抗體分別通過頭臂 靜脈以1 ml/min的流速，分別按1 mL/kg(相當于3mg/kg )給藥量給藥一次。 通過L型Wako無才幾石粦試劑(Wako Pure Chemical Industries)和Hitachi Clinical Analyzer Model 7180 (Hitachi, Ltd.),檢測血清磷酸鹽濃度。通過1， 25 (OH) 2D RIA Kit [TFB] (Immunodiagnostic System),檢測血清1,25D濃度。 所述檢測在抗體給藥后0,5、 1、 2、 3、 5、 7、 10、 14、 21、 28、 35、 42、和 49天分別進行。數(shù)據(jù)用平均值+/-標準誤差表示。圖6的數(shù)據(jù)顯示了每種抗 體給藥后10天內(nèi)定期收集的血液樣本中血清磷濃度的變化。在測試期間， PBS (-)給藥組血清磷濃度幾乎不變，而在所述C10抗體給藥組和2C3B抗體 給藥組，與給藥前和PBS (-)給藥組相比，觀察到明顯的血清磷濃度升高。在所述C10抗體和2C3B抗體給藥組，血清磷濃度最高值出現(xiàn)時間均為抗體 給藥后第5天。在此時間點上，PBS(-)組、2C3B抗體組和C10抗體組的 血清磷濃度分別為5.28 mg/dl， 8.10 mg/dl和9.59 mg/dl。比較抗體給藥5天 后2C3B抗體組和C10抗體組的血清磷濃度與同時期的PBS(-)組的血清磷 濃度的上升值，2C3B抗體組中血清磷濃度增長為2.82 mg/dl,而在C10抗 體組血清磷濃度增長為4.31 mg，(這些結果)表明，與所述2C3B抗體組 相比，C10抗體誘導的血清磷濃度增長是2C3B抗體誘導的血清磷濃度增長 的1.5倍以上(圖7)。因此，與所述2C3B抗體給藥組相比，C10抗體給藥組 對血清磷濃度增長的作用明顯更高。此外，給藥10天后，2C3B抗體給藥
組的血清磷濃度與PBS(-)組的血清磷濃度處于相同水平，而C10抗體給藥組 中的血清磷濃度(8.76 mg/dl)仍維持在比2C3B抗體給藥組血清磷濃度最高 水平(8.10 mg/dl)還要高的水平(圖6)。另外，由C10抗體引起的增加后血 清磷濃度的保持時間比由2C3B抗體引起的增加后血清磷濃度保持時間更 長，用2C3B抗體的所述保持時間是7天，這與PBS(-)給藥組有明顯差別， 而用C10抗體的所述保持時間是令人驚訝的35天，兩者相差約5倍。同樣 地，對于抗體給藥后的1, 25 D濃度，與2C3B抗體給藥相比，C10抗體給 藥后的1,25D濃度明顯上升，并且其保持時間明顯延長(圖8)。
這些結果表明，與現(xiàn)有的FGF23中和抗體-2C3B抗體相比，在獼猴體 內(nèi)，C10抗體具有更強的促血清磷濃度和血清I，25D濃度增長活性，也即是， 具有更強的FGF23中和活性。目前對XLH等低血磷癥性佝僂病的治療，要 求每天大劑量的磷和維生素D多次給藥，以勉強維持磷濃度處于正常范圍 內(nèi)。有報道表明給藥多次性導致病人應變性差。本研究中，C10抗體的單次 給藥即可得到對血清磷濃度和血清1，25D濃度持續(xù)性增長活性的事實表明， 作為低磷血癥治療性藥物，與常規(guī)的治療方法相比，C10抗體在治療的療效 上很可能具有顯著的優(yōu)勢。
(實施例11)
C15抗體對人和獼猴FGF23反應活性的確定
用磷酸鈣法將實施例11中制得的pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23或實施例 8中制得的pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23瞬時基因轉染于PEAK快速細胞 (EdgeBiosystem)。轉染3天后，收集每個培養(yǎng)物上清液。以實施例13中制得的C15抗體為一抗(圖9)，對所收集的培養(yǎng)物上清液作蛋白質印跡。結果 表明類似于C15與人FGF23結合，C15也與獼猴FGF23結合。
(實施例12)
C10抗體和C15抗體對正常獼猴血磷濃度和血中l(wèi)a，25-二羥基維生素D 濃度的作用效果比較。
實施例11表明C15抗體如同C10抗體那樣具有與人和獼猴FGF23重 組蛋白結合活性。隨后，對于C10抗體和C15抗體，通過將其給予正常獼 猴，比較其在體內(nèi)對FGF23的中和活性。對獼猴內(nèi)源性FGF23的中和活性 的評價，以血磷濃度的上升值為指標來進行，使用實施例7中制得的C10 抗體和C15抗體。所用實驗動物為2-3歲和體重2-3 kg的正常獼猴。每個實 驗組使用2只雄性和一只雌性共3只動物。所用稀釋介質為PBS (-)。制備 的C10抗體濃度為1 mg/ml和3 mg/ml， C15抗體濃度為3 mg/ml。所述抗體 通過隱靜脈以1 ml/min的流速，按1 mL/kg的容量給藥一次，以此獲得1 mg/kg和3mg/kg的C10抗體給藥劑量和3 mg/kgC15抗體給藥劑量。血清 磷濃度通過L型Wako無機磷試劑(L型Wako無機磷試劑)(Wako Pure Chemical Industries)和日立自動分析儀7180 (Hitachi Clinical Analyzer Model 7180 (Hitachi, Ltd.))被測定。采血在抗體給藥前和給藥1， 3, 5, 7, 10, 14, 21和28天后進行。測定在所有采血點的血清磷濃度。在C10抗體lmg/kg 給藥組，C10抗體3 mg/kg給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組，給藥前它們 的血清磷濃度分別為5.37， 5.70和5.58 mg/dL,各組之間沒有顯著差異。給 藥后，所有獼猴體內(nèi)均被觀察到有血清磷濃度的增長。因此，不僅C10抗體， 而且C15抗體也顯示出對獼猴內(nèi)源性FGF23的中和活性。在C10抗體1 mg/kg給藥組，C10抗體3 mg/kg給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組，給藥3 天后血清磷濃度分別為9.03， 9.10和8.64 mg/dL。在此時間點，C10抗體1 mg/kg給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組的血清磷濃度達到最高值。另一方 面，C10抗體3mg/kg給藥組的血清磷濃度繼續(xù)增長并在給藥5天后達到最 高值，此最高值為9.75 mg/dL。在C10抗體1 mg/kg給藥組，C10抗體3 mg/kg 給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組，給藥前和給藥后的血清磷濃度最大差額 分別為3.67, 4.65和3.06 mg/dL。由此結果可知，在同樣3mg/kg劑量下，與 C15抗體(對血清磷濃度的增長作用)相比，C10抗體不僅顯示出對血清磷濃度更高的增長作用。而且讓人驚訝的是，C10抗體1 mg/kg劑量給藥對血
清磷濃度的增長作用比C15抗體3 mg/kg劑量給藥(對血清磷濃度的增長作
用)還要高。接下來，對相比于給藥前水平的血清磷濃度增長的持續(xù)時間進
行了比較。其結果是所述CIO抗體1 mg/kg給藥組，CIO抗體3 mg/kg給
藥組和C15抗體3mg/kg給藥組的血清磷濃度增長的持續(xù)時間分別是14, 28
和7天。由此結果可知，在同樣3mg/kg劑量下，與C15抗體(對血清磷
濃度增長的持續(xù)時間)相比，CIO抗體不僅顯示出對血清磷濃度增長活性的
更高持續(xù)性。而且讓人驚訝的是，CIO抗體1 mg/kg劑量，比C15抗體3mg/kg
劑量,可將血清磷濃度更長期地保持在高水平。以上這些事實說明，在獼猴
體內(nèi)，C10抗體與同時獲得的C15抗體(對血清磷濃度的作用)相比，CIO 抗體具有更強的對血清磷濃度的增長活性和對血清磷濃度增長活性的持續(xù)
性。也即是，與C15抗體相比，CIO抗體具有明顯強的對獼猴FGF23的中 和活性。
(實施例13)
人FGF23 DNA片段(不含信號肽序列)的制備。
按照操作說明書，用KOD-plus-DNA聚合酶(Toyobo)制備反應溶液。 將FGF23(-SP) FW引物(SEQ ID NO:34)和FGF23(-SP) RV引物(SEQ ID NO: 35)各50 pmol,作為模板的人FGF23-cDNA (從起始密碼子到終止密 碼子共長756 bp， SEQ ID NO: 36),添加到50 ^反應溶液中，94。C孵育3 min 后，進行30個循環(huán)擴增，每個循環(huán)由98。C/15秒、63。C/15秒和68°C/2min 30秒組成。吝在72。C孵育3 min。所得684 bp擴增片段用0.8%凝膠分離 收集。按照操作說明書，使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen),從經(jīng)回 收的凝膠中回收所述擴增片段。用FseI(New England BiolabsJapan)對所回收 的擴增片段進行酶消化，按照操作說明書，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)回收經(jīng)酶處理的片段。由此得到與不含人FGF23的信號序列的 人FGF23成熟形式相對應的部分DNA片段。
FGF23(-SP) FW: TATCCCAATGCCTCCCCACTGCTCGGCTCCAGCTG (SEQ ID NO: 34)
FGF23(-SP)RV:
TTGGCCGGCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGCGGCAGCCTTCCG
52(SEQIDNO:35，包括FseI位點)
所述人FGF23核苷酸序列(下劃線標記為信號序列部分的，矩形框標記的是來自于所述(FGF23 )全長序列的不含所述信號序列的人FGF23成熟形式區(qū)域的核苷酸)(SEQIDNO:36)。
ATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCCTTGTGCAGC
TGGCTTTGTGGTGATTACAGGTGTGATGAGCAGAAGATACCTCTGCATG
GGTGGTCAGGGGCGGTCGAGTGAACACGCACGCTGGGGGAACGGGCC
CGGAAGGCTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG
所述人FGF23氨基酸序列基于SEQ ID NO:36為標準(下劃線標記為信號序列部分的氨基酸殘基，矩形框標記的是來自于所述(FGF23)全長序列的不含所述信號序列的人FGF23成熟形式區(qū)域氨基酸殘基)(SEQ IDNO:37)。
MLGARLRLWVCALCSVCSMSVLRAtYPNASPLLGSSWGGLIHLYTAT
PFAKFI(實施例14)
pPSs FGF23載體的構建
WO2006/78072實施例1-8中描述的pPSs5.5經(jīng)Sfol和Fsel消化，其末端經(jīng)來自于大腸桿菌的堿性磷酸酶去磷酸化處理。插入在實施例13中制得的包含有人FGF23基因的DNA片段，然后轉染入DH5a。從獲得的轉化子中制取DNA，確定連接區(qū)的核苷酸序列，從而得到pPSs FGF23栽體(圖10)。
(實施例15)
pUS FGF23 KI載體的構建
WO2006/78072實施例43-1中被描述的pCk loxPVAP經(jīng)Sail和Fsel酶消化，其末端經(jīng)來自于大腸桿菌C75的堿性磷酸酶去磷酸化處理。插入一個約為1.5kb的片段后，其中，此片段為上述實施例14中制得的pPSs FGF23載體經(jīng)Sail和FseI酶消化后用0.8%瓊脂糖凝膠分離回收后獲得，所述載體被轉染入大腸桿菌XL10-Gold超感受態(tài)細胞(UltracompetentCells)(STRATAGENE)。從獲得的轉化子中制得DNA。確定連接區(qū)核苷酸序列，從而得到pUS FGF23 KI載體(圖11)。
以下所示為985bp序列(SEQ ID NO:38 )和氨基酸序歹'K SEQ ID NO:39 )。所述985bp序列(SEQIDNO:38)，其中，pUS FGF23 KI載體人FGF23表達單位的從起始密碼子到終止密碼子的多核苷酸序列(FGF23信號序列)被含編碼區(qū)域的鼠IgK信號序列(SEQIDNO:38的劃線部分)取代，并且其下游含有FGF23成熟形式序列;所述氨基酸序列(SEQIDNO:39)，系為由所述cDNA編碼的氨基酸序列(247個氨基酸，劃線部分代表鼠IgK信號序列，SEQ ID NO:39)。包括內(nèi)含子區(qū)域在內(nèi)的鼠IgK信號序列的序列信息基于從GenBank得到的MUSIGKVR1(索取號K02159),其上游基因組序列從UCSC鼠基因組數(shù)據(jù)庫獲得。
SEG ID NO:38
ATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTT
54CATCTACAGTGCCCTGATGATCAGATCAGAGGATGCTGGCTTTGTGGT
CTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG
SEQ ID NO: 39
METDTLLLWVLLLWVPGSTGYPNASPLLGSSWGGLIHLYTATARNS
I
(實施例16)
用于電穿孔法的pUS FGF23 KI載體的制備
60pUS FGF23 KI載體在37°C條件下，用添加亞精胺(spermidine-added) (1 mM pH7.0， Sigma Aldrich Japan)的緩沖液(RocheDiagnostics,限制酶用H緩沖液(H buffer for restriction enzyme))和NotI
55(TakaraBio，Inc.)消化5小時。經(jīng)苯酚/氯仿抽提后，加入2.5倍體積的100%乙醇和0.1倍體積的3 M乙酸鈉，所得混合物在-20。C放置16小時。所述載體經(jīng)Notl線性化處理，被離心收集，再加入70%乙醇滅菌。在凈化工作臺內(nèi)去除70%乙醇并風干處理1小時。加入HBS溶液以配制成0.5 pg/jtiLDNA溶液，所得溶液室溫放置1小時后，用于制備電穿孔法所用的pUSFGF23 KI載體。
(實施例17)
用pUS FGF23 KI載體和RS因子敲除鼠胚胎細胞系獲得PL FGF23鼠胚胎細胞系。
為獲得PLFGF23鼠胚胎細胞系(其中人FGF23-cDNA通過同源重組的方法被插入到免疫球蛋白K輕鏈基因下游)，按照已建立的方法(ShinichiAizawa, "Biotechnology Manual Series 8, Gene Targeting," Yodosha， 1995)， 3夸經(jīng)限制酶NotI線性化處理的pUS FGF23 KI載體(按照實施例16中所示的方法制得)轉入到RS因子敲除鼠胚胎細胞，.通過使用WO2006/78072實施例IO中所描述的方法，得到RS因子敲除鼠胚胎細胞。
RS因子敲除鼠胚胎細胞的培養(yǎng)方法按照已被描述過的方法(ShinichiAizawa,見上文)，所用滋養(yǎng)細胞為培養(yǎng)在經(jīng)絲裂審素C(Sigma Aldrich japan)處理的培養(yǎng)基中的G418抗性原代培養(yǎng)細胞(從Invitrogen購入)。首先，培養(yǎng)RS因子敲除鼠胚胎細胞并經(jīng)胰蛋白酶處理，細胞以3 x 107細胞/ml的濃度懸浮在HBS中。將0.5 ml所述細胞懸浮液與10 載體DNA混合。然后，用基因脈沖試管(Gene Pulser Cuvette)(電極距離0.4 cm, Bio RadLaboratories)進行電穿孔(電容960 pF，電壓250V，室溫)。所述電穿孔處理后的細胞被懸浮在10 ml胚胎細胞培養(yǎng)基中(Shinichi Aizawa,見上文)，然后這些細胞被接種于塑料培養(yǎng)皿(Falcon,Becton Dickinson)中，用于100 mm組織培養(yǎng)，其中滋養(yǎng)層細胞為先前已被預先鋪入。36小時候后，所用培養(yǎng)基換成含有0.8 pg/ml嘌呤霉素的(Sigma Aldrich Japan)胚胎細胞培養(yǎng)基。將被挑取的培養(yǎng)7天后出現(xiàn)的每個克隆都接種入24孔板培養(yǎng)至完全匯合。將所得細胞三分之二懸浮于0.2 ml的接種培養(yǎng)基(FBS + 10% DMSO， SigmaAldrich Japan)中，所得懸浮液-80。C保存。剩下的三分之一接種于12孔明膠涂層培養(yǎng)板中。所述細胞被培養(yǎng)2天后，使用Puregene DNA提取試劑盒
56(Qiagen)提取得到106 - 107細胞的基因組DNA。由此得到的抗。票呤霉素RS 因子敲除鼠胚胎細胞基因組DNA經(jīng)限制酶EcoRI (Takara Bio， Inc.)消化后， 用瓊脂糖凝膠電泳法分離。隨后，以Ck 3'探針為探針進行Southern印跡檢 測，以檢測同源重組子，其中，Ck 3'探針是在本發(fā)明中使用的，已在 WO00/10383得到描述的(見實施例48)Ig輕鏈Jk-Ck基因組DNA 3'末端的 DNA片段(XhoI酶切位點到EcoRI酶切位點,長約1.4 kb, WOOO/10383,圖 5)。經(jīng)EcoRI消化后，在野生型RS因子敲除鼠胚胎細胞中檢測到一條長15.1 kb的條帶。在同源重組體中，除15.1kb的條帶外，預計應該還有一條新的 條帶(12.8 kb)出現(xiàn)在15.1 kb的條帶下面(圖12),且所述新條帶在噤呤霉 素抗性品系中被檢測到。也即是，這些克隆被證實其免疫球蛋白k鏈基因下 游處一個等位基因座插入有人FGF23-cDNA。
(實施例18)
通過敲除PL FGF23小鼠胚胎干細胞系中的抗藥性基因獲得US FGF23 小鼠胚胎干細胞系。
在獲得的由PL FGF23小鼠胚胎干細胞系而來的US FGF23小鼠胚胎干 細胞系中，2種抗性基因(Pun)1", Neof)被敲除，這是參照現(xiàn)有成熟的實驗 方法(Shinichi Aizawa,"生物技術手冊"系列8，基因打靶技術"Yodosha ， 1995年，Shinichi Aizawa，"Biotechnology Manual Series 8， Gene Targeting," Yodosha, 1995)進行的，在這一過程中將pCAGGS-Cre載體(Simaga等，Mol Reprod Dev., 46: 109-113， 1997)引入PL FGF23小鼠胚胎干細胞系中。
PL FGF23小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)方法參照現(xiàn)有方法(Shinichi Aizawa, 上述文件)，培養(yǎng)液中加入經(jīng)絲裂霉素C(Sigma Aldrich Japan)處理的G418 抗性原代培養(yǎng)細胞(購自Invitrogen)作為滋養(yǎng)層細胞。首先，將培養(yǎng)好的 PLFGF23小鼠胚胎干細胞用胰酶消化，所述細胞以3 x 107細胞/ml的濃度 懸浮于HBS中，將0.5 ml的細胞懸浮液與10 |ig的栽體DNA混合，采用 基因脈沖試管(Gene Pulser Cuvette)(電極間距0.4 cm, Bio Rad Laboratories )進行電穿孔法(電容960 faF,電壓250 V，室溫操作)。經(jīng) 電穿孔的細胞懸浮在lOml胚胎干細胞培養(yǎng)液(Shinichi Aizawa,見上文) 中，2.5 ml的細胞懸浮液接種到預先鋪入滋養(yǎng)層細胞的60 mm組織培養(yǎng)用 的塑料培養(yǎng)皿中(Falcon, Becton Dickinson)。經(jīng)過30小時的培養(yǎng)，將1000個胚胎干細胞接種到預先鋪入滋養(yǎng)層細胞的100mm組織培養(yǎng)用的塑料培養(yǎng) 皿中(Falcon, Becton Dickinson)。挑取6天之后出現(xiàn)的克隆，每個克隆接 種入24孔板培養(yǎng)至完全匯合。其三分之二懸浮于0,2 ml的凍存培養(yǎng)液(FBS + 10%以Ck 3'探針進行Southern印跡檢測，以檢測同源重組子，其中，Ck 3' 探針是在本發(fā)明中使用的，已在WO00/10383得到描述的(見實施例48)Ig輕 鏈Jk-Ck基因組DNA(XhoI酶切位點到EcoRI酶切位點，長約1.4 kb， WO00/10383，圖5)3'末端DNA片段。DMSO ( Sigma Aldrich Japan),誦80。C 保存?zhèn)溆?；其余的三分之一接種于12孔明膠涂層板。所述細胞被培養(yǎng)2天 后，使用Puregene DNA提取試劑盒(Qiagen)提取得到106 - 107細胞的基因 組DNA。由此產(chǎn)生的小鼠胚胎干細胞基因組DNA用限制性內(nèi)切酶 EcoRI(TakaraBio，Inc.)酶切消化，用瓊脂糖凝膠電泳法分離目標條帶。隨后， 以Ck 3'探針為探針進行Southern印跡檢測，^r測出其中只有位于loxPV基 因序列之間的Pun/基因被敲除的胚胎干細胞系，所述使用探針Ck 3'的檢測， 其中Ck 3'探針是在本發(fā)明中使用的，已在WO00/10383得到描述的(見實 施例48)Ig輕鏈Jk-Ck基因組DNA的3'末端DNA片段(XhoI酶切位點到 EcoRI酶切位點，長約1.4kb, WO00/10383,圖5)。當胚胎干細胞基因組中保 留有Puror基因，由EcoRI酶切可以檢測到兩個條帶(15.1 kb和12.8 kb ); 而只有當胚胎干細胞基因組中敲除了 Purc/基因，由EcoRI酶切可以檢測到 兩個條帶分別為15.1 kb和10.9 kb (圖12)。此外，通過上述過程中獲得 的Southern雜交膜，用例9所示的專利WO2006/78072中的3'KO探針方法 檢測，在胚胎干細胞系基因組DNA中，只有位于1oxPVPurc/基因序列之間 的Nec/基因被敲除，通過使用探針3'KO檢測，當胚胎干細胞基因組中保留 有Ne(/基因，由EcoRI酶切可以檢測到兩個條帶(7.4 k和5.7 k);而只有 當胚胎干細胞基因組中敲除了 Nec/基因，由EcoRI酶切可以檢測到兩個條 帶分別為5.7k 和4.6 k (圖12)。通過上述實驗，由PL FGF23小鼠胚月臺 干細胞系可以獲得2種耐藥基因(Puro1", Neo1")同時被敲除的胚胎干細胞系 (US FGF23小鼠胚胎干細胞系。
(實施例19)
用US FGF23小鼠胚胎干細胞系和宿主胚胎制備US FGF23 KI嵌合小 鼠，其中宿主胚胎來自B淋巴細胞缺陷小鼠品系。在一個免疫球蛋白fi鏈基因被敲除的純合小鼠中，B淋巴細胞功能有缺
陷，并且不能產(chǎn)生抗體(Kitamura等，Nature, 350: 423-426, 1991)。在本實施 例中，宿主胚胎通過上述培養(yǎng)在潔凈環(huán)境中的純合雄性和雌性小鼠雜交繁育 而來，用于嵌合體小鼠的制備。在這種情況下，嵌合小鼠的大部分B淋巴細 胞功能來自其所注射的胚胎干細胞。在本例中，由Tomizuka等報道的免疫 球蛋白H鏈基因敲除的純合小鼠(Proc. Natl. Acad， Sci. USA, 97: 722-7, 2000)，是通過3次以上的與MCH(ICR)品系(CLEA Japan, Inc.)回交，被用 于宿主胚胎的制備。
通過上述實施例18所獲得的US FGF23胚胎干細胞系被復蘇，這些胚 胎干細胞系被確認其中插入了人類免疫球蛋白K鏈基因的下游序列的 FGF23-cDNA。 US FGF23胚胎干細胞;陂注射入8細胞期宿主胚胎，這些宿 主胚胎由上述免疫球蛋白H鏈基因敲除的純合雄性和雌性小鼠雜交繁育而 來，注射細胞量為8-10胚胎干細胞/宿主胚胎。注射胚胎在胚胎干細胞培養(yǎng) 液中培養(yǎng)過夜(Shinichi Aizawa，"生物技術手冊"系列8,基因打靶技術" Yodosha ， 1995年)，注射胚胎發(fā)育成為胚泡后，將被注射的胚胎移植到 2.5天假孕處理的代孕MCH (ICR)母鼠子宮中(CLEA Japan, Inc.),每一側子 宮分別植入約IO個注射胚胎。利用上述實例18的USFGF23小鼠胚胎干細 胞系通過注射胚胎的方法獲得嵌合小鼠。嵌合小鼠是由毛色的差別來鑒定 的，其中是否具有胚胎干細胞源性的野生型顏色(深褐色)能夠在宿主胚胎
源性(白色)毛色中鑒定出來。在嵌合小鼠的后代中，每個小鼠有明顯的部 分野生型源性毛色的毛色分布，也就是說，通過可辨認的胚胎干細胞源性的 野生型顏色(深褐色)可以區(qū)別嵌合小鼠和純合小鼠。從這些實驗結果，插 入了人類免疫球蛋白K鏈基因的下游序列的FGF23-cDNA的US FGF23胚胎 干細胞系具有維持嵌合小鼠生成的能力。也就是說，在小鼠個體中，US FGF23胚胎干細胞具有分化成正常組織的能力。此外，USFGF23KI嵌合小 鼠的血中具有高濃度的FGF23,這在稍后的范例21中我們要進一步地地提 到，USFGF23 KI嵌合小鼠具有類似于低磷佝僂病的特征，可以作為這一疾 病研究的動物模型。
(實施例20) 對照嵌合小鼠的制備
59根據(jù)前述(專利WO2006/78072 )實施例11中的方法，沒有插入具有人 類FGF23-cDNA功能基因的嵌合小鼠(來源自野生型小鼠)，在下述實施 例21中對US FGF23 KI嵌合小鼠的C10抗體給藥實驗中用作各個對照嵌合 小鼠。
(實施例21)
使用US FGF23 KI嵌合型小鼠對CIO抗體病理改善功效的證明 在實施例IO和實施例12中已證明，在獼猴(cynomolgus monkey)體 內(nèi)，與2C3B抗體和C15抗體相比，C10抗體能更顯著地抑制內(nèi)源性FGF23 的效果，并且提高血清中磷濃度和血清1,25D濃度。已經(jīng)強烈暗示具有對 人FGF23中和活性的抗體，對人類疾病例如腫瘤引起的軟骨病、諸如XLH 等的低血磷佝僂病、以及過量的FGF23引起的軟骨病具有治療效果。因此， 本文研究了 C10抗體對那些由過量FGF23引起的病狀的改善作用。C10抗 體的治療試驗是使用在實施例19中制得的US FGF23 KI嵌合型小鼠(以下 縮寫為hFGF23KI小鼠)。12只hFGF23KI小鼠被用作疾病模型動物，6只 同周齡的正常小鼠(野生型小鼠，在實施例20中所制得的)作為對照動物， 進行對比實驗。收集7周齡的hFGF23 KI小鼠的血清，分別檢測血清中FGF23 濃度(FGF-23 ELISA KIT, Kainos Laboratories, Inc)和血磷濃度。與野生 型小鼠相比，hFGF23KI小鼠血清FGF23濃度顯著升高(野生型小鼠;n=6， 163pg/mL, hFGF23KI小鼠；n=12, 1467pg/mL)。這個結果表明，在hFGF23 KI小鼠中引入人FGF23基因是被正確地進行，并且也表示在hFGF23 KI小 鼠血清中存在有過量的外源性人FGF23。此外，與野生型小鼠相比，hFGF23 KI小鼠的血磷濃度顯著下降(野生型小鼠；n=6, 5.82 mg/dL， hFGF23KI 小鼠；n=12, 2.62mg/dL)。由于過量人FGF23的作用hFGF23KI小鼠出現(xiàn) 了低血磷癥狀。此時，將12只hFGF23KI小鼠分成C10抗體給藥組和對照 的IgGl給藥組兩組，每組六只，每只都有等量FGF23濃度(圖13)。然后， 從第八周開始，對兩組小鼠重復靜脈注射C10抗體或同種型對照用的純化的 人IgGl (對照抗體)，注射劑量為30 mg/kg，給藥頻率為一周一次，共給 藥五次。取第一次給藥前和給藥三天后的血樣，提取血清。用Saitoh握力器 (Saitoh-GRIP STRENGTH METER, MK-380S， Muromachi Kikai Co., Ltd.) 測評第四次給藥24小時后小鼠的四肢緊握力量。四肢緊握力量是以小鼠盡全力時最大力量(握力)為指標，其中，將小鼠置于一個測量的柵格中，讓 小鼠抓住柵格，然后用手水平拉動小鼠尾部，直至小鼠不能承受拉力而松開
柵格。在第五次給藥24小時后評測小鼠的骨骼狀況。麻醉小鼠，通過心臟 取血法將其處死，取出其大腿骨(fermur)和脛骨(tibia)，在70%的乙醇 中固定。分別^r測第一次給藥前，第一次給藥三天后和第五次給藥24小時 后的血清中磷濃度。將未去除鈣質的大腿骨包裹在樹脂中，用 Villanueva-Goldner染色后，進行組織學評價。脛骨中的礦物質含量經(jīng)灰化 后測得。
實驗結果表明，對照抗體給藥組的hFGF23KI小鼠，在分組時和一同處 死時(即，在給藥之前時和在第五次給藥24小時之后時)，其血清中磷濃 度顯著低于對照抗體給藥組的野生型小鼠，這種情況表明hFGF23KI小鼠持 續(xù)的低血磷狀況(圖14)。另一方面，C10抗體給藥組的hFGF23KI小鼠 在給藥三天后，其血清中磷濃度提高到與對照抗體給藥組的野生型小鼠同等 水平(圖14)。此外，C10抗體給藥組的hFGF23KI小鼠在第五次給藥后 血清中磷濃度仍與對照抗體給藥組的野生型小鼠處于同等水平，這就表明， C10抗體對增加血清磷濃度的作用即使在五次給藥之后仍然存在(圖15 )。
作為低血磷病人的一個癥狀，骨骼肌弱化已有臨床報道(Baker和 Worthley， Crit Care Resusc.,4: 307-315, 2000)。在本實驗究中，由于血磷酸 鹽過少,我們預計hFGF23KI小鼠會出現(xiàn)肌肉弱化癥狀。因此，用上述方法測 量并比較每組小鼠的四肢緊握力，作為肌肉弱化的指標。其結果，對照抗體 給藥組的hFGF23KI小鼠的緊握力顯著低于對照抗體給藥的野生型小鼠，在 這個疾病模型小鼠中觀察到肌肉弱化的癥狀(圖16)。與之相反，C10抗 體給藥組的hFGF23KI小鼠的緊握力顯著提高(圖16)。
然后，用Villaneuva-Goldner方法對未去除鈣質的大腿骨組織染色并進 行組織學觀察。結果是，與對照抗體給藥組的野生型小鼠相比，在對照抗體 給藥組的hFGF23KI小鼠骨骼中觀察到大量類骨質(osteoid,在圖17中用 紅色表示)，表明該組小鼠被誘導出鈣化缺陷。這正是佝僂病的特征癥狀。 相反，在C10抗體給藥組的hFGF23KI小鼠大腿骨組織中，觀察到類骨質所 占的區(qū)城減少，并推測類骨質是被輛化的骨質所取代(在圖17中以綠色表 示)。這些結果表明，C10抗體可以改善由過量FGF23引起的骨質鈣化降 低。脛骨中的礦物質用灰化的方法測量并在各組之間進行比較。對照抗體給藥組的hFGF23KI小鼠脛骨中礦物質含量顯著低于對照抗體給藥組的野生型 小鼠(圖18)。相反，實驗證明C10抗體給藥組的hFGF23KI小鼠脛骨中 礦物質含量有所提高(圖18)。通過以上實驗，證明在hFGF23KI小鼠體內(nèi)， C10抗體抑制了過量表達的人FGF23在體內(nèi)的作用，并改善了低血磷癥性 詢僂病的各種癥狀，如低血磷癥，肌肉弱化，骨骼釣化紊亂等癥狀。這些結 果表明C10抗體是一種與FGF23相關的各種人類疾病的有效治療劑。
工業(yè)實用性
本發(fā)明所述C10抗體是一種抗FGF23的抗體，與其它抗FGF23的抗體 相比，C10抗體在體內(nèi)對持續(xù)性提高磷濃度和/或持續(xù)性提高血清1，25D濃度 有很高的活性。本發(fā)明所述C10抗體是一種對于預防或治療由FGF23活性 過度引起的疾病，或者通過控制FGF23活性能夠改善病狀的疾病有顯著療 效的藥物。
權利要求
1.一種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有雜交瘤細胞C10(索取號FERM BP-10772)產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。
2. —種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有SEQIDNO:l: 的從第20位Q到第136位S的氨基酸序列所示的重鏈氨基酸序列和/或SEC IDNO:14的從第23位A到第128位K的氨基酸序列所示的輕鏈氨基酸序 列。
3. —種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其中，所述抗人FGF22 抗體或此抗體的功能性片段含有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； 且此重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:12的從第20位Q到第136位S 的氨基酸序列所示，此輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNO:14的從第23 位A到第128位K的氨基酸序列所示。
4. 由雜交瘤細胞CIO (索取號FERMBP-10772)產(chǎn)生的抗人FGF23抗 體或此抗體的功能性片段。
5. —種抗體或此抗體的功能性片段，其結合于人FGF23上的全部或部 分表位，所述人FGF23上的全部或部分表位結合由雜交瘤細胞C10 (索取 號FERMBP-10772)產(chǎn)生的抗體。
6. 如權利要求1-5中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性 片段，其中所述功能性片段是選自Fab、 Fab'、 F(ab')2、 二硫鍵穩(wěn)定的F、 (dsFv)、 二聚化的V區(qū)域(雙體)、單鏈Fv(scFv)和CDR的肽段。
7. 如權利要求1-5中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性 片段，其包含重鏈和/或輕鏈，所述重鏈和/或輕鏈具有的氨基酸序列中一個 或幾個氨基酸殘基被缺失、取代或添加。
8. 如權利要求1-7中任何一項所述抗人FGF23抗體，其中，所述抗體 的種類是IgG、 IgA、 IgE或IgM。
9. 如權利要求8所述抗人FGF23抗體，其中，所述抗體的亞類是IgGl、 IgG2、 IgG3、或IgG4。
10. —種藥物組合物，其含有如4又利要求1-9中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片^a作為活性成分。
11. 一種藥物組合物，其可通過FGF23控制磷代謝和/或維生素D代謝并含有如權利要求1-9中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片 段作為活性成分。
12. —種用于礦物質代謝紊亂相關性疾病的預防或治療的藥物組合物， 其含有如權利要求1-9中任何一項所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片 段作為活性成分。
13. 如權利要求12所述藥物組合物，其中，所述礦物質代謝紊亂相關性 疾病選自腫瘤性軟骨病、ADHR、 XLH、骨纖維性結構不良、麥-奧二氏綜合 征和常染色體隱性低血磷癥。
14. 一種藥物組合物，其用于預防或治療選自骨質疏松癥、佝僂病、高 釣血癥、低鉀血癥、異位鉀化癥、骨硬化、派杰病、曱狀旁腺機能亢進癥、 曱狀旁腺機能減退癥和搔癢癥的疾病，此藥物組合物含有如權利要求1-9中 任何一項所述的抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段作為活性成分，
15. 雜交瘤細胞CIO (索取號FERM BP-10772)。
16. —種編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列的核酸，其中，此重鏈可變區(qū)氨基 酸序列由SEQ IDNO:ll所示從第58位C到第408位A的堿基序列編碼。
17. —種編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的核酸，其中，此輕鏈可變區(qū)氨基 酸序列由SEQIDNO:13所示從第67位G到第384位A的堿基序列編碼。
18. —種載體，其含有如權利要求16或17中所述核酸。
19. 一種宿主細胞，其含有如權利要求17中所述載體。
20. —種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段的制造方法，包括步驟 培養(yǎng)如權利要求19中所述的宿主細胞以表達抗人FGF23抗體或此抗體的功 能性片段。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗FGF23抗體和通過使用此抗體對FGF23活性的抑制起到預防或治療作用的一種作為預防或治療藥物的藥物組合物。一種由雜交瘤細胞C10(索取號FERM BP-10772)產(chǎn)生的抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段。
文檔編號C12N15/09GK101652476SQ20088000481
公開日2010年2月17日 申請日期2008年2月14日 優(yōu)先權日2007年2月14日
發(fā)明者吉田均, 山下武美, 山崎雄司, 島田孝志, 浦川到, 長谷川尚, 青野友紀子 申請人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社