專利名稱：一種定點(diǎn)刪除轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定點(diǎn)刪除轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的外源基因
的方法。
背景技術(shù)：
自從1997年，體細(xì)胞克隆羊"多莉"誕生以來(lái)，利用轉(zhuǎn)有目的基因的體細(xì)胞做供 體，通過體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜逐漸成為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物的主要方法。目前 在獲得轉(zhuǎn)有目的基因的體細(xì)胞的過程中，普遍采用的方法是將真核抗性基因(也稱標(biāo)記基 因，如neomycin等)與目的基因構(gòu)建在同一個(gè)載體上，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對(duì)標(biāo)記基因的篩選 從而獲得穩(wěn)定整合了外源目的基因的體細(xì)胞。然而，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中標(biāo)記基因的存在給轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物的后續(xù)研究帶來(lái)了許多不便[1]。一，目前可以作為真核篩選基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研 究的標(biāo)記基因非常有限，當(dāng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中已存在某一選擇標(biāo)記基因時(shí)，該標(biāo)記基因在隨后 的再次轉(zhuǎn)基因中就不能再作為選擇標(biāo)記，限制了多基因轉(zhuǎn)基因的研究，尤其在哺乳動(dòng)物基 因敲除的研究中，常染色體等位基因的雙敲除需要兩個(gè)不同的標(biāo)記基因，在對(duì)另一等位基 因進(jìn)行敲除前，必須進(jìn)行標(biāo)記基因的刪除；二，用于高效表達(dá)標(biāo)記基因的外源啟動(dòng)子和增強(qiáng) 子元件的存在可能影響目的基因整合位點(diǎn)附近調(diào)控元件的作用，從而可能影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 的表型分析。此外，對(duì)于乳腺生物反應(yīng)器研究來(lái)說(shuō)，標(biāo)記基因的存在使得目的蛋白的分離純 化和檢測(cè)增加了一定的難度；對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品安全性評(píng)價(jià)研究，標(biāo)記基因的存在增加 了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類健康的潛在危險(xiǎn)，使轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)的研究更為復(fù)雜。 因此，培育無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的進(jìn)一步發(fā)展及轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物食品安全具有重大的意義。 Cre重組酶于1981年從Pl噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于A Int酶超基因家族。Cre重組酶 基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp (EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X03453)，編碼38kDa蛋白質(zhì)。Cre重組酶 是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個(gè)34bp的LoxP位點(diǎn)(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACG AAGTTAT)之間的特異性重組，是LoxP位點(diǎn)間的序列或基因被刪除。 目前，對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞中標(biāo)記基因的刪除多采用1996年Abuin等在小鼠胚胎 干細(xì)胞中建立的方法。即用真核表達(dá)cre重組酶的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用1，3，5-三-苯甲酰 基-2-去氧-2-氟-P-D-核糖(FIAU)篩選標(biāo)記基因獲得刪除的細(xì)胞。該方法需要在構(gòu)建 表達(dá)載體時(shí)引入與FIAU作用的負(fù)篩選基因，同時(shí)需FIAU進(jìn)行藥物篩選，無(wú)疑增加了載體構(gòu) 建難度和細(xì)胞篩選步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種定點(diǎn)刪除轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因的方法。 本發(fā)明的方法是將熒光蛋白基因與cre基因重組構(gòu)建表達(dá)載體，導(dǎo)入到目的細(xì)胞
中，通過檢測(cè)熒光蛋白來(lái)篩選基因被定點(diǎn)刪除的細(xì)胞。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，首先構(gòu)建表達(dá)熒光蛋白與cre重組酶重組表達(dá)的表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所采用的熒光蛋白為綠熒光蛋白(GFP)。將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入目的細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分選表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，這些細(xì)胞就是基因被定點(diǎn)刪除的細(xì)胞。 在本發(fā)明中，被定點(diǎn)刪除的基因是指在LoxP-Nn-LOXP (l表示序列長(zhǎng)度為n的核苷酸序列)結(jié)構(gòu)當(dāng)中的DNA序列，其可以是外源基因，或者是標(biāo)記基因。例如在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，被刪除的基因?yàn)閚eo標(biāo)記基因。 在本發(fā)明中，目的細(xì)胞是指含有LoxP-Nn-LOXP結(jié)構(gòu)需要將Nn定點(diǎn)刪除的細(xì)胞。 在本發(fā)明中，將表達(dá)載體導(dǎo)入目的細(xì)胞的手段包括各種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法，例如
磷酸鈣、脂質(zhì)體介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，基因槍、電穿孔、顯微注射等物理方法。 在本發(fā)明實(shí)施例中，通過構(gòu)建表達(dá)GFP和ere的表達(dá)載體，導(dǎo)入穩(wěn)定整合了
LoxP-neo-LoxP結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因牛耳成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞，經(jīng)鑒定表明，GFP陽(yáng)
性的細(xì)胞neo基因均被刪除，而GFP陰性的細(xì)胞則含有neo基因。說(shuō)明，通過本發(fā)明方法能
夠準(zhǔn)確篩選出基因被定點(diǎn)刪除的細(xì)胞。 本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確篩選出基因被定點(diǎn)刪除的細(xì)胞，避免了藥物篩選，為篩選基因被定點(diǎn)刪除的細(xì)胞，特別是標(biāo)記基因刪除的細(xì)胞的篩選提供了新途徑。對(duì)培育無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的進(jìn)一步發(fā)展及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品安全具有重大的意義。


圖1顯示的是實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)GFP和ere重組酶的表達(dá)載體。
圖2顯示的是實(shí)施例lcre-IRES EGFP酶切鑒定結(jié)果。其中1&9， lkb梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2&3， cre-IRES EGFP質(zhì)粒Xba I酶切結(jié)果，6. lkb ;4&5， cre-IRES EGFP質(zhì)粒Not工、Xba I雙酶切結(jié)果，4. 7kb+l， 351bp ;6&7， cre-IRES EGFP質(zhì)粒Nhe 1、Bsiw I雙酶切結(jié)果，5. lkb+l， 032bp ;8， cre-IRES EGFP質(zhì)粒對(duì)照。 圖3顯示的是實(shí)施例2cre-IRES EGFP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞ere重組酶表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果。 圖4顯示的是實(shí)施例3cre-IRES EGFP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后marker free細(xì)胞克隆點(diǎn)的鑒定結(jié)果。其中1， Marker ;2-11，不同的Marker free細(xì)胞克隆點(diǎn)細(xì)胞；12，轉(zhuǎn)有LoxP-NEO-LoxP結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因牛的基因組；13，含有LoxP-NEO-LoxP結(jié)構(gòu)的單標(biāo)載體；14，正常牛對(duì)照；15，空白對(duì)照。 圖5顯示的是實(shí)施例4用marker free細(xì)胞為供體細(xì)胞核移植獲得的囊胚的鑒定。其中1， Marker ;2-8， Marker free細(xì)胞為供體核移植獲得的囊胚；9，轉(zhuǎn)有neo單標(biāo)的轉(zhuǎn)基因牛的基因組；10，含有neo的單標(biāo)載體；ll，正常牛對(duì)照；12，空白對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實(shí)施例中所使用的載體、菌種、試劑及其來(lái)源 pIRES2-EGFP和pIRES-NE0載體(Clontech公司)，pIREShyg3載體(Clontech公司)，PBS185(GibcoBRL)pMD19-T (TaKaRa公司);宿主菌大腸桿菌DH5a本實(shí)驗(yàn)室保存；引物合成由上海生工完成；序列測(cè)定由北京優(yōu)博公司完成；LA Taq酶、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；抗ere重組酶抗體購(gòu)自Abeam公司，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自KPL公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、 PBS和胎牛血清購(gòu)自Gibico公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；蛋白提取細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天公司。293T細(xì)胞(人胎腎細(xì)胞)購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。
實(shí)施例lcre重組酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以PBS 185質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增ere重組酶的CDS序列，同時(shí)在序列的
兩端分別引入Nhel和BsiWI酶切位點(diǎn)。 所設(shè)計(jì)的上下游引物分別為Nhe I-Cre-F :GAAGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACBsi WI-Cre-R :TCTCGTACGCTAATCGCCATCTTCCAGCAG Cre CDS擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 反應(yīng)體系，其中PBS185質(zhì)粒1 (200ng/ii 1) ， primer (20pmo1/ yl)各1 ， dNTP (10mM) 6 ii 1 ， 5 X LA PCR Buffer 5 ii 1 ， LA Taq酶(Takara) 0. 3 ii 1 。 反應(yīng)程序?yàn)?4t:預(yù)變性5min，98t:變性10s，68t:退火延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)，72 °C 10min。 將PCR產(chǎn)物回收連接到pMD19-T載體上，經(jīng)過測(cè)序鑒定正確后，Nhe I和BsiW I雙酶切回收1032bp的片段，連接到同樣經(jīng)過Nhe I和BsiW I雙酶切的pIREShyg3的多克隆位點(diǎn)上獲得pcre-IREShyg載體。 以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增IRES EGFP序列，在序列的上游引物5'端引入NotI酶切位點(diǎn)，在下游引物上突變掉Not I酶切位點(diǎn)同時(shí)引入XbaI酶切位點(diǎn)，上游引物為Not I-IGFP-F :ATAGCGGCCGCACTAGAGGAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCC，下游引物為Xbal-IGFP-R :TGATCTAGAGTCGCGGCGGCTTTAC，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上，將PCR產(chǎn)物回收連接到pMD19-T載體上，經(jīng)過測(cè)序鑒定正確后，Not I和Xba I雙酶切回收1351bp的片段，連接到同樣經(jīng)過Not I和Xba I雙酶切的pcre-IREShyg載體上，取代pcre-IREShyg載體上IRES hyg序列，構(gòu)建完成成功表達(dá)cre重組酶和GFP但不含真核抗性基因的載體。其酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。 實(shí)施例2 293T細(xì)胞和牛成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染及cre重組酶的表達(dá)檢測(cè)
2. 1細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 取牛耳組織剪碎成1mm3左右的小塊，DMEM/F12清洗2遍后分批植塊于含lmLDMEM/F12+10% FBS的25cm2的培養(yǎng)瓶中，待組織塊貼壁牢固后再補(bǔ)加DMEM/F12+10% FBS至6mL，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 7d，每2d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，以0. 25%trypsin消化傳代2 3次，分批以DMEM/F12+20% FBS+10% DMSO凍存，即培養(yǎng)出牛成纖維細(xì)胞。
將293T細(xì)胞和牛成纖維細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70-80%匯合度時(shí)，按照說(shuō)明書要求，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將cre重組酶表達(dá)載體PBS185和pcre-IRESEGFP轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。
2. 2Western blot檢測(cè)cre重組酶的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，用碧云天公司的細(xì)胞裂解液裂解，
裂解產(chǎn)物以12， 000rpm離心10分鐘后取上清做Western blot雜交。雜交中轉(zhuǎn)有PBS185
的細(xì)胞表達(dá)的cre重組酶為陽(yáng)性對(duì)照，使用的一抗為小鼠抗cre重組酶的單克隆抗體，二抗
為辣根過氧化氫酶偶聯(lián)的兔抗鼠抗體。雜交結(jié)果表明pcre-IRESEGFP載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞
中能夠有效表達(dá)cre重組酶(圖3)。 實(shí)施例3基因刪除細(xì)胞的篩選及鑒定 lLoxP-Nn_LoxP結(jié)構(gòu)的構(gòu)建 用引物擴(kuò)增或酶切連接等方法將兩個(gè)LoxP位點(diǎn)引物pIRES-NE0載體的Neo表達(dá)框兩端，構(gòu)建成pIRES-LoxP-NE0-LoxP，其中LoxP-NEO-LoxP結(jié)構(gòu)兩端可引入特殊酶切位點(diǎn)，以用于連接到其它特異表達(dá)載體。LoxP-NEO-LoxP結(jié)構(gòu)中的NEO基因還可以用其它任意基因結(jié)構(gòu)(Nn， N代表核苷酸序列，n代表核苷酸數(shù))替代，即構(gòu)建成LoxP-Nn-LOXP結(jié)構(gòu)。
2細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將上述LoxP-Nn-LoxP結(jié)構(gòu)(以LoxP-neo-LoxP結(jié)構(gòu)為例)直接轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞，可獲得穩(wěn)定整合LoxP-neo-LoxP結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因牛成纖維細(xì)胞，將上述轉(zhuǎn)基因牛成纖維細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70-80%匯合度時(shí)，按照說(shuō)明書要求，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將cre重組酶表達(dá)載體pcre-IRESEGFP轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。 2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的流式分選及單克隆培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，0. 1 %的胰酶消化，流式細(xì)胞儀分選表達(dá)GFP的陽(yáng)性細(xì)胞，按照500個(gè)細(xì)胞/100mm培養(yǎng)皿的密度接種細(xì)胞，在含10%胎牛血清的匿EM培養(yǎng)基中培養(yǎng)7至8天至長(zhǎng)出明顯的單細(xì)胞克隆點(diǎn)。
3單細(xì)胞克隆點(diǎn)neo基因刪除的鑒定 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單細(xì)胞克隆點(diǎn)細(xì)胞用0. 1%的胰酶消化轉(zhuǎn)接到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿需要傳代時(shí)，取2， 000-3， 000個(gè)細(xì)胞做細(xì)胞PCR。設(shè)計(jì)跨LoxP-neo-LoxP結(jié)構(gòu)的引物，用以鑒定neo基因是否被刪除。上游引物SM-14 :AACCTACTCGAGATAACTTC，下游引物SM-1922 :GATGGTCGATAGATAACTTC，如果neo基因沒有被刪除，應(yīng)擴(kuò)增出1. 9kb左右的PCR產(chǎn)物。為了避免在刪除neo基因的同時(shí)，引入GFP和cre重組酶基因，分別設(shè)計(jì)了擴(kuò)增GFP和cre重組酶基因的引物(GFP上游引物TGCAGTGCTTCAGCCGCTAC， GFP下游引游CTCAGGTAGTGGTTGTCGGG ;cre上游引物ACATTTGGGCCAGCTAAAC， cre下游引物CGGAAATCCATCGCTCGACC)用以確定體細(xì)胞中無(wú)GFP和cre重組酶的整合。細(xì)胞PCR結(jié)果如圖4，結(jié)果表明，除11泳道樣品以外，其它樣品均成功刪除neo基因，并且沒有GFP和cre重組酶的整合。 4囊胚PCR進(jìn)一步確定neo基因的刪除 根據(jù)細(xì)胞PCR的結(jié)果，隨機(jī)挑選7個(gè)不同neo—GFP—cre—的克隆點(diǎn)細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植，取發(fā)育7天的囊胚分別做單囊胚PCR進(jìn)一步確認(rèn)neo基因的刪除，PCR結(jié)果如圖5，所用囊胚均無(wú)neo基因的存在，并且沒有GFP和ere重組酶基因的隨機(jī)整合。 由此可見，利用本發(fā)明方法構(gòu)建的表達(dá)ere重組酶的載體可以不經(jīng)過藥物篩選直接獲得標(biāo)記基因刪除的單細(xì)胞克隆點(diǎn)，用這些細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞可以獲得標(biāo)記基因刪除的克隆囊胚。
序列表說(shuō)明 SEQ ID No. l&2是用于擴(kuò)增ere酶基因CDS序列的引物對(duì)；SEQID No. 3&4是用于擴(kuò)增IRES EGFP序列的引物對(duì)；SEQ ID No. 5&6用以鑒定neo基因是否被刪除的引物對(duì)；SEQID No. 7&8以及SEQ IDNo. 9&10是分別用以擴(kuò)增GFP和ere重組酶基因的引物對(duì)。序列表〈110〉北京濟(jì)普霖生物技術(shù)有限公司〈120〉 一種定點(diǎn)刪除轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的外源基因的方法〈130>KHP08113406. 3〈160>10〈170>PatentIn version 3.5〈210>1〈211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gaagctegca tgtccaattt actgacegte c〈210>2〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tctcgtecgc teatcgecat cttccagcag〈210>3〈211>41〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3ategeggecg cactegagga attccgcccc tctccctccc c〈210>4〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tgatctegag tcgcggcggc tttec
7〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列<400>5aacctactcg agateacttc〈210>6〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉6gatggtcgat agateacttc〈210>7〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tgcagtgctt cagccgctec〈210>8〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8ctcaggtegt ggttgtcggg〈210>9<211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9acatttgggc cagcte朋c<210>10〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10
權(quán)利要求
一種表達(dá)熒光蛋白和cre重組酶的表達(dá)載體。
2. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述熒光蛋白為綠熒光蛋白。
3. —種定點(diǎn)刪除轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因的方法，其包括如下步驟用權(quán)利要求1或2 所述的表達(dá)載體導(dǎo)入目的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，其中所述目的細(xì)胞 含有LoxP-Nn-LOXP結(jié)構(gòu)，Nn為序列長(zhǎng)度為n的外源基因。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，還包括進(jìn)一步培養(yǎng)分選出來(lái)的細(xì)胞，并用 PCR法鑒定。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的外源基因?yàn)闃?biāo)記基因。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的標(biāo)記基因?yàn)閚eo基因。
7. 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的目的細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞。
8. —種篩選被定點(diǎn)刪除基因的細(xì)胞的方法，其包括如下步驟用權(quán)利要求1或2所述 的表達(dá)載體導(dǎo)入目的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，其中所述目的細(xì)胞含有 LoxP-Nn-LOXP結(jié)構(gòu)，Nn為序列長(zhǎng)度為n的外源基因。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，還包括進(jìn)一步培養(yǎng)分選出來(lái)的細(xì)胞，并用 PCR法鑒定。
10. 如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的外源基因?yàn)闃?biāo)記基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種定點(diǎn)刪除轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因的方法，其通過構(gòu)建表達(dá)熒光蛋白和cre重組酶的表達(dá)載體，將該表達(dá)載體導(dǎo)入目的細(xì)胞中，從而在目的細(xì)胞中cre重組酶與熒光蛋白共表達(dá)，cre酶定點(diǎn)刪除掉LoxP-Nn-LoxP結(jié)構(gòu)中的NnDNA序列，通過檢測(cè)細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)，即達(dá)到分選基因被定點(diǎn)刪除的細(xì)胞。本發(fā)明方法能夠?qū)ν庠椿蚧驑?biāo)記基因進(jìn)行準(zhǔn)確的刪除，并能準(zhǔn)確分選出基因被定點(diǎn)刪除的細(xì)胞，避免了使用藥物分選，對(duì)培育無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的進(jìn)一步發(fā)展及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品安全具有重大的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101760473SQ20081024659
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日
發(fā)明者丁方榮, 孫秀柱, 戴蘊(yùn)平, 李寧, 王少華 申請(qǐng)人:北京濟(jì)普霖生物技術(shù)有限公司