專利名稱：用于表達(dá)兩種外源基因的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)外源基因的載體。
背景技術(shù)：
傳遞基因的載體可用于研究和基因治療以便在靶細(xì)胞中表達(dá)外源基因。在所述情況下，有時(shí)需要在同一靶細(xì)胞中表達(dá)兩種基因。這將允許插入了治療基因的靶細(xì)胞通過聯(lián)合表達(dá)選擇性基因與治療基因而選擇性地增生或死亡。另一方面，這將允許通過聯(lián)合表達(dá)治療基因與標(biāo)記基因(如GFP等)而監(jiān)控治療性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)。而且，這將允許那些通過在兩類亞基之間形成復(fù)合物而起作用的蛋白，如受體和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。
過去已報(bào)道過插有多個(gè)啟動(dòng)子的形式和一個(gè)啟動(dòng)子與IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列結(jié)合的另一種形式作為共表達(dá)兩種基因的載體系統(tǒng)。但是，這些載體的表達(dá)性能卻不能令人滿意。
例如，由于啟動(dòng)子之間的干擾，含有多個(gè)啟動(dòng)子的載體僅從其中一個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)時(shí)出現(xiàn)表達(dá)效力的問題。另一方面，含有一個(gè)啟動(dòng)子與IRSE序列組合的載體存在的問題是從IRES的3’端表達(dá)基因時(shí)，其表達(dá)水平僅僅是從IRES 5’端表達(dá)的1/5到1/10。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以共表達(dá)兩種外源基因的載體。更具體地說，本發(fā)明的目的是提供一種可以用RRE序列共表達(dá)兩種外源基因并且可以通過修飾RRE序列來調(diào)節(jié)兩種外源基因表達(dá)水平比例的載體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了一種病毒載體，其中可以將源自病毒的表達(dá)調(diào)控序列改變成另一種表達(dá)調(diào)控序列，這樣就消除了對(duì)源自病毒的蛋白的依賴。在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種含有包裝信號(hào)的病毒載體，其中可以改變?cè)撦d體，從而降低因基因重組產(chǎn)生野生型病毒株的風(fēng)險(xiǎn)并使該載體不再表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
本發(fā)明者使用RRE和有各種優(yōu)點(diǎn)的猴免疫缺陷病毒(SIV)產(chǎn)生了一種新的病毒載體，其中所述優(yōu)點(diǎn)如與基因治療領(lǐng)域中常用的人類免疫缺陷病毒(HIV)相比更好的安全性。
具體地說，首次將依次含有5’LTR區(qū)、RRE、CMV啟動(dòng)子、EGFP基因(或β-半乳糖苷酶基因)和3’LTR的載體構(gòu)建為基于SIVagmTY01的基因轉(zhuǎn)移載體，其中的SIVagmTY01是非致病性非洲綠猴免疫缺陷病毒的一個(gè)克隆。
由于將基因轉(zhuǎn)移載體包裝到載體顆粒中需要包裝細(xì)胞中對(duì)基因轉(zhuǎn)移載體反式作用的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，本發(fā)明人為了在包裝細(xì)胞中提供病毒結(jié)構(gòu)蛋白還構(gòu)建了一種包裝載體。也就是說，構(gòu)建了在包裝細(xì)胞中表達(dá)病毒外殼蛋白(VSV-G)的載體和表達(dá)病毒核心蛋白(gag)和逆轉(zhuǎn)錄酶(pol)的載體。
慢病毒5’LTR的轉(zhuǎn)錄活性一般取決于Tat蛋白，這種蛋白是一種源自病毒的因子。所以，本發(fā)明人隨后又產(chǎn)生了一種基因轉(zhuǎn)移載體，在該載體中用另外一個(gè)啟動(dòng)子序列取代U3區(qū)，即5’LTR的啟動(dòng)子序列，從而消除了所產(chǎn)生的基因轉(zhuǎn)移載體對(duì)Tat蛋白的依賴性并且通過用具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子序列進(jìn)行取代來增加載體滴度，這樣就提供了不依賴Tat的載體。
已發(fā)現(xiàn)在慢病毒載體中，因?yàn)樵诎屑?xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄時(shí)將3’LTR區(qū)中所含的啟動(dòng)子序列U3區(qū)插入到5’LTR的U3啟動(dòng)子區(qū)，在基因轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的3’LTR區(qū)所含的U3區(qū)發(fā)揮5’LTR的U3啟動(dòng)子的功能，它與靶細(xì)胞基因組中的基因表達(dá)有關(guān)。所以，產(chǎn)生一種用另一啟動(dòng)子序列取代基因轉(zhuǎn)移載體中3’LTR的U3區(qū)的載體來測(cè)定是否能夠用不含有U3序列的啟動(dòng)子取代靶細(xì)胞內(nèi)與基因表達(dá)相關(guān)的啟動(dòng)子。此外，為測(cè)定是否能夠同時(shí)缺失靶細(xì)胞內(nèi)5’LTR中的啟動(dòng)子序列，產(chǎn)生了一種基因轉(zhuǎn)移載體，其中3’LTR的U3區(qū)已缺失。
將基因轉(zhuǎn)移載體包裝到載體顆粒中需要包裝信號(hào)，一種對(duì)基因轉(zhuǎn)移載體起順式作用的因子，此外，通過增強(qiáng)載體的包裝效率將會(huì)提高載體滴度。所以，應(yīng)當(dāng)插入盡可能長(zhǎng)的含有包裝信號(hào)的區(qū)域，以便保持包裝信號(hào)序列所形成的結(jié)構(gòu)。然而，另一方面，使基因轉(zhuǎn)移載體的包裝信號(hào)和包裝載體之間的序列重疊最小化就將由于兩種序列間可能出現(xiàn)的重組引起的野生型病毒的產(chǎn)生頻率抑制到最小。所以，為了構(gòu)建載體系統(tǒng)，必需正確鑒定有效包裝基因轉(zhuǎn)移載體所需的最小包裝信號(hào)序列。這樣，本發(fā)明人將含有不同長(zhǎng)度的5’LTR下游區(qū)域的DNA片段插入了基因轉(zhuǎn)移載體來提供安全而有包裝能力的載體。
接著，本發(fā)明人產(chǎn)生了一種允許同時(shí)表達(dá)兩種外源基因的病毒載體。Rev應(yīng)答元件(RRE)是源自病毒的Rev蛋白結(jié)合位點(diǎn)，它與RNA從核到胞質(zhì)的運(yùn)輸有關(guān)。使用這種RRE/Rev系統(tǒng)，可以檢測(cè)出通過剪接效率的調(diào)節(jié)是否可產(chǎn)生可以從單一啟動(dòng)子共表達(dá)兩種不同類型的蛋白的系統(tǒng)。
首先，為了檢測(cè)RRE是否能夠調(diào)節(jié)兩種不同類型蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生了一種載體，其中分別在RRE的上游和下游插入螢光素酶基因和β-半乳糖苷酶基因作為報(bào)道基因，在螢光素酶基因的上游插入剪接供體序列并且在RRE序列的下游插入剪接受體序列。預(yù)計(jì)在這種載體中剪接過的mRNA會(huì)表達(dá)β-半乳糖苷酶蛋白并且沒有被剪接的mRNA會(huì)表達(dá)螢光素酶蛋白。
而且，為了不僅能夠檢測(cè)兩種不同基因的表達(dá)，而且也能夠檢測(cè)通過改變RRE的序列而對(duì)這兩種基因的表達(dá)量之比的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生6種插有RRE序列的載體來測(cè)定在每種這類載體中報(bào)道基因的表達(dá)水平。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有RRE序列的載體能夠表達(dá)兩種不同類型的基因，并且通過RRE序列的取代能夠調(diào)節(jié)兩種基因的表達(dá)效率。此外，因?yàn)闆]有包裝載體時(shí)可以表達(dá)兩種不同類型的基因，故發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)系統(tǒng)可以不依賴于Rev蛋白的存在而表達(dá)兩種類型的基因。
過去人們認(rèn)為RRE的作用依賴于Rev蛋白，并且Rev/RRE的調(diào)節(jié)是“全或無”的情況。因此，在Rev-的情況中均是剪接形式，而在Rev+的情況中為非剪接形式。也就是說，從來沒有改變RRE序列造成剪接比例改變的例子。所以，上述結(jié)果首次證實(shí)了改變RRE序列能夠改變剪接的比例。
本發(fā)明人還檢測(cè)了利用RRE共表達(dá)兩種基因的系統(tǒng)是否能應(yīng)用于使用各種非5’LTR啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)。使用了源自人巨細(xì)胞病毒(CMV)的其他啟動(dòng)子和源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子(EF1α啟動(dòng)子)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使當(dāng)使用非5’LTR啟動(dòng)子時(shí)，也能夠同時(shí)表達(dá)兩種類型的基因。此外，發(fā)現(xiàn)兩種類型基因的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)依賴于RRE序列。所以，發(fā)現(xiàn)在利用了各種啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)中，使用RRE共表達(dá)兩種基因的系統(tǒng)有廣泛的用途。
另外，還根據(jù)報(bào)道基因插入RRE上游或下游的不同情況檢測(cè)了每種基因的不同表達(dá)水平。產(chǎn)生了在基因轉(zhuǎn)移載體中螢光素酶和β-半乳糖苷酶位置互換的兩種載體以比較這兩種載體中兩種報(bào)道基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論將它們插入RRE的上游或下游，在報(bào)道基因的表達(dá)水平上都沒有差異。
如上所述，本發(fā)明人成功地產(chǎn)生了一種新型病毒載體，這種載體能夠用RRE序列共表達(dá)兩種基因并且因所用的RRE序列中的差異能夠調(diào)節(jié)兩種基因的表達(dá)比例，由此完成了本發(fā)明。
更具體地說，本發(fā)明涉及(1)一種能表達(dá)兩種外源基因的載體DNA，該載體DNA從5’端到3’端依次含有下列部分(a)表達(dá)調(diào)控序列；(b)剪接供體序列；(c)第一種外源基因的插入位點(diǎn)；(d)RRE核心序列；(e)剪接受體序列；和(f)第二種外源基因插入位點(diǎn)；(2)一種能表達(dá)兩種外源基因的載體DNA，該載體DNA從5’端到3’端依次含有下列部分(a)表達(dá)調(diào)控序列；(b)剪接供體序列；(c)RRE核心序列；(d)第一種外源基因的插入位點(diǎn)；(e)剪接受體序列；和(f)第二種外源基因插入位點(diǎn)；(3)按照(1)或(2)所述的載體DNA，其中RRE核心序列源自逆轉(zhuǎn)錄病毒；(4)按照(1)或(2)所述的載體DNA，其中RRE核心序列源自慢病毒；(5)按照(1)或(2)所述的載體DNA，其中RRE核心序列源自免疫缺陷病毒；(6)按照(1)到(5)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中表達(dá)調(diào)控序列含有LTR；
(7)按照(1)到(6)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中表達(dá)調(diào)控序列含有非LTR的表達(dá)調(diào)控序列；(8)按照(7)所述的載體DNA，其中非LTR的表達(dá)調(diào)控序列選自CMVL啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和EF1α啟動(dòng)子；(9)按照(1)到(8)任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中剪接供體序列和剪接受體序列源自逆轉(zhuǎn)錄病毒；(10)按照(1)到(8)任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中剪接供體序列和剪接受體序列源自慢病毒；(11)按照(1)到(8)任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中剪接供體序列和剪接受體序列源自免疫缺陷病毒；(12)按照(1)到(11)任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中該載體DNA還在能被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域上含有包裝信號(hào)；(13)按照(12)所述的載體DNA，其中包裝信號(hào)源自逆轉(zhuǎn)錄病毒；(14)按照(12)所述的載體DNA，其中包裝信號(hào)源自慢病毒；(15)按照(12)所述的載體DNA，其中包裝信號(hào)源自免疫缺陷病毒；(16)按照(13)到(15)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中所述載體DNA被構(gòu)建成不能表達(dá)完整的gag蛋白；(17)按照(13)到(16)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中g(shù)ag蛋白的翻譯起始密碼子已突變；(18)按照(1)到(17)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中已經(jīng)將第一種外源基因和第二種外源基因插入該載體DNA中；(19)一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在其病毒顆粒中含有來自(12)到(17)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中已經(jīng)將第一種外源基因和第二種外源基因插入該載體DNA中；(20)一種慢病毒載體，在其病毒顆粒中含有來自(12)到(17)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中已經(jīng)將第一種外源基因和第二種外源基因插入該載體DNA；(21)一種免疫缺陷病毒載體，其病毒顆粒中含有來自(12)到(17)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中已經(jīng)將第一種外源基因和第二種外源基因插入該載體DNA；(22)一種制備病毒載體的方法，該方法含有將(12)到(17)中任何一項(xiàng)所述的載體DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞的步驟，其中將第一種外源基因和第二種外源基因已插入該載體DNA中，和從該細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中收集所產(chǎn)生的病毒顆粒的步驟。
其中“病毒載體”指含有能在宿主中表達(dá)外源基因的包裝核酸分子的病毒顆粒。
按照本發(fā)明，載體DNA依次含有(a)表達(dá)調(diào)控序列、(b)剪接供體序列、(c)第一種外源基因插入位點(diǎn)、(d)RRE核心序列、(e)剪接受體序列和(f)第二種外源基因插入位點(diǎn)，該載體可用來表達(dá)兩種外源基因(注元件(c)和(d)可以互換)。
兩種外源基因一旦插入到這種載體DNA中，根據(jù)有無剪接，就能夠共表達(dá)。下面描述構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的理論。
一旦插有兩種外源基因的載體DNA被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，由于表達(dá)調(diào)控區(qū)的激活，就會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物依次含有剪接供體序列、第一種外源基因、RRE核心序列、剪接受體序列和第二種外源基因。如果在剪接供體序列和剪接受體序列之間沒有出現(xiàn)剪接，從該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生的是僅編碼第一種外源基因的mRNA。因?yàn)榉gmRNA上所編碼的第一外源基因的核糖體因第一外源基因的終止密碼子而離開RNA，所以第二基因不被翻譯。另一方面，當(dāng)在剪接供體序列和剪接受體序列之間發(fā)生剪接時(shí)，通過使含有第一外源基因的區(qū)域缺失就產(chǎn)生了只翻譯第二外源基因的mRNA。所以，因有或無所述剪接，在導(dǎo)入了載體DNA的宿主細(xì)胞中能夠表達(dá)出兩種基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的載體DNA上表達(dá)調(diào)控序列的類型不局限于LTR。但是，為了使用如下的病毒載體，可被逆轉(zhuǎn)錄的病毒基因組必需能通過病毒對(duì)靶細(xì)胞的感染而將病毒本身插入宿主染色體中。作為具有這種功能而不是LTR的表達(dá)調(diào)控序列的例子，可給出在實(shí)施例中描述的由LTR和其他啟動(dòng)子組成的嵌合啟動(dòng)子。
因?yàn)槌霈F(xiàn)剪接的效率幾乎是100％，所以本發(fā)明的載體DNA中無需優(yōu)選剪接供體序列和受體序列的常規(guī)組合。在本發(fā)明中，優(yōu)選能從一類RNA經(jīng)不同剪接而表達(dá)兩種或多種蛋白的序列。一般來說，人們知道逆轉(zhuǎn)錄病毒中有許多這類序列(A.B.Rabson和B.J.Graves，“病毒RNA的合成和加工”，在《逆轉(zhuǎn)錄病毒》，第205-262頁(yè)(1997)編輯J.M.Coffin，S.H.Hughes以及H.E.Varmus，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。例子包括SEQ ID NO76中所示SIVagmTYO1的基因組序列中堿基6964到堿基8177之間的區(qū)域。
在本發(fā)明的載體DNA中第一個(gè)外源基因的插入位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)放在剪接供體序列和剪接受體序列之間。插入一個(gè)不抑制靶基因翻譯的合適限制酶位點(diǎn)可產(chǎn)生第一個(gè)外源基因插入位點(diǎn)。在剪接受體序列和多聚腺苷加尾信號(hào)之間插入一個(gè)適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)可產(chǎn)生第二個(gè)外源基因插入位點(diǎn)。只要不抑制第一個(gè)外源基因的表達(dá)，就可以將RRE序列定位在第一個(gè)外源基因插入位點(diǎn)的5’端或3’端。
對(duì)第一個(gè)和第二個(gè)外源基因的組合沒有特殊限制。認(rèn)為有用的兩種類型基因的組合例子如下所示。
a)治療基因和抗藥性標(biāo)記用適當(dāng)試劑在體內(nèi)只選擇治療性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，從而減少非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞同時(shí)增加轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
b)治療基因和生長(zhǎng)因子或其受體通過刺激治療性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長(zhǎng)，使得只有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞選擇性增殖，從而提高治療效果。
c)治療基因和歸巢受體為將治療性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞特異性地傳遞到所希望的部位，共表達(dá)歸巢受體，如AIDS的治療基因和淋巴結(jié)的歸巢受體。
d)治療基因和標(biāo)記基因可以一直監(jiān)控帶標(biāo)記的治療性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)和半壽期。如果能夠體外測(cè)定蛋白，可以一直體外監(jiān)控轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
e)由兩種類型的亞基組成的蛋白的表達(dá)已知各種蛋白可形成異源二聚體。因?yàn)楸景l(fā)明的載體DNA能夠使這類蛋白表達(dá)，故對(duì)治療基因的選擇將擴(kuò)大到過去可能獲得的基因之外。
f)兩類相互作用的基因的表達(dá)可以表達(dá)配體和受體、酶和其底物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及其受體等配對(duì)物。例如，共表達(dá)生長(zhǎng)因子及其受體能夠顯著增加轉(zhuǎn)基因細(xì)胞數(shù)。
g)有協(xié)同作用的兩類基因的表達(dá)在各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，經(jīng)?？梢砸蚣せ盍硕喾N信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)而觀察到協(xié)同作用，例如來自兩類配體的刺激物產(chǎn)生的協(xié)同作用。通過表達(dá)具有這種作用的兩類基因，會(huì)提高治療效果。
此外，修飾本發(fā)明載體DNA上的RRE序列，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接效率。這樣，就能夠調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中所表達(dá)的兩種基因產(chǎn)物的數(shù)量比例。而且，基因產(chǎn)物的量本身可得到調(diào)節(jié)。
例如，如圖8所示，用c/SA或c/tr序列作RRE序列就能夠提高第一外源基因的表達(dá)率；相反，用c/c或c/x序列作RRE序列能夠提高第二外源基因的表達(dá)率。另外，如圖8所示，外源基因的表達(dá)水平本身可用不同的RRE序列改變。調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)水平有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，在基因治療中表達(dá)兩種類型的基因產(chǎn)物時(shí)，存在最佳表達(dá)水平，通過控制數(shù)量比而調(diào)節(jié)到最佳表達(dá)水平，就會(huì)提高治療效果。例如，對(duì)異源二聚體來說，認(rèn)為使異源二聚體的每一多肽、亞基以1∶1表達(dá)是最有效的，而對(duì)酶和底物來說，認(rèn)為降低酶量并增加底物量會(huì)使效率升高。
體內(nèi)導(dǎo)入本發(fā)明載體的方法可以如下所述進(jìn)行。
a)DNA本身的給藥由于可以只用DNA對(duì)肌肉細(xì)胞進(jìn)行給藥，因此DNA本身可以作為載體而給藥。
b)非病毒載體的給藥DNA可以與用于轉(zhuǎn)染的合成化合物如脂轉(zhuǎn)染胺試劑或聚陽離子脂質(zhì)體以復(fù)合物的形式給藥。
c)病毒載體的給藥DNA可以通過插入DNA型病毒載體如腺病毒而給藥。
為了生產(chǎn)包裝了本發(fā)明載體DNA的病毒顆粒，在載體DNA的可轉(zhuǎn)錄區(qū)需要包裝信號(hào)。需將盡可能長(zhǎng)的含包裝信號(hào)的區(qū)域插入到載體中，以維持包裝信號(hào)序列所形成的結(jié)構(gòu)。另一方面，為了抑制因載體DNA上的包裝信號(hào)和包裝載體之間的重組引起的野生型病毒的產(chǎn)生頻率，要將這些載體間的序列重疊保持在最小。所以，在產(chǎn)生本發(fā)明的載體DNA時(shí)，優(yōu)選使用含包裝必需的序列，但同時(shí)又盡可能短的序列，以使包裝效率和安全性都最大化。
對(duì)包裝信號(hào)不作限定，只要轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以包裝該包裝載體就行。這樣，按照包裝載體的類型，可以使用源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的、源自慢病毒的、源自免疫缺陷病毒等的信號(hào)。
例如，用源自實(shí)施例中所述的SIVagm的包裝載體時(shí)，可用的信號(hào)將只是源自SIV，因?yàn)镠IV載體未被包裝。但是，使用源自HIV的包裝載體時(shí)，因?yàn)樵醋許IV的基因轉(zhuǎn)移載體也被包裝，就可以將源自不同慢病毒的基因轉(zhuǎn)移載體和包裝載體組合而產(chǎn)生載體顆粒，從而降低重組病毒的產(chǎn)生率。這時(shí)，優(yōu)選靈長(zhǎng)類慢病毒(如HIV和SIV)之間的組合。
在本發(fā)明的載體DNA中，優(yōu)選能防止gag蛋白的表達(dá)的那些改變。病毒gag蛋白在體內(nèi)會(huì)被識(shí)別為外源物質(zhì)，由此會(huì)產(chǎn)生抗原性。它也會(huì)影響細(xì)胞功能。所以，在本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體中，優(yōu)選改變gag蛋白以防止其表達(dá)。
為了防止gag蛋白的表達(dá)，可通過gag的起始密碼子下游的堿基缺失、添加等而進(jìn)行修飾，以使讀碼框移動(dòng)。此外，優(yōu)選使gag蛋白的編碼區(qū)發(fā)生部分缺失。為了包裝病毒，認(rèn)為gag蛋白編碼區(qū)的5’端是必需的。所以，優(yōu)選本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體含有已缺失羧基末端區(qū)的gag蛋白編碼區(qū)。優(yōu)選，缺失的gag編碼區(qū)盡可能寬，但對(duì)包裝效率沒有大的影響。具體是，可缺失150bp的gag編碼區(qū)的3’端下游區(qū)域。此外，也可以優(yōu)選將gag蛋白起始密碼子(ATG)取代為非ATG的密碼子。要被取代的密碼子優(yōu)選是對(duì)包裝效率幾乎無影響的密碼子。通過將含有上述構(gòu)建的包裝信號(hào)的本發(fā)明載體DNA導(dǎo)入適當(dāng)包裝細(xì)胞，可產(chǎn)生病毒載體?？蓮陌b細(xì)胞的培養(yǎng)上清中收集所產(chǎn)生的病毒載體。
對(duì)用作包裝細(xì)胞的細(xì)胞沒有限制，只要它們是產(chǎn)生病毒常用的細(xì)胞系就行。在用于人類的基因療法中，細(xì)胞的適當(dāng)來源可以是人或猴。例如，可以用作包裝細(xì)胞的人類細(xì)胞系是293細(xì)胞、293T細(xì)胞、293EBNA細(xì)胞、SW480細(xì)胞、u87MG細(xì)胞、HOS細(xì)胞、C8166細(xì)胞、MT-4細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞等。源自猴的細(xì)胞系的例子是COS1細(xì)胞、COS7細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、BMT10細(xì)胞等。
因?yàn)橐月《救鏗IV、SIV和FIV為基礎(chǔ)產(chǎn)生的本發(fā)明載體能夠?qū)⒒蛘系經(jīng)]有分裂的細(xì)胞中，所以它們可提高基因治療的效率，使之突破用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行的常規(guī)基因療法的限制。就是說，用本發(fā)明的載體使各種治療性基因整合到?jīng)]有分裂的細(xì)胞染色體中成為可能。
本發(fā)明也可以用于各種遺傳疾病的基因治療?？赏ㄟ^將基因插入到染色體而進(jìn)行治療的目標(biāo)疾病及其致病基因的例子如下Gaucher’s疾病的β-腦干脂酶基因(20號(hào)染色體)、血友病的凝血因子8(X染色體)和凝血因子9(X染色體)、腺苷脫氨酶缺陷病的腺苷脫氨酶基因、苯丙酮尿癥的苯丙氨酸羥化酶基因(12號(hào)染色體)、Duchenne營(yíng)養(yǎng)不良的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因(X染色體)、家族性高膽固醇血癥的LDL受體基因(19號(hào)染色體)、中性纖維化的CFTR基因等。本發(fā)明還包括涉及其他多種基因的目標(biāo)疾病，包括神經(jīng)變性疾病如Alzheimer疾病和帕金森氏癥、局部缺血性腦病、癡呆、難治的感染如AIDS。也可以考慮使HIV轉(zhuǎn)錄因子失活的治療，其中本發(fā)明基于SIV的載體可以在取自AIDS患者的造血干細(xì)胞外進(jìn)行體外操作，以便先于HIV感染而增加源自SIV的基因組的轉(zhuǎn)錄，再將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。而且，能用于慢性疾病的例子包括對(duì)缺血性心臟病來說抑制VEGF和FGF2基因的表達(dá)，對(duì)動(dòng)脈硬化的基因治療來說抑制細(xì)胞增生相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞增生因子(PDGF，TGF-β等)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的表達(dá)。另外，對(duì)糖尿病來說，BDNF基因也可以是一個(gè)候選基因。而且，這種方法可以用于取代療法中，其中將諸如遺傳突變后可引起癌變的抑癌基因p53等基因整合到染色體中，該方法在體外將一種多重抗藥基因?qū)朐醋怨撬璧脑煅杉?xì)胞中，然后將這些細(xì)胞回輸?shù)交颊哐褐校瑥亩黄瓢┌Y藥物治療的局限。就自身免疫病如多發(fā)性硬化癥、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE和腎小球腎炎的基因治療而言，通過T-細(xì)胞受體、各種粘附因子(例如，ICAM-1、LFA-1、VCAM-1和LFA-4等)、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體(例如，TNF、IL-8、IL-6和IL-1等)、細(xì)胞增生因子(例如，PDGF和TGF-β等)和激活因子(例如MMP等)的反義表達(dá)可實(shí)現(xiàn)表達(dá)抑制。就過敏性疾病的基因治療而言，通過IL-4、FcεR-I等反義表達(dá)也可實(shí)現(xiàn)表達(dá)抑制。對(duì)于涉及器官移植的基因治療而言，通過將非人動(dòng)物供體的組織相容性抗原換成人型抗原可提高異種移植的成功率。而且，可以考慮將外源基因?qū)肴薊S細(xì)胞的染色體中，從而在胚胎期補(bǔ)充缺陷基因，以補(bǔ)充全身循環(huán)的酶、生長(zhǎng)因子等的缺陷。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是使用猴免疫缺陷病毒克隆SIVagmTYO1的慢病毒載體系統(tǒng)的簡(jiǎn)圖。
圖2是SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體的結(jié)構(gòu)示意圖，其中用其他啟動(dòng)子序列取代了U3區(qū)，5’LTR啟動(dòng)子序列。
圖3是SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體的結(jié)構(gòu)示意圖(其中用其他啟動(dòng)子序列取代了3’LTR的U3區(qū))，以及預(yù)期通過所述載體在靶細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的5’LTR中U3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)構(gòu)。
圖4是鑒別基因轉(zhuǎn)移載體的包裝信號(hào)的方法草圖。
圖5是使用在基因轉(zhuǎn)移載體中g(shù)ag蛋白的翻譯起始密碼子位置經(jīng)過點(diǎn)突變產(chǎn)生的突變體鑒定包裝信號(hào)的方法草圖。
圖6是用RRE共表達(dá)兩種基因的載體的結(jié)構(gòu)示意圖。分別在RRE的上游和下游插入螢光素酶基因和β-半乳糖苷酶基因作為報(bào)道基因。再將剪接供體序列插入螢光素酶基因的上游并將剪接受體序列插入RRE下游。根據(jù)有或無剪接事件從載體中產(chǎn)生兩種類型的mRNA。
圖7是含各種RRE序列的載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖8顯示了通過測(cè)定在含5’LTR作啟動(dòng)子并含各種RRE序列的載體上兩種基因的表達(dá)水平所獲得的結(jié)果。
圖9顯示了在用除5’LTR外的各種啟動(dòng)子構(gòu)建的兩基因共表達(dá)系統(tǒng)中的基因表達(dá)。用源自人巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子和源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子(EF1α啟動(dòng)子)作為啟動(dòng)子。在較下面的圖中顯示了該載體的結(jié)構(gòu)圖。
圖10顯示了兩種基因共表達(dá)的載體，其中報(bào)道基因β-半乳糖苷酶和螢光素酶位置互換(較下面的圖)。它們都是SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體且含RRE6/s(6964-7993)序列。該圖顯示了各載體上兩種報(bào)道基因之間表達(dá)水平的比較結(jié)果。
圖11顯示了用熒光顯微鏡得到的用SIVagm SIN載體將EGFP基因?qū)隚2-M期的停滯狀態(tài)的293T細(xì)胞中的照片(A)和導(dǎo)入已用視磺酸誘導(dǎo)了分化的SH-SY5Y細(xì)胞中的照片(B)。
圖12顯示了EGFP基因用SIVagm載體導(dǎo)入人PBMC后其表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析圖。縱軸表示細(xì)胞數(shù)而橫軸表示相應(yīng)于EGFP表達(dá)水平的熒光強(qiáng)度。在M1區(qū)域的細(xì)胞是EGFP陽性，而圖中數(shù)值代表EGFP-陽性百分比(％)。
圖13顯示了EGFP基因用SIVagm載體導(dǎo)入源自人PBMC的T細(xì)胞后其表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析圖。
圖14顯示了EGFP基因用SIVagm載體導(dǎo)入源自人類骨髓的CD34陽性細(xì)胞后，其表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析圖。用相應(yīng)于EGFP和PE的兩種顏色系列進(jìn)行分析以確定EGFP陽性比。在R2區(qū)域的細(xì)胞是GFP陽性，圖中數(shù)值表示EGFP陽性百分比(％)。
圖15是EGFP基因用SIVagm載體導(dǎo)入源自人臍血的CD34陽性細(xì)胞后，其表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析圖。
圖16顯示了EGFP基因用SIVagm載體導(dǎo)入源自恒河猴骨髓的CD34陽性細(xì)胞后，其表達(dá)的流式細(xì)胞儀分析圖。
圖17顯示了將已經(jīng)用SIVagm載體導(dǎo)入了EGFP基因的源自人臍血的CD34陽性細(xì)胞植入NOD/SCID小鼠5和6周后用流式細(xì)胞儀分析外周血液中人細(xì)胞的百分比的圖。用PE-標(biāo)記的小鼠外周血液淋巴細(xì)胞中抗人CD45抗體給人淋巴細(xì)胞染色，接著結(jié)合EGFP進(jìn)行雙色分析。UL、UR、LL和LR分別在各圖中表示左上、右上、左下和右下區(qū)。在UL和UR區(qū)的細(xì)胞是CD45陽性，在UR區(qū)的細(xì)胞是CD45和EGFP雙陽性。在圖中的數(shù)值代表各區(qū)所含細(xì)胞數(shù)相對(duì)于總細(xì)胞數(shù)的百分比(％)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但不是用來限定本發(fā)明的。
SIVagm載體的產(chǎn)生和其性能的鑒定使用源自猴的非致病性免疫缺陷病毒克隆SIVagmTY01按照下列方法制備新的慢病毒載體。圖1顯示了載體系統(tǒng)的示意圖。
在載體系統(tǒng)的制備中使用含源自非洲綠猴的非致病性免疫缺陷病毒克隆的SIVagmTY01。在后文中，以病毒RNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1，標(biāo)明了全部核苷酸編號(hào)。用pSA212(病毒學(xué)雜志，第64卷，第307-312頁(yè)，1990)作質(zhì)粒，其中已經(jīng)插入了SIVagmTY01。再用Ligation High(東洋紡)按照所附說明進(jìn)行所有的連接反應(yīng)。
a.包裝載體的產(chǎn)生首先，以pSA212作模板使用引物1F(SEQ ID NO1)和1R(SEQ ID NO2)經(jīng)PCR得到相應(yīng)于含有vif、和tat/rev第一外顯子的區(qū)域(5337-5770)的DNA片段。經(jīng)過將PCR引物設(shè)計(jì)成含有EcoRI限制酶位點(diǎn)來制備在其3’端帶有EcoRI位點(diǎn)的DNA片段。用BglII和EcoRI消化后，PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和Wizard PCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)純化。在pBluescripKS+(Stratagene)中將從上述步驟得到的DNA片段和編碼gag/pol區(qū)(含有從XhoI位點(diǎn)(356)到BglII位點(diǎn)(5338)的區(qū)域)的DNA片段在XhoI-EcoRI位點(diǎn)連接。然后，對(duì)相應(yīng)于含Rev反應(yīng)元件(RRE)和tat/rev第二外顯子(6964-7993)的區(qū)域的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以對(duì)上述PCR片段的相似方式，用pSA212作模板并用引物2F(SEQ ID NO3)和2R(SEQ ID NO4)進(jìn)行PCR，以便在3’端添加一個(gè)NotI位點(diǎn)。DNA片段用EcoRI和NotI消化后，純化并在已經(jīng)插有g(shù)ag-tat/rev的pBluescript KS+的EcoRI-NotI位點(diǎn)處插入。
再合成含剪接供體(SD)位點(diǎn)的DNA片段(序列3F(SEQ ID NO5)和3R(SEQ ID NO6))。在合成時(shí)，分別在DNA的5’和3’端整合一個(gè)XhoI位點(diǎn)和一個(gè)SalI位點(diǎn)，然后在上述插有g(shù)ag-tat/rev的pBluescript KS+中的XhoI位點(diǎn)插入該DNA。用XhoI和NotI消化所得質(zhì)粒，并純化包含從SD到tat/rev的區(qū)域的片段。然后在EcoRI位點(diǎn)已經(jīng)插有XhoI/NotI接頭(序列4F(SEQ ID NO7)和4R(SEQ ID NO8))的質(zhì)粒pCAGGS(基因，第108卷，第193-200頁(yè)，1991)的XhoI-NotI位點(diǎn)插入該片段。將上述方法所得質(zhì)粒用作包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)。
b.基因轉(zhuǎn)移載體的產(chǎn)生以pSA212為模板用引物5-1F(SEQ ID NO9)和5-1R(SEQ ID NO10)對(duì)源自SIVagmTY01的5’LTR區(qū)(8547-9053+1-982，在5’端加KpnI位點(diǎn)和在3’端加EcoRI位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用引物5-2F(SEQ ID NO11)和5-2R(SEQ ID NO12)對(duì)RRE(7380-7993，在5’端加EcoRI位點(diǎn)和在3’端加SacII位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或用引物5-3F(SEQ ID NO13)和5-3R(SEQ IDNO14)對(duì)3’LTR(8521-9170，在5’端加NotI和BamHI位點(diǎn)和在3’端加SacI位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以pEGFPC2為模板用引物6F(SEQ ID NO15)和6R(SEQ ID NO16)經(jīng)PCR擴(kuò)增源自pEGFPC2(Clontech)的CMV啟動(dòng)子和EGFP編碼區(qū)(1-1330；它在5’端加SacII位點(diǎn)并在3’端加NotI位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)以及翻譯終止密碼子)。分別用KpnI和EcoRI限制酶、EcoRI和ScII限制酶、BamHI和SacI限制酶、和SacII和BamHI限制酶消化四種類型的PCR片段，接著純化。然后將其按5’LTR、3’LTR、RRE和CMV啟動(dòng)子EGFP的順序連接，之后插入pBluescript KS+中的KpnI-SacI位點(diǎn)之間(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。當(dāng)用β-半乳糖苷酶作報(bào)道基因時(shí)，如上所述經(jīng)PCR制備分別含5’LTR區(qū)和3’LTR區(qū)的DNA片段。分別用限制酶KpnI和EcoRI以及限制酶NotI和SacI消化這些DNA片段后，將其純化，然后分別插在pBluescript KS+中的KpnI-EcoRI位點(diǎn)和NotI-SacI位點(diǎn)(pBS/5’LTR.U3G2/WT3’LTR)。將含有pCMV-β(Clontech)的β-半乳糖苷酶編碼區(qū)(820-4294)的NotI片段插入該質(zhì)粒的NotI位點(diǎn)(pBS/5’LTR.U3G2/β-gal/WT3’LTR)。然后，將已經(jīng)以pSA212為模板用引物7-1F(SEQ ID NO17)和7-1R(SEQ ID NO18)經(jīng)PCR擴(kuò)增的RRE序列(6964-8177；它在5’端加有EcoRI位點(diǎn)并在3’端加有NotI位點(diǎn))插入質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3G2/β-gal/WT3’LTR的EcoRI-NotI位點(diǎn)(pBS/5’LTR.U3G2/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR)。在插入已經(jīng)以pSA212為模板用引物7-2F(SEQ ID NO19)和7-2R(SEQ ID NO20)經(jīng)PCR擴(kuò)增的RRE序列(7380-7993；它在5’端加有EcoRI位點(diǎn)并在3’端加有NheI位點(diǎn))前用EcoRI和NheI消化RRE序列。所得質(zhì)粒(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/β-gal/WT3’LTR)用NheI和SmaI消化并鈍端化后，向其中插入源自pEGFPN2(Clontech)的CMV啟動(dòng)子區(qū)(8-592；鈍端化的AseI-NheI片段)(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)。按照所附的說明用Blunting High(東洋紡)進(jìn)行所有的鈍端化反應(yīng)。分別用KpnI和SacI消化質(zhì)粒 pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR和pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR，得到含5’LTR-3’LTR之間的區(qū)域的DNA片段。將這些片段插入pGL3對(duì)照載體(Promega)的KpnI-SacI位點(diǎn)，用作基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal或EGFP/WT3’LTR)。為了鑒定包裝信號(hào)，用KpnI和EcoRI從pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR質(zhì)粒中切下5’LTR區(qū)，以pSA212作模板用引物8F(SEQ ID NO21)和一系列引物8-1R到12R(SEQ ID NO22-33)經(jīng)PCR制備含不同長(zhǎng)度的區(qū)域的各種DNA片段。將所得12種DNA片段中的每種都插入上述質(zhì)粒中的KpnI-EcoRI位點(diǎn)。所得載體可以用于鑒定。
接著，將使用8-FSF(SEQ ID NO34)和8-FSR(SEQ ID NO35)并以pSA212作模板經(jīng)PCR制備的DNA片段插入已經(jīng)在KpnI-EcoRI位點(diǎn)插有使用引物8F(SEQ ID NO21)和8-3R(SEQ ID NO24)并且以pSA212作模板經(jīng)PCR制備的DNA片段的載體上的EcoRI位點(diǎn)，獲得已將移碼導(dǎo)入了gag多肽編碼區(qū)的載體。將使用8-FSF(SEQ ID NO34)和8-FSR(SEQ ID NO35)并以pSA212作模板經(jīng)PCR制備的DNA片段插入已經(jīng)在KpnI-EcoRI位點(diǎn)插有使用引物8F(SEQ ID NO21)和系列引物8-PMR1到9(SEQ ID NO36到44)并且以pSA212作模板經(jīng)PCR制備的DNA片段的載體上EcoRI位點(diǎn)，獲得已經(jīng)在gag多肽的轉(zhuǎn)錄起始密碼子(ATG)處導(dǎo)入了點(diǎn)突變的載體。
下面描述一種確認(rèn)載體性能的典型方法。以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度將293T細(xì)胞鋪板至6孔塑料平板(Sumitomo Bakelite)上。然后在CO2培養(yǎng)箱(含10％CO2氣體的空氣，37℃)中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基換成800μl/孔的OptiMEM用來轉(zhuǎn)染。每孔的DNA用量對(duì)基因轉(zhuǎn)移載體來說是300ng，對(duì)包裝載體來說是600ng而對(duì)VSV-G表達(dá)載體(pHCMV-G，細(xì)胞生物學(xué)方法，第43卷，第99-112頁(yè)，1994)來說是100ng。將這些DNA溶于100μl的OptiMEM中，然后向其中加入6μl的PLUS試劑。將該混合物攪拌并置室溫15分鐘后，向該混合物中加入4μl等份試樣的用100μl的OptiMEM稀釋的LIPOFECTAMINE，接著再攪拌并再置室溫15分鐘。將所得含有上述方法制得的DNA和LIPOFECTAMINE的復(fù)合物的溶液滴注到在6孔平板的孔中培養(yǎng)的293T細(xì)胞上并輕微攪拌，接著在CO2培養(yǎng)箱(含10％CO2的空氣，37℃)培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)后，向混合物中加入1ml/孔含20％滅活的胎牛血清的D-MEM，然后在37℃、CO2培養(yǎng)箱的10％CO2的空氣中培養(yǎng)12小時(shí)。然后，將混合物的培養(yǎng)基換成2ml/孔的含有10％滅活的胎牛血清的D-MEM，接著培養(yǎng)24小時(shí)。用孔徑0.45μm的濾膜(DISMIC-25CS濾膜；ADVANTEC)過濾細(xì)胞培養(yǎng)物的上清用于測(cè)定。
在制備濃縮原種時(shí)，首先以每孔2.5×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度將293T細(xì)胞鋪板至15-cm塑料平板(Sumitomo Bakelite)，然后在CO2培養(yǎng)箱(含10％CO2氣體的空氣，37℃)中培養(yǎng)48小時(shí)。然后，將培養(yǎng)基換成10ml/孔的OptiMEM用于轉(zhuǎn)染。每孔的DNA用量對(duì)基因轉(zhuǎn)移載體來說是6μg，對(duì)包裝載體來說是3μg而對(duì)VSV-G表達(dá)載體(pHCMV-G)來說是1μg。將這些DNA溶于1.5ml的OptiMEM，然后向其中加入40μl的PLUS試劑。攪拌該混合物并置室溫15分鐘。向該混合物中加入60μl用1ml的OptiMEM稀釋的LIPOFECTAMINE等份試樣，接著再攪拌并再置室溫15分鐘。將含有上述方法制得的DNA和LIPOFECTAMINE的復(fù)合物的溶液滴注到在6孔平板的孔中培養(yǎng)的293T細(xì)胞上并輕微攪拌，接著在CO2培養(yǎng)箱(含10％CO2氣體的空氣，37℃)中培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)后，向混合物中加入10ml/平板的含有20％滅活的胎牛血清的D-MEM，然后在37℃、含10％CO2氣體的空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。然后，將混合物的培養(yǎng)基換成20ml/平板的含有10％胎牛血清的D-MEM，接著培養(yǎng)24小時(shí)。用孔徑0.45μm的濾膜過濾細(xì)胞培養(yǎng)物的上清并在Centriplus YM-100(Amicon)中在4℃以3000g離心170分鐘使濾液超濾濃縮100倍。將濃縮的樣品保存在-80℃以備測(cè)定。
使用人293T細(xì)胞系等能夠測(cè)定上述制備的SIVagm病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率。另外，通過下面描述的蚜棲菌素處理(在G1-S期停滯)或X-射線衍射(在G2-M期停滯)評(píng)價(jià)細(xì)胞周期的特殊期中基因轉(zhuǎn)移的效率。
此外，當(dāng)使用各種細(xì)胞進(jìn)行導(dǎo)入試驗(yàn)時(shí)，能夠測(cè)定出SIVagm載體是否能導(dǎo)入生理狀態(tài)更接近的細(xì)胞中。例如，這類細(xì)胞包括經(jīng)全轉(zhuǎn)型視磺酸處理而誘導(dǎo)分化的人神經(jīng)母細(xì)胞系RBTM1和SH-SY5Y細(xì)胞，還包括大鼠腦細(xì)胞的原代養(yǎng)物(見下文)等。
5’LTR的修飾慢病毒的5’LTR的轉(zhuǎn)錄活性一般取決于源自病毒的Tat蛋白的存在。因此，為了消除Tat依賴性以及用有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子序列取代來提高載體滴度，產(chǎn)生了一種SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體，其中作為5’LTR啟動(dòng)子序列的U3區(qū)用另外一種啟動(dòng)子序列取代(圖2)。
按照下列方法實(shí)現(xiàn)用嵌合啟動(dòng)子對(duì)5’LTR的取代。用系列引物9-1F到3F(SEQ ID Nos45-47)和引物9R(SEQ ID NO48)以及以pSA212為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增含有在5’LTR中TATA盒下游到gag區(qū)之間區(qū)域(9039-9170+1-982)的片段。接著，再分別用引物10-1F(SEQ ID NO49)和10-1R(SEQ IDNO50)以及以pCI為模板；用引物10-2F(SEQ ID NO51)和10-2R(SEQ IDNO52)以及以pEGFPN2為模板；用引物10-3F(SEQ ID NO53)和10-3R(SEQID NO54)以及以pEF-BOS為模板；以及用引物10-4F(SEQ ID NO55)和10-4R(SEQ ID NO56)以及以pCAGGS為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增分別含有CMVL啟動(dòng)子(源自pCI(Promega)；1-721)、CMV啟動(dòng)子(源自pEGFPN2(Clontech)；1-568)、EF1α啟動(dòng)子(來自pEF-BOS的核苷酸2240-2740(核酸研究，第18卷，第5322頁(yè)，1990))以及CA啟動(dòng)子(來自pCAGGS的核苷酸5-650)的片段。擴(kuò)增后，將含有5’LTR的片段與上述分別含有每種啟動(dòng)子的片段混合。向其中加入相應(yīng)于每種啟動(dòng)子5’端的引物(10-1F(SEQ ID NO49)、10-2F(SEQ ID NO51)、10-3F(SEQ ID NO53)或10-4F(SEQ ID NO55))和相應(yīng)于5’LTR的3’端的引物(9R)，然后，再進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的PCR以得到由四種啟動(dòng)子的每一種與5’LTR組成的嵌合啟動(dòng)子的DNA片段。將所得DNA片段插入到基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)中KpnI-EcoRI位點(diǎn)(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/CMV.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/EF1α.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/CAG.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)。
3’LTR的修飾在慢病毒載體中，當(dāng)靶細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄時(shí)將包含在3’LTR中的啟動(dòng)子序列作為U3區(qū)整合到5’LTR的U3啟動(dòng)子區(qū)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移載體3’LTR區(qū)所含的U3區(qū)變成了靶細(xì)胞基因組中參與基因表達(dá)的5’LTR的U3啟動(dòng)子(圖3)。因此，制備SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體，在這種載體中3’LTR的U3區(qū)已用其他啟動(dòng)子序列取代，通過對(duì)所述其它啟動(dòng)子序列的評(píng)估可確定與靶細(xì)胞中基因表達(dá)有關(guān)的啟動(dòng)子是否也能夠用非U3序列的其他啟動(dòng)子取代(圖3)。另外，制備刪除了3’LTR的U3區(qū)的SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體，通過對(duì)該載體的評(píng)估可判定靶細(xì)胞中5’LTR上的啟動(dòng)子序列是否可以缺失。
如下所述進(jìn)行3’LTR的U3啟動(dòng)子序列的修飾和缺失。用引物11F(SEQID NO57)和11R(SEQ ID NO58)并使用pSA212作模板經(jīng)PCR擴(kuò)增不含3’LTR的U3的DNA片段。接著，用系列引物12-1F到3F(SEQ ID NO59-61)和引物12R(SEQ IDNO62)以及用已經(jīng)插入了實(shí)施例2中所述方法獲得的嵌合啟動(dòng)子的各種載體質(zhì)粒pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/EF1α.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR和pGL3C/CAG.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR作模板經(jīng)PCR擴(kuò)增已經(jīng)用其他啟動(dòng)子取代了U3區(qū)的3’LTR。將PCR所得DNA片段用SaII和SacI消化、純化并分別插入pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR的SalF-SacI位點(diǎn)(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3LTRΔU3、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/CMVL.R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/EF1α.R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/CAG.R)。
包裝信號(hào)的鑒定將基因轉(zhuǎn)移載體包裝成載體顆粒需要在基因轉(zhuǎn)移載體上的作為順式作用元件的包裝信號(hào)和由包裝載體產(chǎn)生的反式作用蛋白。因?yàn)榭紤]到載體的包裝效率提高會(huì)引起其滴度的提高，所以必須向載體中插入盡可能長(zhǎng)的含有包裝信號(hào)的區(qū)域來保持包裝信號(hào)序列所形成的結(jié)構(gòu)。另一方面，基因轉(zhuǎn)移載體的包裝信號(hào)序列和包裝載體之間的重組可能產(chǎn)生野生型病毒，這種可能性能夠通過將它們之間的重疊最小化來降到最小。因此，需要鑒定包裝所需的最小區(qū)域。所以，為了有效包裝基因轉(zhuǎn)移載體以構(gòu)建載體系統(tǒng)，需要對(duì)最小包裝信號(hào)序列進(jìn)行精確鑒定。用圖4所示的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)包裝信號(hào)的這類鑒定。
將已經(jīng)導(dǎo)入了圖5所示突變的基因轉(zhuǎn)移載體的包裝效率與野生型基因轉(zhuǎn)移載體的包裝效率相比較可以解釋包裝是需要gag區(qū)域所表達(dá)的多肽還是gag區(qū)域的DNA序列本身。
新型兩種基因共表達(dá)系統(tǒng)的研制Rev效應(yīng)元件(RRE)是源自病毒的Rev蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，它與RNA從核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們?cè)u(píng)價(jià)了用單一啟動(dòng)子啟動(dòng)的同時(shí)表達(dá)兩種不同蛋白的系統(tǒng)是否能夠使用RRE/Rev系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)剪接效率來構(gòu)建。
首先，為了測(cè)定兩種不同蛋白的表達(dá)是否能夠通過RRE來調(diào)節(jié)，產(chǎn)生了如圖6所示的一種載體。更具體地說，將螢光素酶基因和β-半乳糖苷酶基因作為報(bào)道基因分別插入RRE的上游和下游。接著將剪接供體序列插入螢光素酶基因的上游并且將剪接受體序列插入RRE的下游來共構(gòu)建一種載體。如圖6所示，根據(jù)有或無剪接從這種載體中預(yù)期可以生產(chǎn)出兩種類型的mRNA。換句話說，從經(jīng)過剪接的mRNA可以生產(chǎn)出β-半乳糖苷酶蛋白，而從未經(jīng)剪接的mRNA可以生產(chǎn)出螢光素酶蛋白。另外，為了評(píng)價(jià)通過修飾RRE序列是否能夠既表達(dá)兩種不同基因又控制這兩種基因表達(dá)水平的比例，產(chǎn)生了一些載體，向各載體中插入六種類型之一的RRE序列來測(cè)定各載體中報(bào)道基因的表達(dá)水平。
如下所述產(chǎn)生插有兩種基因表達(dá)系統(tǒng)的載體和用于檢驗(yàn)RRE序列活性的載體。以pSP-luc+(Promega)作模板用引物13-1F(SEQ ID NO63)和13-1R(SEQ ID NO64)經(jīng)PCR擴(kuò)增DNA片段，該DNA片段中已在編碼螢光素酶的基因片段的5’和3’端都添加了EcoRI位點(diǎn)。另一方面，以pEGFPN2(Clontech)作模板用13-2F(SEQ ID NO65)和13-2R(SEQ ID NO66)作引物經(jīng)PCR擴(kuò)增DNA片段，該DNA片段中已在編碼EGFP的基因片段的5’和3’端都添加了EcoRI位點(diǎn)。
以pSA212作模板用14F(SEQ ID NO67)和14R(SEQ ID NO68)作引物經(jīng)PCR可以得到含5’LTR的DNA片段，將此DNA片段插入用KpnI和EcoRI消化的質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3G2/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR(pBS/5’LTR.U3Met-/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR)。以pSA212作模板將兩類引物15-1F(SEQ ID NO69)和15-2F(SEQ ID NO70)與三類引物15-1R(SEQID NO71)、15-2R(SEQ ID NO72)和15-3R(SEQ ID NO73)組合經(jīng)PCR得到含有各種RRE序列的DNA片段。將這樣得到的六種DNA片段用EcoRI和NheI或者用EcoRI和XbaI消化并純化。通過用EcoRI和NheI消化質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3Met-/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR而切出RRE序列，用六種已純化的DNA片段分別取代這些RRE序列從。將經(jīng)PCR制得并用EcoRI消化后純化的編碼螢光素酶或EGFP的基因片段插入到所得質(zhì)粒中的EcoRI位點(diǎn)用于RRE序列活性的檢測(cè)(圖7)。
下面通過取代轉(zhuǎn)變報(bào)道基因。用NheI和SalI消化含有RRE6/s(6964-7993)序列的質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3Met-/RRE6/s/β-gal/WT3’LTR來除去含有β-半乳糖苷酶編碼區(qū)的片段，然后向其中插入含有螢光素酶編碼區(qū)的NheI-XhoI片段(源自pSP-luc+；17-1723)(pBS/5’LTR.U3Met-/RREc/s/luc+/WT3’LTR)。然后，將已經(jīng)鈍端化并純化的來自pCMV-β(Clontech)的β-半乳糖苷酶編碼區(qū)的NotI片段(820-4294)插入已經(jīng)用EcoRI消化并鈍端化的pBS/5’LTR.U3Met-/RREc/s/luc+/WT3’LTR。將所得質(zhì)粒(pBS/5’LTR.U3Met-/β-gal/RREc/s/luc+/WT3’LTR)用于下列測(cè)定。按照所附說明用Blunting High(Toyobo)進(jìn)行兩種鈍端化反應(yīng)。
將以pSA212為模板用16F(SEQ ID NO74)和16R(SEQ ID NO75)引物經(jīng)PCR得到的5’LTR的DNA片段插入已經(jīng)用KpnI和EcoRI消化的質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3Met-/RREc/s/β-gal/WT3’LTR(pBS/5’LTR.U3G3/RREc/s/β-gal/WT3’LTR)。
將由PCR制備的編碼EGFP的純化基因片段用EcoRI消化后插入到pBS/5’LTR.U3G3/RREc/s/β-gal/WT3’LTR的EcoRI位點(diǎn)。所得質(zhì)粒用KpnI-SacI消化來制備含5’LTR-3’LTR的DNA片段以便將其插到pGL3對(duì)照載體(Promega)的KpnI-SacI位點(diǎn)。所得質(zhì)?？梢杂糜谠粰z驗(yàn)兩基因表達(dá)系統(tǒng)。
用上述所得基因轉(zhuǎn)移載體如下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以測(cè)定β-半乳糖苷酶和螢光素酶活性。正如圖8所示，結(jié)果表明兩種不同的基因能夠在含有RRE序列的載體中共表達(dá)且RRE序列的取代可調(diào)節(jié)這兩種基因的表達(dá)效率。另外，根據(jù)在沒有包裝載體的條件下共表達(dá)兩種不同基因的結(jié)果，反映出在本基因表達(dá)系統(tǒng)中能夠不依賴于Rev蛋白而表達(dá)兩種基因。
在兩基因共表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)啟動(dòng)子的特異性對(duì)使用RRE的兩基因共表達(dá)系統(tǒng)是否可以用于使用各種類型的啟動(dòng)子而不是上述實(shí)施例中所用的SIVagmTYO1的5’LTR啟動(dòng)子的其他表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了試驗(yàn)。將源自人巨細(xì)胞病毒(CMV)的其他啟動(dòng)子或源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子(EF1α啟動(dòng)子)用作啟動(dòng)子(圖9下圖)。
正如圖9中所示，結(jié)果表明了使用非5’LTR的啟動(dòng)子可以實(shí)現(xiàn)兩種基因的共表達(dá)。而且，發(fā)現(xiàn)根據(jù)RRE序列的存在可以調(diào)節(jié)兩種基因的表達(dá)水平。因此，這表明使用RRE的兩基因共表達(dá)系統(tǒng)可以廣泛用于使用各種類型的啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)。
報(bào)道基因的位置效應(yīng)進(jìn)行試驗(yàn)來測(cè)定將報(bào)道基因被插入RRE的上游或下游時(shí)各基因的表達(dá)水平是否變化。用SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體制備含有RRE6/s(6964-7993)序列的載體，其中將β-半乳糖苷酶和螢光素酶的位置互換(圖10中下圖)來比較兩種載體上兩種報(bào)道基因的表達(dá)水平。
正如圖10的圖所示，結(jié)果表明不論報(bào)道基因插入到RRE的上游或下游，報(bào)道基因的表達(dá)水平都沒有差異。也就是說，發(fā)現(xiàn)使用RRE序列的兩基因共表達(dá)系統(tǒng)可以用于通過1∶1摩爾比形成復(fù)合物而起作用的蛋白，特別是如各種受體和轉(zhuǎn)錄因子，的表達(dá)。
SIN載體(自我滅活載體)性能的鑒定考慮到實(shí)施例3中制備的基因轉(zhuǎn)移載體pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3’LTRΔU3缺失3’LTR的U3區(qū)，可假設(shè)作為自我滅活載體(SIN載體)提高了安全性，這種載體能夠防止相應(yīng)于整個(gè)載體的全長(zhǎng)mRNA在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。
為了測(cè)定基因轉(zhuǎn)移效率是否因變成SIN而受影響，將SIVagm SIN載體對(duì)293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染滴度與在相同條件下制備的含有野生型3’LTR的常規(guī)SIVagm載體的轉(zhuǎn)染滴度進(jìn)行比較。結(jié)果，常規(guī)型的轉(zhuǎn)染滴度是2.4-2.8TU/ml而SIVagm SIN載體的轉(zhuǎn)染滴度是2.5-2.9TU/ml。就是說，當(dāng)常規(guī)型的轉(zhuǎn)染滴度設(shè)定為100％時(shí)，SIVagm SIN載體的轉(zhuǎn)染滴度為105％。
此外，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以通過SIVagm SIN載體介導(dǎo)將EGFP基因轉(zhuǎn)染入通過輻射而使細(xì)胞周期停滯的293T細(xì)胞和由視磺酸誘導(dǎo)了終末分化的SH-SY5Y細(xì)胞。用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞周期停滯期的293T細(xì)胞中EGFP的表達(dá)進(jìn)行觀察顯示基因被高效表達(dá)(圖11中上圖)。而且，確認(rèn)在具有延伸的神經(jīng)突的細(xì)胞中表達(dá)了EGFP，該細(xì)胞認(rèn)為是SH-SY5Y細(xì)胞中分化成神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞，(圖11中下圖)。
如上所述，變成SIN后基因轉(zhuǎn)移的效率下降。
基因由SIVagm SIN載體介導(dǎo)而向外周血淋巴細(xì)胞和CD34陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)移CD34陽性細(xì)胞作為含有造血干細(xì)胞的一種級(jí)分近來受到關(guān)注(血液，第87卷，第1-13頁(yè)，1996)。因此，一旦能將基因轉(zhuǎn)移到CD34陽性細(xì)胞中，基因就能夠?qū)朐煅杉?xì)胞以及由其分化的所有類型的血細(xì)胞中。故用試驗(yàn)來評(píng)價(jià)通過SIVagm SIN載體介導(dǎo)將基因轉(zhuǎn)移入人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、人T細(xì)胞、源自人骨髓和源自臍血的CD34陽性細(xì)胞和源自恒河猴骨髓的CD34陽性細(xì)胞的可能性。
按照所附的說明，用含有200μl 0.5M EDTA的注射器將10ml人外周血收集到Lymphoprep試管(Nycomed)中，進(jìn)行PBMC的分離。以2-2.5×105/孔的細(xì)胞密度將分離的細(xì)胞鋪板至96孔塑料培養(yǎng)平板上，然后于37℃、5％CO2下在RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco BRL；含有5％滅活的牛血清)中培養(yǎng)。將分離的PBMC在含有5％FCS和5mg/ml PHA(SIGMA)的RPMI 1640中培養(yǎng)3天，向其中加入40U/ml IL2(SHIONOGI & CO)，繼續(xù)培養(yǎng)3天，以誘導(dǎo)其分化成T細(xì)胞(最新免疫學(xué)方法6.16.4)。對(duì)源自人骨髓和源自臍血的CD34陽性細(xì)胞來說，按照所附的說明書復(fù)蘇從PureCell公司購(gòu)買的冷凍細(xì)胞并以2-2.5×105/孔的細(xì)胞密度鋪板至96孔塑料培養(yǎng)平板上，接著在含有10％的BIT9500(StemCell)的IMDM(Gibco BRL)中培養(yǎng)。以2-2.5×105/孔的細(xì)胞密度將源自恒河猴(3-7歲，雄性；平均體重3.0kg)的骨髓的CD34陽性細(xì)胞鋪板至96孔塑料培養(yǎng)平板上，接著在含有10％已滅活的牛血清(INTERGEN公司；REHATUIN特級(jí)批號(hào)RB51901)的(-)MEM(SIGMA)中培養(yǎng)。
如下所述進(jìn)行載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。首先，從培養(yǎng)基中取出等份試樣的上清液，在其上層添加實(shí)施例1中所述方法濃縮的載體pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3’LTRΔU3(滴度＝1-7×109TU/ml)至總體積50μl。然后，在32℃以200G將PBMC離心30分鐘并在37℃、5 ％CO2中培養(yǎng)3小時(shí)。將200μl的培養(yǎng)基鋪到其上層并將混合物培養(yǎng)48小時(shí)。對(duì)CD34陽性細(xì)胞來說，添加了載體后不離心，在37℃、5％CO2中將細(xì)胞培養(yǎng)3小時(shí)，在其上層加200μl培養(yǎng)基。將混合物培養(yǎng)48小時(shí)。
用流式細(xì)胞儀確認(rèn)EGFP基因的轉(zhuǎn)移。首先，從培養(yǎng)孔中收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用含有3％FCS和0.05％NaN3的PBS沖洗。然后，按照所附的說明，將細(xì)胞的表面抗原用PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的抗-CD3抗體、PE-標(biāo)記的抗-CD14抗體和PE-標(biāo)記的抗-CD19抗體(BectonDickinson)染色。染色后，洗滌細(xì)胞，然后用含有1％PFA的PBS固定以用于流式細(xì)胞儀分析。
結(jié)果表明在90m.o.i.時(shí)51.8 ％的人PBMC是EGFP陽性。盡管EGFP表達(dá)細(xì)胞的百分比隨著m.o.i.而增加，但m.o.i.為36時(shí)EGFP陽性細(xì)胞的百分率是45％而m.o.i.高于此值時(shí)百分率的升高不超過大約50％。另外，用非濃縮的載體沒有識(shí)別到基因的轉(zhuǎn)移(圖12)。對(duì)從人PBMC誘導(dǎo)的T細(xì)胞來說，在載體轉(zhuǎn)染的48小時(shí)后的分析中，m.o.i.為50時(shí)在14.5％的細(xì)胞中識(shí)別到EGFP的表達(dá)，但是用非濃縮的載體沒有識(shí)別到基因的轉(zhuǎn)移(圖13)。當(dāng)m.o.i.為30時(shí)用源自人骨髓或源自臍血的CD34陽性細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移時(shí)，在26％的骨髓細(xì)胞(圖14)或在11％的臍血細(xì)胞(圖15)中表達(dá)了EGFP。發(fā)現(xiàn)在源自猴骨髓的CD34陽性細(xì)胞中轉(zhuǎn)移效率隨m.o.i.而增加，并且在m.o.i.為100時(shí)EGFP表達(dá)的百分比是58％(圖16)。
上述結(jié)果顯示SIVagm SIN載體能夠高效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)PBMC、T細(xì)胞和源自骨髓及源自臍血的CD34陽性細(xì)胞。
用SIVagm SIN載體將基因?qū)隒D34陽性細(xì)胞后用該細(xì)胞重建造血系統(tǒng)使NOD/Lt小鼠(一種IDDM(胰島素依賴型糖尿病)小鼠)與SCID小鼠(一種免疫缺陷小鼠)回交產(chǎn)生NOD/SCID小鼠株，其中所述SCID小鼠是已降低了NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體的活性且源自SCID小鼠的T-細(xì)胞和B-細(xì)胞均已缺陷的聯(lián)合免疫缺陷小鼠(免疫學(xué)雜志，第154卷，第180-191頁(yè)，1995)。從Clea Japan購(gòu)買屬于該動(dòng)物系的NOD/Shi-scid Jic小鼠(6周齡雄性)并喂養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)。
將多能人細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠中以重建造血系統(tǒng)，使人的血細(xì)胞在小鼠體內(nèi)循環(huán)(Nat.Med.，第2卷，第1329-1337頁(yè)，1996)。將這種系統(tǒng)用來評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)移后由CD34陽性細(xì)胞引起的造血系統(tǒng)的重建以及用來評(píng)價(jià)其后血細(xì)胞中EGFP的表達(dá)(SCID種群恢復(fù)細(xì)胞試驗(yàn))。
首先，將8周齡雄性NOD/SCID小鼠暴露在半致死劑量(300rad)輻射下。用日立MBR-1520R在150kv試管電壓、20mA試管電流、0.5A1和0.1Cu濾膜(filter)下進(jìn)行輻射。在輻射后的幾小時(shí)內(nèi)，用Myjector(帶針頭的Terumo29Gx1/2”注射器)經(jīng)尾靜脈注射移植細(xì)胞。
用于移植的細(xì)胞是源自人臍血的CD34細(xì)胞(PureCell)。用實(shí)施例9中所述的相同方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和SIVagm SIN載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。以100m.o.i.進(jìn)行感染。在載體感染后將細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)、收獲、用IMDM(Gibco BRL)洗滌并以細(xì)胞密度1-3×106/ml懸浮于IMDM中。每只動(dòng)物移植1×105個(gè)所得細(xì)胞/100μl。
移植后，將這些動(dòng)物置于P3實(shí)驗(yàn)室級(jí)安全籠中無菌飼養(yǎng)。用4組小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組包括10只小鼠。向28只小鼠移植含有轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞；向6只小鼠移植沒有處理的細(xì)胞，剩余6只小鼠不進(jìn)行移植，接著飼喂所有小鼠。在總共40只動(dòng)物中，移植后6周時(shí)有25只存活，說明有60％的存活率。選5只存活的個(gè)體收集人細(xì)胞，其中2只移植了含有轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞，3只移植了未處理的細(xì)胞。
移植的4-6周后收集外周血液。用剃刀截?cái)辔察o脈，收集50-100μl的外周血液并與10μl的0.5M的EDTA混合來防止凝固。向收集的血液中加入700μl的蒸餾水并吹打幾次來裂解紅細(xì)胞。再將700μl的2×PBS加入混合物中，混合，然后離心(5000rpm，1分鐘)以回收外周血總白細(xì)胞。將所回收的白細(xì)胞懸浮于50μl的含有3％FCS和0.05％NaN3的PBS中，再向其中加入2μl的PE標(biāo)記的抗人CD45抗體(Coulter)。將混合物冰浴孵育30分鐘，用含有3％FCS和0.05％NaN3的PBS洗兩次，用含有1％PFA的PBS固定以備流式細(xì)胞術(shù)分析。用兩種顏色進(jìn)行分析來檢測(cè)小鼠白細(xì)胞中的人CD45-陽性細(xì)胞并檢測(cè)表達(dá)EGFP的細(xì)胞。
結(jié)果表明移植了人CD34陽性細(xì)胞的小鼠的外周血中10-50％的白細(xì)胞表達(dá)人CD45。在移植了人CD34陽性細(xì)胞的小鼠的外周血白細(xì)胞中有20％的人CD45-陽性細(xì)胞有EGFP的表達(dá)(圖17)，其中所述CD34陽性細(xì)胞已用SIVagm SIN載體導(dǎo)入了EGFP基因。
在下列(1)-(7)中描述了實(shí)施例中通用的方法。
(1)細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％滅活型胎牛血清的D-MEM(GibcoBRL)中培養(yǎng)源自人胚腎細(xì)胞系的293T細(xì)胞(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，第90卷，第8392-8396頁(yè)，1993)。293T細(xì)胞用蚜棲菌素處理(Galbiochem；以20μg/ml的終濃度處理48小時(shí)；停滯在G1-S期)或用X-射線輻射(以200rad/分鐘輻射20分鐘后，將細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)；在G2-M期停滯)來使細(xì)胞周期停滯。在含有10％滅活型胎牛血清的RPMI1640(GibcoBRL)中培養(yǎng)人的成神經(jīng)細(xì)胞RBTM1和SH-SY5Y(癌癥研究，第58卷，第2158-2165頁(yè)，1998)。通過全反型視磺酸(Sigma；以5μmol/ml的終濃度培養(yǎng)7天)處理來誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。這些細(xì)胞應(yīng)一直培養(yǎng)在塑料平板(Sumitomo Bakelite)中。
(2)制備大鼠腦細(xì)胞原代培養(yǎng)物的一般方法在含有5％滅活型胎牛血清和5％滅活型馬血清(Gibco BRL)的D-MEM(Gibco BRL)中培養(yǎng)來自大鼠腦的原代培養(yǎng)細(xì)胞。用下列方法制備原代培養(yǎng)細(xì)胞。用二乙醚深度麻醉懷孕18天的SD大鼠，然后經(jīng)腋動(dòng)脈放血行安樂死。確認(rèn)死亡后，通過剖腹術(shù)將子宮和胎兒整體切出。從子宮內(nèi)無菌切除的胎兒的頭部得到腦并將其放置在工作液(含有50％的D-MEM，50％PBS(Gibco BRL)，5×104U/L青霉素(Gibco BRL)和50mg/L鏈霉素)中。然后在立體顯微鏡下除去腦半球上的腦干和腦膜部分。用工作液沖洗腦組織一次，然后用手術(shù)刀將其切成條。用木瓜蛋白酶處理(在32℃，在含有1.5U/ml木瓜蛋白酶(Worthington Biochem)、0.2mg/ml半胱氨酸(Nacarai)、0.2mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)、5mg/ml葡萄糖(和光)和0.1mg/ml的DNA酶I(GibcoBRL)的溶液中通過重復(fù)顛倒混合30分鐘)后，通過吹打使細(xì)胞懸浮并離心(1200rpm，5分鐘)收獲。所收集的腦細(xì)胞用含有5％滅活的馬血清、5％滅活的胎牛血清、5×104U/L青霉素和50mg/L鏈霉素的D-MEM洗兩次。然后測(cè)定細(xì)胞數(shù)，以1-3×106每孔的細(xì)胞密度將細(xì)胞鋪板至已用聚-L-賴氨酸(CellTight PL，Sumitomo Bakelite)包被的6孔平板上，在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5％CO2)培養(yǎng)。
(3)轉(zhuǎn)染按照所附的說明用LIPOFECTAMINEPLUS(Gibco BRL)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的所有步驟。以5×105每孔的細(xì)胞密度將293T細(xì)胞鋪板至6孔塑料平板(Sumitomo Bakelite)上并在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，10％CO2)培養(yǎng)48小時(shí)。在轉(zhuǎn)染的30分鐘前，將培養(yǎng)基換為800μl/孔OptiMEM(Gibco BRL)，然后繼續(xù)培養(yǎng)。用于轉(zhuǎn)染的DNA的量為300ng/孔基因轉(zhuǎn)移載體和600ng/孔包裝載體或空白載體。將DNA溶于100μl OptiMEM中后，向其中加入6μl的PLUS試劑(Gibco BRL)，攪拌，室溫靜置15分鐘。向DNA和PLUS試劑(GibcoBRL)的混合物中加入用100μl OptiMEM稀釋的4μlLIPOFECTAMINE等份試樣，攪拌，室溫再靜置15分鐘。將上述方法制備的含有DNA和LIPOFECTAMINE的復(fù)合物的溶液滴加在6孔平板上培養(yǎng)的293T細(xì)胞上，輕輕攪拌，然后在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，10％CO2)培養(yǎng)3小時(shí)。完成培養(yǎng)后，給培養(yǎng)基中每孔加入1ml含有20％滅活的胎牛血清的D-MEM，然后在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，10％CO2)孵育48小時(shí)以備β-半乳糖苷酶和螢光素酶的測(cè)定。
(4)β-半乳糖苷酶和螢光素酶的測(cè)定按照所附的說明，分別用β-gal發(fā)光檢測(cè)試劑盒II(Clontech)和螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行β-半乳糖苷酶和螢光素酶的測(cè)定。所用的樣品是細(xì)胞的裂解物，它們是通過用800μl/孔報(bào)道裂解緩沖液(Reporter Lysis Buffer)裂解經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，在4℃以12000g離心5分鐘并分離上清而得到。在β-半乳糖苷酶測(cè)定中，將20μl的細(xì)胞裂解液和100μl的底物溶液混合，然后室溫靜置1小時(shí)，接著用發(fā)光計(jì)(AutoLumat LB953，berthold)測(cè)10秒鐘發(fā)光強(qiáng)度。在螢光素酶測(cè)定中，將20μl的細(xì)胞裂解液和100μl的底物溶液混合并馬上用發(fā)光計(jì)(AutoLumat LB953，berthold)測(cè)10秒鐘發(fā)光強(qiáng)度。在兩種測(cè)定中，每次測(cè)定都用一式三份的樣品進(jìn)行以測(cè)定平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
(5)PCR用PCR Supermix High Fidelity(Gibco BRL)進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的所有步驟。以1μg模板DNA作底物，以終濃度為1nmol/ml的兩種合成寡核苷酸作引物，將它們添加至90μl反應(yīng)溶液中。用蒸餾水將混合物的總體積調(diào)整到100μl，然后在熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR系統(tǒng)9600；Perkin Elmer)中進(jìn)行反應(yīng)。首先將樣品在94℃加熱一分鐘，然后以94℃30秒、55℃30秒和68℃90秒進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，再在68℃保持5分鐘。DNA用Wizard DNA Clean-upSystem(Promega)處理反應(yīng)溶液來純化，用所需的限制酶消化，然后用1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳(SeaPlaque GTG瓊脂糖；FMC Biochem；溶于TAE緩沖液)分離。從凝膠中切出所需大小的DNA片段并用Wizard PCR PrepsDNA Purification System(Promega)純化以備連接反應(yīng)。
(6)SIVagm載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的一般方法以5×105每孔的細(xì)胞密度將293T靶細(xì)胞鋪板至6孔塑料平板(SumitomoBakelite)上并在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，10 ％CO2)培養(yǎng)48小時(shí)以用于測(cè)定。將含有終濃度8μg/ml的Polybrene(Sigma)的載體溶液平鋪到靶細(xì)胞上用來導(dǎo)入載體。載體感染的48小時(shí)后，以X-gal作底物用β-Gal染色試劑盒(Invitrogen)給靶細(xì)胞染色，然后在倒置顯微鏡(DMIRB(SLR)；Leica)下觀察來檢測(cè)靶細(xì)胞中β-半乳糖苷酶的表達(dá)。測(cè)定用X-gal染色成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)，將能使一個(gè)293T細(xì)胞表達(dá)β-半乳糖苷酶的載體量計(jì)算為1個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)。
(7)用抗體染色基因轉(zhuǎn)移細(xì)胞的一般方法載體感染的48小時(shí)后，靶細(xì)胞用PBS(日研生物醫(yī)學(xué)研究所)洗，在室溫下用含有4％低聚甲醛(和光)的PBS固定30分鐘，用PBS洗三次，每次5分鐘，然后將其置室溫下用含有2％正常山羊血清(Gibco BRL)的PBS封閉1小時(shí)。針對(duì)源自大鼠腦的已分化神經(jīng)元的第一抗體，使用經(jīng)含2％正常山羊血清的PBS將抗-MAP-2單克隆抗體(小鼠IgG，BOEHRINGERMANHEIM)稀釋到2μg/ml制得的溶液。針對(duì)導(dǎo)入了β-半乳糖苷酶的細(xì)胞的第一抗體，使用經(jīng)含2％正常羊血清的PBS稀釋抗大腸桿菌的β-半乳糖苷酶多克隆抗體(兔；5 prime→3 prime，Inc.)到濃度8.2μg/ml制得的溶液。在37℃反應(yīng)30分鐘。與第一抗體反應(yīng)后，細(xì)胞用PBS洗三次，每次5分鐘，然后與第二抗體反應(yīng)。10μg/ml用Texas Red標(biāo)記的抗小鼠IgG多克隆抗體(山羊；EY LABORATORIES公司)，或4μg/ml用Alexa568標(biāo)記的抗小鼠IgG多克隆抗體(山羊；分子探針公司)用含2％正常羊血清的PBS稀釋后作為針對(duì)已導(dǎo)入EGFP的大鼠腦細(xì)胞的第二抗體。另一方面，對(duì)已導(dǎo)入β-半乳糖苷酶的大鼠腦細(xì)胞，分別使用經(jīng)Alexa488標(biāo)記的抗小鼠IgG多克隆抗體(山羊；分子探針公司)和經(jīng)Alexa568標(biāo)記的抗兔IgG多克隆抗體(山羊；分子探針公司)用含2％正常山羊血清的PBS稀釋到4μg/ml的溶液。對(duì)已導(dǎo)入β-半乳糖苷酶的非大鼠腦細(xì)胞的細(xì)胞，使用以含2％正常山羊血清之PBS稀釋的4μg/ml經(jīng)Alexa568標(biāo)記之山羊抗兔IgG多克隆抗體。所有與第二抗體的反應(yīng)都是在37℃下進(jìn)行30分鐘。與第二抗體反應(yīng)后，靶細(xì)胞用PBS洗三次，每次5分鐘，將PBS覆蓋其上，然后在倒置顯微鏡(DMIRB(SLR)；Leica)下觀察熒光以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了能夠用RRE序列表達(dá)兩種外源基因的載體。在該載體中通過修飾RRE序列可以調(diào)節(jié)兩種外源基因的表達(dá)水平的比例。此外，通過修飾源自病毒的調(diào)控序列能夠克服對(duì)病毒蛋白的依賴性，從而表達(dá)來源的蛋白。通過在載體中使用含包裝信號(hào)的最小區(qū)降低了經(jīng)基因重組向野生型回復(fù)的危險(xiǎn)，并因此提高了載體的安全性。本發(fā)明的載體適合于在基因治療等中使用。
序列表<110>株式會(huì)社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>用于表達(dá)兩種外源基因的載體<130>D3-008PCT<140><141><150>JP 1999-175646<151>1999-06-22<160>76<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>1gcagatctca accaggaggc gaggctgcat tttggg 36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>2gcgaattcta cttactggtg ctgtaaagga gccaaa 36<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3atcggaattc ttttattgta agatggattg gtttttaaat40<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4cgggatccgc ggccgcggat atggatctgt ggagatagag gaacatat 48<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5tcgagactag tgacttggtg agtaggctt29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6tcgaaagcct actcaccaag tcactactc29<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的寡核苷酸序列<400>7aatttctcga gcggccgca 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的寡核苷酸序列<400>8aatttgcggc cgctcgaga 19<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>9gcggtacctg gatgggattt attactccga tagga35<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10gcgaattcga tagggcttga aacatgggta ctatttctgc 40<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>11gcgaattccc gtttgtgcta gggttcttag gcttct 36<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12tccccgcgga tatggatctg tggagataga ggaacatatc 40<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13gcgcggccgc ggatccgtcg acgcactttt taaaagaaaa ggga44<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>14gcgagctcta atgcaggcaa gtttattagc tttcta 36<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15ggaattcccg cggtagttat taatagtaat caattacggg40<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>16cgggatccgc ggccgcttac ttgtacagct cgtccatgcc40<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>17atcggaattc ttttattgta agatggattg 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權(quán)利要求
1.一種用于表達(dá)兩種外源基因的載體DNA，該載體DNA從5’端到3’端依次含有下列部分(a)表達(dá)調(diào)控序列；(b)剪接供體序列；(c)第一種外源基因插入位點(diǎn)；(d)RRE核心序列；(e)剪接受體序列；和(f)第二種外源基因插入位點(diǎn)。
2.一種用于表達(dá)兩種外源基因的載體DNA，該載體DNA從5’端到3’端依次含有下列部分(a)表達(dá)調(diào)控序列；(b)剪接供體序列；(c)RRE核心序列；(d)第一種外源基因插入位點(diǎn)；(e)剪接受體序列；和(f)第二種外源基因插入位點(diǎn)。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的載體DNA，其中的RRE核心序列源自逆轉(zhuǎn)錄病毒。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的載體DNA，其中的RRE核心序列源自慢病毒。
5.按照權(quán)利要求1或2所述的載體DNA，其中的RRE核心序列源自免疫缺陷病毒。
6.按照權(quán)利要求1到5的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中的表達(dá)調(diào)控序列含有LTR。
7.按照權(quán)利要求1到6的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中的表達(dá)調(diào)控序列是含有除LTR以外的另一種表達(dá)調(diào)控序列的序列。
8.按照權(quán)利要求7所述的載體DNA，其中除LTR以外的另一種表達(dá)調(diào)控序列選自CMVL啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和EF1α啟動(dòng)子。
9.按照權(quán)利要求1到8的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中的剪接供體序列和剪接受體序列源自逆轉(zhuǎn)錄病毒。
10.按照權(quán)利要求1到8的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中的剪接供體序列和剪接受體序列源自慢病毒。
11.按照權(quán)利要求1到8的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中的剪接供體序列和剪接受體序列源自免疫缺陷病毒。
12.按照權(quán)利要求1到11的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中所述的載體DNA進(jìn)一步在其可轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)包含一個(gè)包裝信號(hào)。
13.按照權(quán)利要求12所述的載體DNA，其中包裝信號(hào)源自逆轉(zhuǎn)錄病毒。
14.按照權(quán)利要求12所述的載體DNA，其中包裝信號(hào)源自慢病毒。
15.按照權(quán)利要求12所述的載體DNA，其中包裝信號(hào)源自免疫缺陷病毒。
16.按照權(quán)利要求13到15的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中這種載體DNA經(jīng)構(gòu)建可以不表達(dá)完整的gag蛋白。
17.按照權(quán)利要求13到16的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中g(shù)ag蛋白的翻譯起始密碼子已突變。
18.按照權(quán)利要求1到17的任何一項(xiàng)所述的載體DNA，其中將第一種外源基因和第二種外源基因插入到了這種載體DNA中。
19.一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在其病毒顆粒中含有來自權(quán)利要求12到17所述的任何一種載體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中已經(jīng)將第一種外源基因和第二種外源基因插入到了該載體DNA中。
20.一種慢病毒載體，在其病毒顆粒中含有來自權(quán)利要求12到17中任何一項(xiàng)所述的載體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中該載體DNA中已經(jīng)插入了第一種外源基因和第二種外源基因。
21.一種免疫缺陷病毒載體，在其病毒顆粒中含有來自權(quán)利要求12到17中任何一項(xiàng)所述的載體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中該載體DNA中已經(jīng)插入了第一種外源基因和第二種外源基因。
22.一種制備病毒載體的方法，該方法包括將權(quán)利要求12到17的任何一項(xiàng)所述的載體DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞的步驟，其中該載體DNA中已經(jīng)插入了第一種外源基因和第二種外源基因，以及從該細(xì)胞的培養(yǎng)上清中收集所產(chǎn)生的病毒顆粒的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用RRE序列表達(dá)兩種外源基因并通過修飾來控制這些基因的表達(dá)量之比的載體。可作為基于SIVagm的慢病毒載體提供的這種載體,通過將病毒來源的表達(dá)調(diào)控序列修飾成另一表達(dá)調(diào)控序列以消除對(duì)病毒來源的蛋白的依賴而構(gòu)建。盡管這種載體含有包裝信號(hào),但是它已通過修飾降低了因基因重組可能出現(xiàn)野生型病毒株的風(fēng)險(xiǎn)并且不再表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白。這種載體作為需要轉(zhuǎn)移兩種基因同時(shí)又要控制它們的表達(dá)量或表達(dá)量之比的基因治療載體是非常有用的。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1364197SQ00807913
公開日2002年8月14日 申請(qǐng)日期2000年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月22日
發(fā)明者中島俊洋, 中丸健治, 長(zhǎng)谷川護(hù), 速水正憲, 井戶榮治 申請(qǐng)人:株式會(huì)社載體研究所