專利名稱：：霍山石斛及其相似種的分子標記指紋圖譜的構建和鑒別方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及石斛種質指紋圖譜的構建及其鑒定方法。
背景技術：
：霍山產可加工為優(yōu)質楓斗的有三種石斛，首推霍山石斛?；羯绞址Q米斛(Zfe/7c/ro力i湖力i/os力a/7e/seC.Z.TangetS.J.Cheng)，是屬于含粘多糖為主的一類藥用石斛，以其嚼之味甘，粘牙，無渣，有特殊療效，而被譽為中華仙草之最，同屬此類的還有霍山產鐵皮石斛(Zfe"o!roZ^，ca/7A't/wz#a7ZexLindl.)，但此兩者均資源匱乏，長期以來有市無貨，今國內外市場凡冠以"霍山石斛"，"霍斗"，"金霍斗"的楓斗類商品，均非前兩者加工而成，而多以霍山產銅皮石斛(又稱細莖石斛"e/7rfro力i"歷歷ow'"'/br歷e(L.)Sw.)加工而成，盡管從含粘多糖的性質及含量判斷，這幾者都可加工成質量很好的楓斗產品，但從科學的角度和中藥的發(fā)展來認識，此三種石斛及其相似種應加以區(qū)分，以利于各自的研究與開發(fā)工作深入進行，因此，準確鑒別霍山石斛及其相似種成了當務之急。1994年,加拿大蒙特利爾大學Zietkiewicz等首次發(fā)明了串聯(lián)重復序列區(qū)間片段多態(tài)性標記(ISSR，Intersimplesequencer印eat，ISSR)技術，之后ISSR分子標記技術在全世界不斷得到推廣和應用。由于SSR序列在基因組中廣泛分布(Roderetal.，1998)，且等位變異特別豐富，因此ISSR與其它分子標記技術RFLP、AFLP和RAPD相比，可以檢測到更高的多態(tài)性，同時錨定堿基使基因組上只有那些與錨定堿基匹配的位點才能被靶定，避免了SSR在基因組上的滑動，大大提高了PCR擴增的穩(wěn)定性和可重復性，因而ISSR分子標記技術非常適合于種間和種下關系的分析。本發(fā)明研究利用ISSR分子標記方法來鑒定霍山石斛及其相似種，通過對霍山石斛及其相似種植物的ISSR分子標記指紋圖譜研究，發(fā)現(xiàn)霍山石斛及其相似種多態(tài)性豐富，存在較大的、穩(wěn)定的差異。雖然通過PCR產物測序，依據(jù)序列來鑒定藥用植物的方法具有科學性和可靠性，但存在成本高、程序復雜和耗時長等缺點。
發(fā)明內容為了解決現(xiàn)有技術鑒定藥用植物的方法成本高、程序復雜和耗時長的問題，本發(fā)明提供一種鑒定操作簡便快捷、重復性好、分辨率高的霍山石斛及其相似種的分子標記指紋圖譜的構建和鑒別方法。本發(fā)明的具體操作，包括以下步驟霍山石斛及其相似種的分子標記指紋圖譜的構建和鑒別方法包括新鮮石斛的預處理、DNA的提取、ISSR-PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳；其中所述新鮮石斛的預處理將新鮮石斛避光6個小時以上消耗淀粉；取消耗淀粉后的新鮮石斛10克，放入比例為3:1的50克以上的丙酮和水混合溶液中浸泡兩天，再用50克以上的蒸餾水浸泡1小時，最后用50克以上無水乙醇浸泡二次，每次10分鐘，將浸泡物擦干，為DNA的提取備用；所述ISSR-PCR擴增利用所提取的DNA作為模板，在MJResearchPTC.200型擴增儀上進行ISSR-PCR擴增；PCR反應體系特征為模板濃度25ng/L，引物濃度0.5|nmol/L，Mg2+濃度2.0mmol/L，dNTP濃度20(Vmol/L，Taq聚合酶濃度1U/20pl;制備20pl反應體系，在200)^1的PCR管中加入如下量的物質因素水平母液加入量Taq酶1U5U/pl0.2|alMg2+2.0腿ol/L25mmol/L1.6^1模板DNA50ng25ng/pi2jald證0.2畫1/L10國ol/L0.4^1引物0.5fjmol/L10(_imol/L1jxlPCRBufferIXPCRBuffer10XPCRBuffer2pi雙蒸水//12.8^1總體積//20|aL擴增程序條件為94'C預變性8分鐘,94'C變性45秒，58-62。C退火45秒,72'C延伸2分鐘，擴增40個循環(huán),最后于72X:終延伸10分鐘；所用的ISSR-PCR擴增引物為下表中所列單引物中的1條引物或1條以上的引物的<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>多于一條引物時，每種引物加入量相同，減少相應水的用量，保持總體積不變；霍山石斛及其相似種的ISSR-PCR分子標記指紋圖譜的構建把ISSR-PCR擴增反應得到不同新鮮石斛樣品的擴增產物通過凝膠電泳，根據(jù)呈現(xiàn)的條帶建立圖譜以石斛品系編號為橫坐標，以條帶存在的位點編號為縱坐標，在每一縱橫坐標交結處，有擴增帶用"一"表示，沒有擴增帶不作標記，"有"帶或"無"帶以總亮度值作為選擇依據(jù)，采用Bandscan軟件，選取亮度值在》0.4的有擴增帶用"一"，<0.4的為沒有擴增帶，制得8個品系的石斛DNA指紋圖譜如下；<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>利用構建的8個品系的石斛DNA指紋圖譜鑒定霍山石斛把未知樣品在上述條件下所建立的指紋圖譜與已得的霍山石斛指紋圖譜相比較，與霍山石斛圖譜相同即為霍山石斛，否則不是霍山石斛。本發(fā)明的有益技術效果體現(xiàn)在下述幾個方面1)、本發(fā)明采用ISSR分子標記技術來構建石斛的指紋圖譜，對在幼苗期材料即可進行鑒定，對于保證藥材基源的準確性和穩(wěn)定性具有重要的作用，與利用化學色譜指紋圖譜鑒定相比取樣少、取樣時期隨意、不受植物生長環(huán)境條件影響；與利用分子測序鑒定相比環(huán)節(jié)簡單，通過對石斛屬植物的DNA的提取，ISSR的PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳就能得到準確可靠的鑒別圖譜，省力、省時、省錢。2)、本發(fā)明提供了有效材料預處理方法，利于野外采集保存和提取石斛高質量DNA。3)、本發(fā)明對PCR擴增的反應體系及擴增程序進行了優(yōu)化，使結果更為穩(wěn)定和可靠。4)、采用本發(fā)明構建的石斛DNA指紋圖譜，可以根據(jù)需要不斷增加和更新，以滿足發(fā)展的需要。5)、利用本發(fā)明所提供的指紋圖譜很容易實現(xiàn)石斛種質鑒定的自動化。6)、本發(fā)明所采用的指紋圖譜構建及種質鑒定方法，除了可以應用于石斛的種質鑒定之外，還可以應用其它物種的種質鑒定。7)、本發(fā)明的所選擇引物的擴增產物多態(tài)性高，基因分型能力非常強，可用于種間鑒別和種內居群間的鑒別。圖1為本發(fā)明所收集的8個石斛品系的ISSR標記分析電泳圖。圖2為5個石斛品系的ISSR—PCR實驗結果電泳圖。具體實施例方式下面結合附圖，通過實施例對本發(fā)明作進一步地描述。實施例1本實施例采用收集到的8個在藥用價值和形態(tài)上與霍山石斛具有相似性的石斛品系的葉片作為供試材料，提取基因組總DNA，進行指定引物的ISSR分子標記分析，以凝膠電泳呈現(xiàn)的條帶建立各供試樣品的ISSR-PCR分子標記指紋圖譜，將所構建的ISSR-PCR分子標記指紋圖譜用于石斛的種質鑒定。具體操作步驟如下1)、收集新鮮石斛樣品預處理；將新鮮石斛避光6個小時以上消耗淀粉；取避光處理后新鮮的石斛葉片10克，放入50克以上的比例為3:1的丙酮和水混合溶液中保存兩天，取出材料，再用50克以上蒸餾水浸泡一小時，再取出材料，最后用50克以上無水乙醇浸泡二次，每次10分鐘，擦干備用。2)、石斛樣品基因組DNA的提取；用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法，CetylTrimethylAmmoniumBromide)提取石斛葉片基因組DNA。操作如下(1)將預處理后的石斛葉片放入冰凍過的陶瓷研缽中，并加入適量石英沙，然后多次加入液氮充分研磨至粉末狀，用藥匙將葉片粉末轉移到10ml預冷Eppendorf離心管中，粉末的高度達到離心管的1/3處，停止加入粉末。(2)在離心管中加入4ml65'C預熱的CTAB提取緩沖液[2。/。(v/w)CTAB，1.4MNaCI，，20mMEDTA，100mMTris-HCl(PH8.0)，2%巰基乙醇]。(3)65。C溫浴2h(中間每10min反轉12次)。(4)15000卬m離心8min，將上清液轉入另一離心管中。(5)冷卻至室溫后，輕柔加入等體積氯仿異戊醇(24:1),輕緩顛倒40min。(6)15000rpm室溫離心10min，去沉淀，將上清液轉入另一離心管中。(7)在上清液加入2/3體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，一2(TC放置1.5h以上。(8)離心去上清液(15000rpm，10min)。(9)用2ml75X乙醇洗兩次以去除鹽，無水乙醇一次。(10)倒去乙醇，37。C干燥(20min)，溶于600^L緩沖液，轉移到1.5ml。離心管中。(11)加入5pLRnaseA(終濃度為50)aL/2mL，37。C溫浴lh。(12)用等體積的酚、氯仿和異戊醇溶液對上述步驟(11)產生的溶液抽提2次，按體積比，酚氯仿異戊醇=25:24:1。(13)離心取上清(15000rpm，10min)。(14)加入2倍體積的無水乙醇，.20。C保溫lh(20min翻轉一次)。(15)15000rpm離心，一20~C預冷75%乙醇洗滌2-3次，無水乙醇一次。(16)37'C溫浴干燥，得石斛基因DNA，加入100ixLTE緩沖液溶解備用，4'C保存。3)、ISSR-PCR擴增利用所提取的石斛基因DNA作為模板，在MJResearchPTC.200型擴增儀上進行ISSR-PCR擴增；PCR反應體系特征為模板濃度25ng/L，引物濃度0.5nmol/L，Mg2+濃度2.0mmol/L，dNTP濃度200pmol/L，Taq聚合酶濃度lU/20pl;以20^1反應體系為例，在20(^1的PCR管中加入如下量的物質:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>擴增程序條件為94'C預變性8分鐘，94'C變性45秒，58-62'C退火45秒,72'C延伸2分鐘，擴增40個循環(huán),最后于72'C終延伸10分鐘；所用的ISSR-PCR擴增引物為下表中所列單引物中的1條引物或1條以上的引物的組合。經(jīng)過幾百條引物的試驗比較，所選引物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>多于一條引物時，每種引物加入量相同，減少相應水的用量，保持總體積不變.兩條引物的20pl反應體系為例，加入量如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCRBufferIXPCRBuffer10XPCRBuffer2pi水//11.8^1總體積//20^LISSR-PCR擴增反應得到不同石斛樣品的擴增產物貯存在一20'C冰箱中;4)、瓊脂糖凝膠電泳ISSR-PCR擴增反應結束后，取擴增產物5nL-15nL在1.5%的瓊脂糖凝膠上于3V/cm的電壓下電泳2.5h，經(jīng)EB顯色，并用凝膠成像儀記錄擴增產物的凝膠電泳結果，電泳結果見圖1。圖1為8個石斛品系的ISSR標記分析電泳圖(引物序列為5，-(AC)8CG-3')，泳道M為GeneRuler"1lOObpDNALadder,Y陰性對照，1富陽鐵皮石斛、2荔波鐵皮石斛、3霍山石斛、4金釵石斛、5束花石斛、6馬鞭石斛、7環(huán)草石斛、8廣東石斛。圖2為5個石斛品系的ISSR—PCR實驗結果電泳圖(引物序列為5，-(AC)8CT-3，)，泳道1DNAMarker1(GeneRulerTMlOObpDNALadder,MBI)，2霍山產米斛$X銅皮早，3霍山產鐵皮石斛，4霍山石斛，5霍山產銅皮石斛，6霍山產銅皮古X鐵皮早，7陰性對照，8DNAMarker2(IDMarker2000，TAKARA)。5)、各供試樣品的ISSR-PCR分子標記指紋圖譜的構建把ISSR-PCR擴增反應得到不同新鮮石斛樣品的擴增產物通過凝膠電泳，根據(jù)呈現(xiàn)的條帶建立圖譜以石斛品系編號為橫坐標，以條帶存在的位點編號為縱坐標，在每一縱橫坐標交結處，有擴增帶用"一"表示，沒有擴增帶不作標記，"有"帶或"無"帶以總亮度值作為選擇依據(jù)，采用Bandscan軟件，選取亮度值在》0.4的有擴增帶用"一",<0.4的為沒有擴增帶，由圖l所得記錄結果制得下表；8個品系石斛DNA指紋圖譜區(qū)間編號12345678900bp-800bp1—2——800bp-700bp3——4_700bp-600bp,600bp-500bp7500bp-400bp89400bp-300bp1Q11300bp-200bp1213200bp-lOObplOObp-80bp|$80bp-0bp18實施例2:利用構建的8個品系的石斛DNA指紋圖譜鑒定霍山石斛取未知樣品按實施例1的方法建立指紋圖譜，將未知樣品的指紋圖譜與已得的8個品系的石斛DNA指紋圖譜相比較，與霍山石斛圖譜相同即為霍山石斛，否則不是霍山石斛。權利要求1、霍山石斛及其相似種的分子標記指紋圖譜的構建和鑒別方法，包括新鮮石斛的預處理、DNA的提取、ISSR-PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳，其特征在于所述新鮮石斛的預處理將新鮮石斛避光6個小時以上消耗淀粉；取消耗淀粉后的新鮮石斛10克，放入比例為31的50克以上的丙酮和水混合溶液中浸泡兩天，再用50克以上的蒸餾水浸泡1小時，最后用50克以上無水乙醇浸泡二次，每次10分鐘，將浸泡物擦干，為DNA的提取備用；所述ISSR-PCR擴增利用所提取的DNA作為模板，在MJResearchPTC.200型擴增儀上進行ISSR-PCR擴增；PCR反應體系特征為模板濃度25ng/L，引物濃度0.5μmol/L，Mg2+濃度2.0mmol/L，dNTP濃度200μmol/L，Taq聚合酶濃度1U/20μl；制備20μl反應體系，在200μl的PCR管中加入如下量的物質擴增程序條件為94℃預變性8分鐘，94℃變性45秒，58-62℃退火45秒，72℃延伸2分鐘，擴增40個循環(huán)，最后于72℃終延伸10分鐘；所用的ISSR-PCR擴增引物為下表中所列單引物中的1條引物或1條以上的引物的組合；多于一條引物時，每種引物加入量相同，減少相應水的用量，保持總體積不變；霍山石斛及其相似種的ISSR-PCR分子標記指紋圖譜的構建把ISSR-PCR擴增反應得到不同新鮮石斛樣品的擴增產物通過凝膠電泳，根據(jù)呈現(xiàn)的條帶建立圖譜以石斛品系編號為橫坐標，以條帶存在的位點編號為縱坐標，在每一縱橫坐標交結處，有擴增帶用“—”表示，沒有擴增帶不作標記，“有”帶或“無”帶以總亮度值作為選擇依據(jù)，采用Bandscan軟件，選取亮度值在≥0.4的有擴增帶用“—”，<0.4的為沒有擴增帶，制得8個品系的石斛DNA指紋圖譜如下；利用構建的8個品系的石斛DNA指紋圖譜鑒定霍山石斛把未知樣品在上述條件下所建立的指紋圖譜與已得的霍山石斛指紋圖譜相比較，與霍山石斛圖譜相同即為霍山石斛，否則不是霍山石斛。全文摘要本發(fā)明涉及霍山石斛及其相似種的分子標記指紋圖譜的構建和鑒別方法，解決了現(xiàn)有技術鑒定藥用植物的方法成本高、程序復雜和耗時長的問題。本發(fā)明包括以下步驟1.石斛樣品收集；2.各樣品基因組DNA的提取與純化；3.ISSR-PCR擴增；4.瓊脂糖凝膠電泳；4.構建各供試樣品的ISSR分子標記指紋圖譜；5.利用構建的ISSR分子標記指紋圖譜進行石斛種質的鑒定。本發(fā)明方法的優(yōu)點在于節(jié)約了時間和成本，通過對石斛屬植物的DNA的提取，ISSR-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳就能得到準確可靠的鑒別圖譜，該方法對外形上容易混淆的原料的鑒定具有簡便快捷、重復性好、分辨率高等優(yōu)點，而且在幼苗期即可進行鑒定，對于保證藥材基源的準確性和穩(wěn)定性具有重要的作用。文檔編號C12Q1/68GK101451163SQ200810246109公開日2009年6月10日申請日期2008年12月22日優(yōu)先權日2008年12月22日發(fā)明者劉明珍,李耀亭,輝鄧,陳乃富申請人:陳乃富