一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)霍山石斛細(xì)胞來生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法。包括以下步驟：(1)單細(xì)胞制備(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)(4)提取霍山石斛生物堿：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000?80000個/ml收集霍山石斛細(xì)胞，降低培養(yǎng)溫度至7?10℃，繼續(xù)培養(yǎng)5?7天，提取霍山石斛生物堿。本發(fā)明能夠大幅度縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高霍山石斛生物堿產(chǎn)品收率，且工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】
一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及霍山石斛技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]霍山石斛生物堿類是霍山石斛的主要成分之一，生物堿的藥理作用主要表現(xiàn)在抗腫瘤、對心血管、胃腸道抑制作用及止痛退熱等作用。隨著社會發(fā)展，人們對健康的關(guān)注越來越高，其需求量也會越來越大，但傳統(tǒng)霍山石斛生物堿類的提取方法是用霍山石斛的根、莖、葉等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足未來市場對霍山石斛精深加工的需求。
[0003]隨著植物細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，用細(xì)胞進(jìn)行人工培養(yǎng)擴(kuò)增提取植物的代謝產(chǎn)物，可以不受土地面積、氣候環(huán)境、地域、病蟲害等限制影響，適于工業(yè)化生產(chǎn)。利用細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)石斛生物堿類的技術(shù)，在國內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在生產(chǎn)過程中存在很多難題問題，如工藝復(fù)雜、生物量增速低、目標(biāo)產(chǎn)物收率低、生產(chǎn)周期長等。關(guān)于利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)霍山石斛細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的研究還沒有報道，因此開發(fā)一種高效生產(chǎn)霍山石斛中生物堿類天然產(chǎn)物的方法是十分有意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)手段去解決上述技術(shù)問題的:一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，包括以下步驟:
[0006](I)單細(xì)胞制備:取霍山石斛蒴果消毒后用固體培養(yǎng)基進(jìn)行無菌播種，待萌發(fā)成原球莖后取出，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，并離心過濾除雜，收集單細(xì)胞；
[0007](2)單細(xì)胞系培養(yǎng):將收集到的單細(xì)胞接種到第一 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0008](3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于第二 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng);所述第二 MS液體培養(yǎng)基中的P元素含量為MS液體培養(yǎng)基的2-3倍，所述第二 MS液體培養(yǎng)基中還添加有l(wèi)-2mg//L的鍺元素、0.02-0.lmg/L砸元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值為5.8 土0.4。
[0009]使用本發(fā)明的第二MS液體培養(yǎng)基，相對于MS液體培養(yǎng)基能延長分批培養(yǎng)細(xì)胞生長時間2倍以上，提高細(xì)胞密度2倍以上。鍺元素、砸元素、酸水解酪蛋白能夠顯著增加霍山石斛懸浮細(xì)胞的鮮重、提高蛋白質(zhì)和葉綠素的含量，使細(xì)胞抗氧化活性明顯升高。
[0010](4)提取霍山石斛生物堿:當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-80000個/ml，降低培養(yǎng)溫度至7-1O0C，繼續(xù)培養(yǎng)5-7天，采用離心收集霍山石斛細(xì)胞;再提取霍山石斛生物堿。
[0011 ]由于生物堿是次級代謝產(chǎn)物，與細(xì)胞生長不偶聯(lián)，降低培養(yǎng)溫度至該溫度范圍內(nèi)，使細(xì)胞不增長，能促使生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生。
[0012]優(yōu)選地，所述步驟(I)播種采用的培養(yǎng)基為適合蘭科植物生長的固體培養(yǎng)基。
[0013]優(yōu)選地，所述固體培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。1/2MS培養(yǎng)基中大量元素減半，適合蘭科植物種子萌發(fā)。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟(2)中單細(xì)胞接種量為25 土 2g/L，光強(qiáng)度為2000-4000lux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，溫度22 ± 2 °C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000-20000個/mL，即可放大培養(yǎng)。該光強(qiáng)度范圍有助于細(xì)胞的形態(tài)建成和活力提升，過高則浪費(fèi)，過低則達(dá)不到效果。該色溫為暖光，藍(lán)紫光較為均衡，有利于代謝產(chǎn)物的合成。該溫度范圍為霍山石斛生長和代謝最為均衡的溫度。該密度下，細(xì)胞的群體生長處于指對數(shù)時期，即活力最旺盛的時期。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟(3)中單細(xì)胞系接種量為30 土 2g/L，光強(qiáng)度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30 %。
[0016]優(yōu)選地，所述第二MS液體培養(yǎng)基中還添加有0.1-2mg/L ΝΑΑ、0.l_2mg/L 6_BA、50_lOOmg/L果膠酶、10-50mg/L纖維素酶，pH值為5.8 ± 0.4。添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細(xì)胞分裂生長，并防止細(xì)胞聚集結(jié)塊，保證營養(yǎng)和溶氧和二氧化碳供應(yīng)均勾、充分。
[0017]優(yōu)選地，所述鍺元素來源于GeO2或有機(jī)鍺。
[0018]優(yōu)選地，所述砸元素來源于Na2SeO3或有機(jī)砸。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明首先對霍山石斛種子無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中的單細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)成單細(xì)胞系，最后進(jìn)行細(xì)胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細(xì)胞分裂生長，并防止細(xì)胞聚集結(jié)塊，保證營養(yǎng)和溶氧和二氧化碳供應(yīng)均勻、充分。本發(fā)明能夠大幅度縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高產(chǎn)品收率，且工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明生物堿含量的檢測方法
[0021]1、對實(shí)施例提取的生物堿進(jìn)行分析，具體分析方法如下。標(biāo)準(zhǔn)品配制:精密稱取石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品1.0Omg置10mL量瓶中加氯仿至刻度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密量取1.0，2.0，3.0，4.0,5.0mL分別置分液漏斗中，用氯仿準(zhǔn)確稀釋至10.0mL，加入pH 4.5緩沖液5.0mL和0.04%溴甲酚綠溶液1.0mL，劇烈振搖3min，靜置30min，氯仿層經(jīng)氯仿浸泡處理并干燥后的藥棉濾過，取續(xù)濾液5.0mLjJP0.0 lmolL—1氫氧化鈉無水乙醇液1.0mL搖勻，以氯仿10.0mL為空白，同法操作，于波長620nm處測得吸收度。由吸光度X對濃度Y(ug/ml)進(jìn)行回歸計算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Υ = 0.6321X-0.0132，r = 0.99914。
[0022]2、樣品的測定:稱取本實(shí)驗(yàn)制得的霍山石斛生物堿樣品50mg，稀釋至溶液吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)(10-100倍)稀釋后，按上述方法進(jìn)行測定。每個樣品測試10次，取線性范圍內(nèi)的值求均值。
[0023]實(shí)施例1
[0024]本實(shí)施例公開一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，包括以下步驟:
[0025]1、培養(yǎng)階段
[0026](I)單細(xì)胞制備
[0027]取霍山石斛蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
[0028](2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
[0029]將收集到的單細(xì)胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細(xì)胞接種量為23g/L，光強(qiáng)度為20001ux，色溫為4000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.4，溫度20°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0030](3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):
[0031]將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+0.lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.lmg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+50mg/L中性果膠酶+10mg/L中性纖維素酶+lmg/L的鍺元素(來源于Ge02)+0.02mg/L砸元素(來源于Na2Se03)+0.1g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細(xì)胞接種量為28g/L，光強(qiáng)度為20001ux，色溫為4000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.4;補(bǔ)料液為2倍濃度的第二 MS液體培養(yǎng)基;
[0032](4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000個/ml，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞鮮重0.53g/mL、每克鮮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量11.9mg/g、每克鮮細(xì)胞中葉綠素含量0.18mg/g，每克鮮細(xì)胞中SOD活性312U/g，降低培養(yǎng)溫度至70C，繼續(xù)培養(yǎng)5天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細(xì)胞，將收集到的霍山石斛細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0033]2、提取階段:
[0034](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0035](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
[0036](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0037](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.171 g，收率為0.34%。
[0038]本發(fā)明消毒具體采用的方式是75%酒精消毒Imin，0.1 ^HgCl2消毒15min，無菌水洗滌3次。以下實(shí)施例均采用該方法進(jìn)行消毒。
[0039]本發(fā)明的酶解法分離采用的是現(xiàn)有技術(shù)，具體是在20uM蔗糖，1uM MgCl2,20uMpH 7.8Tris—HCL緩沖液中，使用果膠酶、纖維素酶對細(xì)胞團(tuán)室溫處理4-8h。并在500rpm、1min條件下離心、清洗后收集單細(xì)胞。以下實(shí)施例均采用該方法進(jìn)進(jìn)行分離。
[0040]實(shí)施例2
[0041]1、培養(yǎng)階段
[0042](I)單細(xì)胞制備
[0043]取霍山石斛蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
[0044](2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
[0045]將收集到的單細(xì)胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細(xì)胞接種量為25g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.8，溫度22 °C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到15000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0046](3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):
[0047]將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的3倍)+ lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ lmg/L 6_BA(6_Benzylaminopurine，6_節(jié)氛基嘌吟)+70mg/L中性果膠酶+30mg/L中性纖維素酶+70mg/L中性果膠酶+30mg/L中性纖維素酶+1.5mg/L的鍺元素(來源于Ge02)+0.05mg/L砸元素(來源于Na2Se03)+0.13g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細(xì)胞接種量為30g/L，光強(qiáng)度為30001uX，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30 %，溶0)2在3 %，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補(bǔ)料液為2倍濃度的第二 MS液體培養(yǎng)基；
[0048](4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70000個/ml，測定每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞鮮重0.54g/mL、每克鮮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量12.lmg/g、每克鮮細(xì)胞中葉綠素含量0.19mg/g,每克鮮細(xì)胞中SOD活性327U/g，降低培養(yǎng)溫度至80C，繼續(xù)培養(yǎng)6天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細(xì)胞，經(jīng)將收集到的霍山石斛細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0049]2、提取階段:
[0050](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0051 ] (2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
[0052](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0053](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.257g，收率為0.51%。
[0054]實(shí)施例3
[0055]1、培養(yǎng)階段
[0056](I)單細(xì)胞制備
[0057]取霍山石斛蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
[0058](2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
[0059]將收集到的單細(xì)胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細(xì)胞接種量為27g/L，光強(qiáng)度為40001ux，色溫為6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為6.2，溫度24°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到20000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0060](3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):
[0061]將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+ 2mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 2mg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤) + 100mg/L中性果膠酶+50mg/L中性纖維素酶+2mg/L的鍺元素(來源于有機(jī)鍺)+0.lmg/L砸元素(來源于125603)+0.2g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細(xì)胞接種量為32g/L，光強(qiáng)度為40001ux，色溫為6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在6.2;補(bǔ)料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基；
[0062](4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80000個/ml，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞鮮重0.58g/mL、每克鮮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量12.2mg/g、每克鮮細(xì)胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細(xì)胞中SOD活性317U/g，降低培養(yǎng)溫度至10°C，繼續(xù)培養(yǎng)7天，采用100rpm低速離心，lOmin，收集霍山石斛細(xì)胞，將收集到的霍山石斛細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆?。?xì)胞達(dá)到該密度后，就不能繼續(xù)增加了密度了，達(dá)到30L氣升式發(fā)酵罐的攪動極限。
[0063]2、提取階段:
[0064](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0065](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
[0066](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0067](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.232g，收率為0.46%。
[0068]實(shí)施例4
[0069]丨、培養(yǎng)階段
[0070](I)單細(xì)胞制備
[0071]取霍山石斛蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
[0072](2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
[0073]將收集到的單細(xì)胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細(xì)胞接種量為24g/L，光強(qiáng)度為25001ux，色溫為4500K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6，溫度21°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到12000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0074](3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):
[0075]將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+0.5mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.7mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+70mg/L中性果膠酶+20mg/L中性纖維素酶+1.8mg/L的鍺元素(來源于有機(jī)鍺)+0.06mg/L砸元素(來源于有機(jī)砸)+0.16g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細(xì)胞接種量為29g/L，光強(qiáng)度為25001UX，色溫為4500K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30 %，溶⑶2在3 %，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.9;補(bǔ)料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基；
[0076](4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80000個/ml，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞鮮重0.57g/mL、每克鮮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量12.4mg/g、每克鮮細(xì)胞中葉綠素含量0.2 lmg/g，每克鮮細(xì)胞中SOD活性313U/g。降低培養(yǎng)溫度至90C，繼續(xù)培養(yǎng)6天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細(xì)胞，將收集到的霍山石斛細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0077]2、提取階段:
[0078](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0079](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
[0080](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0081 ] (4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.18 2 g，收率為0.36%。
[0082]實(shí)施例5
[0083]丨、培養(yǎng)階段
[0084](I)單細(xì)胞制備
[0085]取霍山石斛蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
[0086](2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
[0087]將收集到的單細(xì)胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細(xì)胞接種量為25g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為4400K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.7，溫度22°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到18000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0088](3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):
[0089]將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+ lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 1.2mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+60mg/L中性果膠酶+25mg/L中性纖維素酶+1.8mg/L的鍺元素(來源于Ge02)+0.08mg/L砸元素(來源于有機(jī)砸)+0.17g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細(xì)胞接種量為30g/L，光強(qiáng)度為20001ux，色溫為5200K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補(bǔ)料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基；
[0090](4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000個/ml，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞鮮重0.54g/mL、每克鮮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量12.lmg/g、每克鮮細(xì)胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細(xì)胞中SOD活性324U/g ο降低培養(yǎng)溫度至7 0C，繼續(xù)培養(yǎng)5天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細(xì)胞，將收集到的霍山石斛細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0091]2、提取階段:
[0092](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0093](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
[0094](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0095](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.239g，收率為0.48%。
[0096]實(shí)施例6
[0097]1、培養(yǎng)階段
[0098](I)單細(xì)胞制備
[0099]取霍山石斛蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
[0100](2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
[0101 ]將收集到的單細(xì)胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細(xì)胞接種量為26g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為6.1，溫度20°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到12000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0102](3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):
[0103]將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的3倍)+0.3mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 1.4mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+6 Omg/L中性果膠酶+30mg/L中性纖維素酶+2mg/L的鍺元素(來源于GeO2) +0.05mg/L砸元素(來源于有機(jī)砸)+0.18g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細(xì)胞接種量為30g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補(bǔ)料液為2倍濃度的第二MS液體培養(yǎng)基;
[0104](4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70000個/ml，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞鮮重0.56g/mL、每克鮮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量11.9mg/g、每克鮮細(xì)胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細(xì)胞中SOD活性332U/g，降低培養(yǎng)溫度至80C，繼續(xù)培養(yǎng)6天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細(xì)胞，將收集到的霍山石斛細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0105]2、提取階段:
[0106](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0107](2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
[0108](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0109](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.171 g，收率為0.34%。
[0110]實(shí)施例7
[0111]1、培養(yǎng)階段
[0112](I)單細(xì)胞制備
[0113]取霍山石斛蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為固體I/2MS培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
[0114](2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
[0115]將收集到的單細(xì)胞接種到含有第一MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，單細(xì)胞接種量為26g/L，光強(qiáng)度為40001ux，色溫為6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為6.2，溫度23°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到13000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
[0116](3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):
[0117]將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養(yǎng)基中的P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基的2倍)+ 1.3mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.8mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節(jié)氨基嘌呤)+70mg/L中性果膠酶+35mg/L中性纖維素酶+1.6mg/L的鍺元素(來源于GeO2) +0.lmg/L砸元素(來源于有機(jī)砸)+0.17g/L的酸水解酪蛋白的液體培養(yǎng)基的30L氣升式攪拌發(fā)酵罐中，鮮細(xì)胞接種量為30g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.6;補(bǔ)料液為2倍濃度的第二 MS液體培養(yǎng)基；
[0118](4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70000個/ml，經(jīng)測定每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞鮮重0.56g/mL、每克鮮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量12.2mg/g、每克鮮細(xì)胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細(xì)胞中SOD活性331U/g，降低培養(yǎng)溫度至9 0C，繼續(xù)培養(yǎng)6天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細(xì)胞，將收集到的霍山石斛細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0119]2、提取階段:
[0120](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0121](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
[0122](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0123](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.223g，收率為
0.44%。
[0124]對比例I
[0125]選取播種生長8個月的霍山石斛組培苗，將組培苗洗凈瀝干后殺青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆谩?br>[0126]I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0127](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次
0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
[0128](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0129](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.19 6 g，收率為
0.39%。
[0130]通過上述的培養(yǎng)和提取，可以很清楚的判定本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)法在細(xì)胞培養(yǎng)后生產(chǎn)的霍山石斛生物堿在收率上可以接近甚至超過同期播種生長8個月的組培苗生產(chǎn)的霍山石斛生物堿。
[0131]本發(fā)明的方法不限制霍山石斛生物堿的生產(chǎn)，還適用于其他食用或藥用石斛屬植物生物堿的生產(chǎn)。本發(fā)明的第一 MS液體培養(yǎng)基為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基或者P元素為常規(guī)MS液體培養(yǎng)基P元素2-3倍的培養(yǎng)基。
[0132]以上所述僅為本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明創(chuàng)造，凡在本發(fā)明創(chuàng)造的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)單細(xì)胞制備:取霍山石斛蒴果消毒后用固體培養(yǎng)基進(jìn)行無菌播種，待萌發(fā)成原球莖后取出，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，并離心過濾除雜，收集單細(xì)胞； (2)單細(xì)胞系培養(yǎng):將收集到的單細(xì)胞接種到第一MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)； (3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于第二MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng);所述第二MS液體培養(yǎng)基中的磷兀素含量為MS液體培養(yǎng)基的2-3倍，所述第二 MS液體培養(yǎng)基中還添加有l(wèi)-2mg/L的鍺元素、0.02-0.lmg/L砸元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值為5.8 土0.4； (4)提取霍山石斛生物堿:當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-80000個/ml，降低培養(yǎng)溫度至7-100C，繼續(xù)培養(yǎng)5-7天，采用離心收集霍山石斛細(xì)胞;再提取霍山石斛生物堿。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述步驟(I)播種采用的培養(yǎng)基為適合蘭科植物生長的固體培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述步驟(2)中單細(xì)胞接種量為25 土 2g/L，光強(qiáng)度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，溫度22 ± 2 °C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000-20000個/mL，即可放大培養(yǎng)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述步驟(3)中單細(xì)胞系接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，溫度22±2°C，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述第二液體MS培養(yǎng)基中還添加有0.1-2mg/L NAA,0.1 -2mg/L6_BA、50-100mg/L果膠酶、10-50mg/L 纖維素酶，pH 值為 5.8 ±0.4。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述鍺元素來源于GeO2或有機(jī)鍺。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述砸元素來源于Na2SeO3或有機(jī)砸。
【文檔編號】C12N5/04GK105906641SQ201610353012
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】鄧輝, 陳乃富, 陳存武, 韓邦興, 何曉梅
【申請人】皖西學(xué)院