專利名稱：一種定點(diǎn)整合外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種定點(diǎn)整合外源基因的方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶是人乳中重要的抗菌因子，對(duì)大部分革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌均 具有殺滅作用，對(duì)于增強(qiáng)嬰幼兒免疫力有著重要的作用，同時(shí)溶菌酶在醫(yī)療保健，輕工業(yè)、 食品業(yè)等方面也被廣泛應(yīng)用。2009年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了世界上首例乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的抗 凝血酶轉(zhuǎn)基因藥物上市，這標(biāo)志著利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)重組蛋白真正邁入產(chǎn)業(yè)化階段。利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景，但是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因 技術(shù)在乳腺生物反應(yīng)器研究中仍存在一定的不足。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因研究中，由于外源基因 在基因組中是一種隨機(jī)插入，受到位置效應(yīng)的影響以及載體自身大小限制，不能包含完整 的調(diào)控元件往往使外源基因的表達(dá)量水平較低，甚至不表達(dá)或者異位表達(dá)(Clark，1994 ； Dobie 1996 ；Kim, 2007)。同時(shí)，由于外源基因的多拷貝隨機(jī)插入到宿主基因組中，這種整合 對(duì)宿主自身來說可能也存在一定風(fēng)險(xiǎn)(Seggewis，2006 ;McCormack，2004)。這些不利因素 大大降低了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種的可靠性，提高了成本，不利于轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展。食品規(guī)范委 員會(huì)和美國(guó)FDA頒布的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物規(guī)范條例中也明確提出需充分重視這個(gè)問題。因此需要 我們尋找使外源基因表達(dá)量更高，同時(shí)具有較高育種安全性和可靠性的新方法去改變傳統(tǒng) 的轉(zhuǎn)基因育種。為了提高外源基因的表達(dá)量，克服轉(zhuǎn)入基因受到位置效應(yīng)的影響，人們嘗試 了多種方法，如在載體中加入了核基質(zhì)附著元件(MAR)、位點(diǎn)控制元件(LCR)、絕緣子 (Insulator)等元件來克服外源基因表達(dá)受到位置效應(yīng)的影響，但是由于基因表達(dá)調(diào)控的 復(fù)雜性，仍不能取得很好的效果，而且外源基因在基因組上仍是隨機(jī)插入，降低了轉(zhuǎn)基因的 可控性和安全性，這仍是在傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因研究急待解決的問題?；虼虬屑夹g(shù)的出現(xiàn)克服了 傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的弊端，大大提高了轉(zhuǎn)基因的可控性。基因打靶是基因靶向操作的一門轉(zhuǎn)基因 技術(shù)，利用外源基因與基因組序列間的同源性進(jìn)行同源重組(homologous recombination) 來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)對(duì)染色體進(jìn)行修飾的一門技術(shù)，具有位點(diǎn)專一性強(qiáng)，可以穩(wěn)定遺傳以及外源 基因不受位置效應(yīng)影響，對(duì)鄰近基因也沒有影響等優(yōu)點(diǎn)，將成為今后一種較理想的改造 物種基因的操作方法。2000年K. J. McCreath利用基因打靶的方法將人抗胰蛋白酶基因 (AAT)定點(diǎn)整合到羊原膠原基因座上(C0L1A1)，羊乳中人抗胰蛋白酶表達(dá)量為650yg/ ml (McCreath，2000)，遠(yuǎn)高于之前McClenaghan隨機(jī)整合表達(dá)人抗胰蛋白酶的轉(zhuǎn)基因羊乳 中l(wèi)Syg/ml的表達(dá)量(McClenaghan，1991)，克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因受位置效應(yīng)影響使蛋白低 水平表達(dá)的弊端。利用基因打靶進(jìn)行轉(zhuǎn)基因獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)使轉(zhuǎn)基因研究具有了可控性，在轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物育種方面明顯的提高了轉(zhuǎn)基因的成功率，提高了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自身的安全性，降低 了轉(zhuǎn)基因育種的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)便于規(guī)模化的育種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效定點(diǎn)整合外源基因的方法，其可以大幅提高外源基 因的表達(dá)量，提高育種成功率和安全可靠性。本發(fā)明提供的定點(diǎn)整合外源基因的方法，其是采用基因打靶的方法將人溶菌酶基 因或其它目的基因定點(diǎn)整合到牛、羊或兔等哺乳動(dòng)物的乳腺特異表達(dá)蛋白的靶標(biāo)基因座 上，使溶菌酶基因或其它目的基因捕獲完整的乳腺特異表達(dá)蛋白調(diào)控序列以及基因座上的 調(diào)控序列，來實(shí)現(xiàn)人溶菌酶或其它目的蛋白在動(dòng)物乳腺中的高效表達(dá)。這是首次嘗試?yán)?基因打靶的方法使外源基因捕獲動(dòng)物乳腺特異表達(dá)蛋白調(diào)控元件指導(dǎo)人溶菌酶的在乳腺 中表達(dá)，同時(shí)我們用人溶菌酶的基因組序列代替cDNA序列，可使溶菌酶獲得更高的表達(dá) 量。利用這種新的方法可以克服以往轉(zhuǎn)基因外源基因隨機(jī)整合存在的種種不足，提高轉(zhuǎn)基 因育種的成功率。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例，采用基因打靶的方法將人溶菌酶基因定點(diǎn)整合到 牛asl-酪蛋白基因座上，得到了一種根據(jù)上述方法構(gòu)建的打靶載體，其具有如圖15中所示 的LYZ-K-in載體結(jié)構(gòu)。其可以在牛乳腺中高效表達(dá)生產(chǎn)人溶菌酶或其它重組蛋白。上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)人溶菌酶或其它目的基因在乳腺中轉(zhuǎn)錄非?；钴S的酪蛋白基因座定點(diǎn)整合， 克服位置效應(yīng)，避免目的基因表達(dá)沉默，可以實(shí)現(xiàn)人溶菌酶或其它重組蛋白在乳腺中較高 水平表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因育種的成功率，同時(shí)可以節(jié)約后期生產(chǎn)純化重組蛋白成本；(2)目的基因在染色體定點(diǎn)整合，避免了隨機(jī)插入以及多拷貝插入對(duì)鄰近重要基 因表達(dá)的影響(如插入突變、多拷貝的插入引起染色體不穩(wěn)定、鄰近基因功能失活、激活原 癌基因、失活抑癌基因等)，提高了轉(zhuǎn)基因的安全性、可控性，消除部分人群對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安 全性顧慮；(3)利用基因完整的內(nèi)源性啟動(dòng)子指導(dǎo)外源基因表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)人溶菌酶基因或 其它目的基因較高水平的表達(dá)，同時(shí)減少了由于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因研究中調(diào)控元件不完整造成的 異位表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因成功率；(4)本方案中利用人溶菌酶基因組序列代替cDNA序列，能提高人溶菌酶的表達(dá)量。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中同源左臂PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其中M :lkb marker ;1_3:同 源左臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中同源右臂PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其中1-5 同源右臂PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物；M :lkb marker ；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中人溶菌酶基因PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其中1-4 人溶菌酶基因 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)；M Ikb marker ；圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中LYZ-k-in打靶載體酶切驗(yàn)證結(jié)果， 其 中 1 :SalI (5597bp + 16278bp) ；2 Xho I (6243bp + 1 5632bρ) ；3 =NotI/ Sail (5597bp + 5526bp + 10752bp) ；4 :NotI/XhoI (2593bp + 6243bp + 13039bp) ；5 HindIII(4474bp+17401bp) ；6 =NotI(linear,21875bp) ；7 :P1 asmid as control ;M :Ikb marker ；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中asl_酪蛋白和人溶菌酶基因融合示意圖；其中F1，R1和 F2，R2示RT-PCR檢測(cè)引物位置；圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中RT-PCR FlRl引物檢測(cè)結(jié)果，其中M=Ikb marker ； 1-4 陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果；5-6 未轉(zhuǎn)染C127對(duì)照；7-8 :RNA模板；9 :H20作為模板；10 :cDNA檢測(cè)；圖7是本發(fā)明實(shí)施例1中RT-PCR F2R2引物檢測(cè)結(jié)果，其中M=Ikb marker ； 1-4 F2R2引物檢測(cè)結(jié)果；圖8是本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)RT-PCR引物F2R2PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果，DNAMAN1序 列為PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，DNAMAN2序列為NCBI公布序列asl-酪蛋白非翻譯mRNA和人溶 菌酶基因融合mRNA ；方框標(biāo)注序列分別為限制性內(nèi)切酶BioI位點(diǎn)、溶菌酶mRNA翻譯起始 (ATG)和翻譯終止序列(TAA)；圖9是本發(fā)明實(shí)施例1中Western-blot檢測(cè)溶菌酶在乳腺細(xì)胞中表達(dá)，其中1 未轉(zhuǎn)染打靶載體C127細(xì)胞誘導(dǎo)；2 轉(zhuǎn)染打靶載體細(xì)胞未誘導(dǎo)；3 轉(zhuǎn)染打靶載體細(xì)胞誘導(dǎo)；圖10是本發(fā)明實(shí)施例1中妊娠期第42天的胎兒；圖11是本發(fā)明實(shí)施例1中同源重組示意圖，其中A 酪蛋白基因座；B :asl-casein 基因結(jié)構(gòu)圖；C:基因打靶載體；D 同源重組后人溶菌酶整合位點(diǎn)；3' HRF和3' HRR引物 如上圖所示；圖12是本發(fā)明實(shí)施例1中靶細(xì)胞PCR鑒定，其中1_2 發(fā)生同源重組的細(xì)胞；3 094基因組作為陰性對(duì)照；4 基因打靶載體作為對(duì)照；5 =H2O ；M =Ikb marker ；圖13是本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)中靶細(xì)胞PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，其中下劃線部分為同源 右臂下游引物，方框部分為同源右臂側(cè)翼序列(asl-酪蛋白基因中同源右臂下游序列)；圖14是本發(fā)明實(shí)施例1載體構(gòu)建流程圖；圖15是本發(fā)明實(shí)施例2定點(diǎn)整合人乳鐵蛋白基因的基因載體圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例所使用的載體、菌種、試劑及其來源Plox載體購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，小鼠C127細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所；催乳素、 胰島素、氫化可的松均為Sigma產(chǎn)品；Pyrobest高保真酶、LA-Taq長(zhǎng)片段擴(kuò)增酶、T4DNA連 接酶、內(nèi)切酶、PMD19-T載體均為Takara公司產(chǎn)品；匪LV反轉(zhuǎn)錄酶為Promega產(chǎn)品；T0P0-T、 Lipo-2000載體購(gòu)自hvitrogen公司；質(zhì)粒純化試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn) 品和兔抗人溶菌酶一抗均為CALBI0CHEM產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)于中杉金橋公司。 酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、基因組提取、PCR擴(kuò)增等常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克 隆(第三版)》。實(shí)施例1 :asl-酪蛋白基因座定點(diǎn)整合其它目的基因打靶載體構(gòu)建(以人溶菌酶 基因?yàn)槔?1.基因打靶載體的構(gòu)建1. 1同源臂的擴(kuò)增、測(cè)序根據(jù)GeneBank公布的牛asl-酪蛋白序列(Genebank號(hào)X59856)設(shè)計(jì)了上游引物(見 SEQ ID NO. 1) 5 ‘ -ATTTGCGGCCGCTAATGTTCCTGTCATACAACTGTGAAT-3 ‘，引入 NotI 酶 切位點(diǎn)；下游引物(見SEQ ID NO. 2)5' -CCCTCGAGGTCAAGATCTATGTAAGAAAATAAAATAG-3‘， 引入XhoI酶切位點(diǎn)，用來擴(kuò)增同源左臂(L eft arm,9354-11939, 2586bp)0同時(shí)設(shè)計(jì)了上 游引物(見 SEQ ID NO. 3)5' -ACGCGTCGACAACCATGAAACTTCTCATCCTTAC-3‘，引入 SalI 酶 切位點(diǎn)；下游引物(見 SEQ ID NO. 4) 5 ‘ -ACGCGTCGACACATTCTTGGGTATGATAGCACTGC-3 ‘，引 入Mil酶切位點(diǎn)，用來擴(kuò)增同源右臂(Right arm, 11940-17530，5591bp)。利用上述合成的 兩對(duì)引物分別用Pyrobest和LA-Taq酶以094牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組DNA為模板分別擴(kuò) 增得到了同源左臂(圖1)和同源右臂(圖2)。對(duì)擴(kuò)增得到的同源左臂和右臂分別連接到 了 PMD19-T和TOPO-T載體進(jìn)行測(cè)序，序列同源性均為99%以上，構(gòu)建完成Left arm-T和 Right arm-T 載體。1. 2人溶菌酶基因序列擴(kuò)增、測(cè)序根據(jù)GeneBank公布的人溶菌酶序列(Genebank號(hào)X14008)設(shè)計(jì)上游引物(見 SEQ ID NO. 5) 5 ‘ -CCGCTCGAGAACATGAAGGCTCTCATTGTTC-3 ‘，引入 XhoI 酶切位點(diǎn)；下游弓丨 物(見 SEQ ID N0. 6) 5 ‘ -CCGCTCGAGTAGAAGTGTAATATGAGGCCAG-3 ‘，引入 XhoI 酶切位點(diǎn)，以 人基因組DNA為模板擴(kuò)增得到了人溶菌酶基因序列，包括溶菌酶自身加尾信號(hào)(544-6780， 6236bp)(圖；3)，并且連接到Τ0Ρ0-Τ載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的人溶菌 酶序列外顯子以及剪切位點(diǎn)均未發(fā)生突變，構(gòu)建完成了 LYZ-T載體。1. 3基因打靶載體的構(gòu)建以Plox載體為骨架載體(7460bp)，用Mil酶切Plox載體和Right arm-T回收 并連接，完成載體R-PLOX的構(gòu)建。將構(gòu)建完成的R-PLOX載體用NotIJhoI酶切回收，因?yàn)?Left arm和PMD19-T載體大小接近，所以用NotI、XhoI、PvuI酶切后回收Left arm片段，然 后連接到R-PLOX載體完成L-P-R載體的構(gòu)建。最后用B10I分別酶切LYZ-T和L-P-R載體將 回收得到的WZ序列鏈接到L-P-R載體B10I位點(diǎn)，完成打靶載體的構(gòu)建，命名為L(zhǎng)YZ-K-in。 對(duì)完成的打靶載體進(jìn)行酶切(圖4)和測(cè)序驗(yàn)證(構(gòu)建流程見圖14)。2.打靶載體乳腺細(xì)胞表達(dá)驗(yàn)證試驗(yàn)中，基因打靶載體左臂擴(kuò)增區(qū)域?yàn)閍sl_酪蛋白promoter區(qū)、外顯子I和部分 外顯子II區(qū)域，因此將打靶載體轉(zhuǎn)染小鼠C127乳腺細(xì)胞可以檢測(cè)同源左臂能否指導(dǎo)人溶 菌酶的正確表達(dá)，驗(yàn)證載體的正確性。2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染將LYZ-K-in打靶載體用NotI線性化后參照Lipo-2000轉(zhuǎn)染試劑說明轉(zhuǎn)染小鼠乳 腺癌細(xì)胞C127。轉(zhuǎn)染4 后細(xì)胞按1 6傳代同時(shí)加入800yg/ml G418進(jìn)行篩選，每三天 換一次液，7天左右有克隆點(diǎn)形成，繼續(xù)篩選三天，收集細(xì)胞用于后期檢測(cè)。將篩選得到的細(xì)胞用含有催乳素、胰島素、氫化可的松的DMEM誘導(dǎo)4 后，收集細(xì) 胞上清并用超濾離心管(％il，3KD)進(jìn)行超濾濃縮50倍，細(xì)胞用于RNA提取和蛋白收集。
( 催乳素 2pg/ml 誘導(dǎo)液濃度 胰島素 lOpg/ml
‘ 氫化可的松 15pg/ml
2. 2RT-PCR 檢測(cè)取誘導(dǎo)細(xì)胞收集的1 μ g總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作 為模板，以 LYZ 鑒定弓丨物Fl (見 SEQ ID NO. 7) 5 ‘ -TGCAAAGAGGGTTGTCCGTGAT-3 ‘，Rl (見 SEQ ID NO. 8) 5 ‘ -CAATACTTGTAAGCTCATCTGCCTC-3 ‘禾口 LYZ 融合鑒 定弓丨物F2(見 SEQ ID NO. 9)5 ‘ -CTTGCTGCTTCTTCCCAGTC-3 ‘，R2 (見 SEQ ID NO. 10)5 ‘ -TGATAAGAACTGAATGTGGC-3 ‘分別進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)到 了 1049bp 的 LYZ mRNA 和 1088bp ^asl酪蛋白和LYZ的融合mRNA片段(圖5、6、7)。對(duì)引物F2、R2擴(kuò)增得到的1088bp 序列回收、T-A克隆并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，asl-酪蛋白5'非翻譯區(qū)mRNA和溶菌酶 mRNA正確融合，并且編碼區(qū)沒有發(fā)生突變(圖8)。結(jié)果表明經(jīng)過mRNA剪切和拼接，asl-酪 蛋白非翻譯區(qū)mRNA和人溶菌酶mRNA正確融合。2. 3ffestern blot 檢測(cè)超濾濃縮后的上清中蛋白用碧云天BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定濃度后，分別以 未誘導(dǎo)陽(yáng)性細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解蛋白、誘導(dǎo)的陽(yáng)性細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解蛋白、C127誘導(dǎo)上 清作為陰性對(duì)照，上樣量為30 μ g。15% SDS-PAGE膠50V，Ih ；90V, 2h進(jìn)行電泳。電泳完畢 后利用Bio-Rad濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀350mA，轉(zhuǎn)膜30min。轉(zhuǎn)膜完成后用5%脫脂奶粉封閉過夜，然 后兔抗人一抗(1 3000稀釋)進(jìn)行孵育lh，TBST洗膜3X lOmin，然后HRP標(biāo)記的羊抗兔 二抗(1 10000稀釋)孵育lh，TBST洗膜3X10min，最后進(jìn)行BCL顯色。Western結(jié)果顯 示，經(jīng)過誘導(dǎo)后，陽(yáng)性細(xì)胞上清中有人溶菌酶的表達(dá)，而C127細(xì)胞上清中沒有檢測(cè)到。在未 經(jīng)誘導(dǎo)條件下，陽(yáng)性細(xì)胞上清和裂解蛋白均沒有檢測(cè)到溶菌酶表達(dá)(圖9)。上述結(jié)果表明 同源左臂可以指導(dǎo)人溶菌酶正確表達(dá)且人溶菌酶自身信號(hào)肽可以弓I導(dǎo)溶菌酶的分泌。2. 4重組人溶菌酶活性檢測(cè)配置溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為100、150、200、250、300、350、400U/mL。取90ul 溶壁微球菌懸浮液(OD46tl = 0. 9)置于96孔板中，迅速加入酶液10 μ L，利用TECAN酶標(biāo)儀 震蕩混勻5S后，測(cè)定460nm下的光吸收值。從測(cè)定讀數(shù)起計(jì)時(shí)，每隔Imin記錄一次，每組 數(shù)據(jù)重復(fù)三次以上。以0到1分鐘的OD46tl的差值平均值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)酶濃度為橫坐標(biāo) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們可以得到回歸方程:y = 0. 0002x-0. 004,R2 = 0. 9954. y表示OD46tl差值，χ代表酶活力(U/mL)。利用上述方法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抗菌能力檢測(cè)，結(jié)果 顯示，細(xì)胞上清中溶菌酶的抗菌活力為140U/mL，而陰性對(duì)照C127細(xì)胞中基本檢測(cè)不到抗 菌活性。3.牛成纖維細(xì)胞篩選3. 1牛胎兒成纖維細(xì)胞系建立牛胎兒成纖維細(xì)胞建立采用胰酶消化法。具體方法如下a.屠宰42day的母牛，取 出胎盤放入DMEM培養(yǎng)基中，1 回到實(shí)驗(yàn)室(圖10)。b.在含有5 XDPBS的細(xì)胞培養(yǎng)皿中 剔除胎兒頭、四肢、內(nèi)臟及軟骨組織，將剩余組織放入一個(gè)新的IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用眼科 剪盡量剪碎。c.加入Iml完全培養(yǎng)基，用剪頭的Iml槍頭將組織碎塊及培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml 的離心管中，加入7ml DPBS,用移液器吸打幾下，待組織塊沉下后，吸棄上清，重復(fù)洗滌一 次。d.向15ml離心管中加入IOml 0. 25%胰酶，然后37°C水浴中消化30min。e.小心吸取 上清細(xì)胞懸液到另一 15ml離心管中，室溫1200rpm，離心5min收集細(xì)胞。重復(fù)d、e步驟各 一次并收集細(xì)胞。f.將離心獲得的細(xì)胞按照IXlO6/瓶的濃度接種T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37. 55% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天換一次液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后凍存，并命名為094牛 胎兒成纖維細(xì)胞。3. 2細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用amaxa nucleofector進(jìn)行電轉(zhuǎn)。具體流程如下將消化并收集的兩 瓶T25細(xì)胞(約8X IO6)、線性化的打靶載體12 μ g和400 μ 1 Nucleofector試劑混勻分裝 4個(gè)電擊杯進(jìn)行電擊，然后分別在四瓶T-25培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。4 后將培養(yǎng)的細(xì)胞消化并鋪 到60個(gè)IOcm的皿中含有500 μ g/ml G418和2 μ M GANC的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞篩選，篩選約10 天后挑取單克隆共15個(gè)到48孔板培養(yǎng)。待細(xì)胞90%匯合后擴(kuò)繁至M孔板培養(yǎng)，有9個(gè)克 隆點(diǎn)生長(zhǎng)狀態(tài)較好，然后將長(zhǎng)滿后的細(xì)胞一半凍存，一半用于基因組提取和PCR鑒定。3. 3同源重組鑒定將得到的9個(gè)克隆點(diǎn)的細(xì)胞提取基因組，取50ng的基因組DNA用于PCR檢測(cè)。PCR 檢測(cè)上游引物為 3' HRF (見 SEQ ID NO. 11) :5' -GGTGGGATTAGATAAATGCCTGC-3 ‘，設(shè)計(jì)在 序列 neo 中，下游引物為 3' HRR(見 SEQ ID N0. 12) 5' -GAGTTGAGTAAAAAGTATTGCGG-3 ‘， 設(shè)計(jì)到3'同源臂的外側(cè)，只有發(fā)生同源重組的細(xì)胞才能擴(kuò)增出目的條帶(圖11)。PCR檢 測(cè)結(jié)果顯示，在得到的9個(gè)克隆點(diǎn)中有1個(gè)克隆點(diǎn)細(xì)胞發(fā)生同源重組，擴(kuò)增檢測(cè)到了 6731bp 的目的片段(圖12)，對(duì)擴(kuò)增得到的目的片段回收測(cè)序，結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物5’端為新霉素基 因序列，3’端為同源右臂側(cè)翼序列(圖13)，與同源重組后預(yù)期序列相一致，這表明該克隆 點(diǎn)確實(shí)為中靶的陽(yáng)性細(xì)胞，人溶菌酶基因定點(diǎn)整合到了牛asl-酪蛋白基因座上。然后將中 靶細(xì)胞克隆用于核移植。結(jié)果表明打靶載體定點(diǎn)整合到了 asl-酪蛋白基因座中，且HSV-TK 負(fù)篩選基因經(jīng)過同源重組而沒有整合到基因組中。實(shí)施例2 :asl-酪蛋白基因座定點(diǎn)整合其它目的基因打靶載體構(gòu)建(以人乳鐵蛋 白基因?yàn)槔?按照上述載體構(gòu)建的方法，從人乳腺組織中提取總mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA. 參照NCBI公布人乳鐵蛋白基因序列(Genebank號(hào)NM_002343)分別設(shè)計(jì)上下游 弓I 物hLF 上游弓I 物，TGCAAGCTTACCATGAAACTTGTCT(見 SEQ ID N0. 13) ；hLF 下游 弓丨物，ACGTCTAGAAGCTGGGCCATCTTCTTCG(見 SEQ ID N0. 14)。以反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA 為模板，用高保真酶擴(kuò)增得到2155bp的hLF編碼區(qū)，利用HindIII和)(baI酶切 位點(diǎn)亞克隆到PCDNA3. 1載體，并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示與公布的序列同源性 100 %。利用上游引物 TGCCTCGAGACCATGAAACTTGTC (見 SEQ ID N0. 15)和下游引物 GTACTCGAGTAGAGCCCCAGCTGGT(見SEQ ID N0. 16)擴(kuò)增得到M49bp的含有人乳鐵蛋白編碼 框和牛生長(zhǎng)激素基因加尾信號(hào)(bGH pA)的DNA序列，然后將擴(kuò)增得到的序列B10I酶切正 向連接到實(shí)例IL-P-R載體B10I位點(diǎn)，完成牛asl-酪蛋白基因座定點(diǎn)整合人乳鐵蛋白基 因的打靶載體的構(gòu)建(圖15)。利用此方法，可以通過細(xì)胞篩選將目的基因定點(diǎn)整合到牛 asl-酪蛋白基因座，并通過核移植等方法得到乳腺特異高效表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因牛，同 樣地，通過本發(fā)明所公布的方法，可以將血液蛋白、治療性單克隆抗體等目的基因定點(diǎn)整合 到牛、羊、兔等動(dòng)物的asl-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白、β乳球蛋白等能在乳腺高效特 異表達(dá)的基因座上，并通過核移植等方法得到乳腺特異高效表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種定點(diǎn)整合外源基因的方法，其特征在于，采用基因打靶的方法將外源基因定點(diǎn) 整合到哺乳動(dòng)物的乳腺特異表達(dá)蛋白的靶標(biāo)基因座上。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物為牛、羊或兔。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述外源基因?yàn)槿巳芫富蚧蛉巳殍F 蛋白基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述外源基因采用基因組序列。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述乳腺特異表達(dá)蛋白為asl_酪蛋白、 β-酪蛋白、Y-酪蛋白或β乳球蛋白。
6.利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法得到的打靶載體。
7.含有權(quán)利要求6所述的打靶載體的宿主或細(xì)胞。
8.權(quán)利要求6所述的打靶載體用于在動(dòng)物乳腺中表達(dá)生產(chǎn)目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定點(diǎn)整合外源基因的方法。以人溶菌酶為例，其是采用基因打靶的方法將人溶菌酶基因定點(diǎn)整合到牛as1-酪蛋白基因座上，使溶菌酶基因捕獲完整的as1-酪蛋白調(diào)控序列以及酪蛋白基因座上的調(diào)控序列，來實(shí)現(xiàn)人溶菌酶在牛乳腺中的高效表達(dá)。利用這種新的方法可以將目的基因定點(diǎn)整合到有利于自身表達(dá)的基因座上，克服以往轉(zhuǎn)基因外源基因隨機(jī)整合存在的種種不足，提高轉(zhuǎn)基因育種的成功率。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102080101SQ20101056766
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者成功, 李寧, 湯波 申請(qǐng)人:北京濟(jì)福霖生物技術(shù)有限公司