專利名稱：：一種高產(chǎn)堿性蛋白酶濃縮提取工藝的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物酶制劑領(lǐng)域技術(shù)，涉及一種高產(chǎn)堿性蛋白酶濃縮提取工藝的建立。
背景技術(shù)：
：隨著人們生活水平的提高，含磷洗滌劑將被逐漸淘汰，這使得加酶洗滌劑的市場(chǎng)份額越來(lái)越大，發(fā)展前景越來(lái)越廣闊。目前我國(guó)洗滌劑總產(chǎn)量為270萬(wàn)噸，而加酶洗滌劑產(chǎn)量只占洗滌劑總量的30%，約80萬(wàn)噸。加酶洗滌劑的主要用酶為堿性蛋白酶，目前，國(guó)內(nèi)洗滌劑生產(chǎn)廠家所用的堿性蛋白酶主要采用丹麥Novoenzyme公司和美國(guó)Genencor公司的酶，其原因是由于我國(guó)堿性蛋白酶的生產(chǎn)水平較差。建立一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)堿性蛋白酶生產(chǎn)工藝顯得非常必要和重要。這將大大提高我國(guó)工業(yè)微生物酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)水平，推動(dòng)我國(guó)酶制劑工業(yè)的發(fā)展，促進(jìn)綠色洗滌劑的發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是建立一種用于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)堿性蛋白酶的提取工藝，為建充起我國(guó)自己的堿性蛋白酶生產(chǎn)體系奠定基礎(chǔ)。具體實(shí)施例方式首先對(duì)本發(fā)明中工藝所針對(duì)的高產(chǎn)堿性蛋白酶的來(lái)源進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明1菌種嗜堿芽孢桿菌(Sac/〃^a/cfl/opM^)ATCC215222種子培養(yǎng)基酵母浸粉0.5胰蛋白胨0.5葡萄糖1.0%磷酸氫二鉀1.8%發(fā)酵培養(yǎng)基酵母浸粉1.5%棉籽餅粉2.5%麥芽糊精9.0%檸檬酸鈉0.3%氯化鈣0.2磷酸氫二鉀1.8%3發(fā)酵條件32°C，發(fā)酵時(shí)間46小時(shí)，所產(chǎn)堿性蛋白酶酶活力為28000-32000U/ml。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步說(shuō)明；下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。l絮凝實(shí)施例一取剛下罐的發(fā)酵液100mL，調(diào)整發(fā)酵液PH值為8.0后，加入絮凝劑NaA102，加入量0.5%，室溫?cái)嚢?0min，離心測(cè)量菌體的沉淀量，以及酶活力。實(shí)施例二取剛下罐的發(fā)酵液100mL，調(diào)整發(fā)酵液PH值為8.0后，加入絮凝劑NaA102，加入量1.0%，室溫?cái)嚢?0min，離心測(cè)量菌體的沉淀量，以及酶活力。實(shí)施例三取剛下罐的發(fā)酵液100mL，調(diào)整發(fā)酵液PH值為7.0后，加入絮凝劑NaA102，加入量1.0%，室溫?cái)嚢?0min，離心測(cè)量菌體的沉淀量，以及酶活力。實(shí)施例四取剛下罐的發(fā)酵液100mL，調(diào)整發(fā)酵液PH值為7.0后，加入絮凝劑聚丙烯酰胺，加入量1.0%,室溫?cái)嚢?0min，離心測(cè)量菌體的沉淀量，以及酶活力。結(jié)果NaA102加入量為0.1%，發(fā)酵液PH為8.0時(shí)絮凝速度快，絮凝菌體多，菌體離心速度最快，酶活收率為96.4%，達(dá)到了所需的最佳絮凝效果。2活性炭脫色發(fā)酵液經(jīng)絮凝離心后加入中顆?；钚蕴窟M(jìn)行脫色處理，加入量為0.5%，脫色30min，觀察發(fā)酵液外觀，測(cè)定酶活力。實(shí)施例二發(fā)酵液經(jīng)絮凝離心后加入粉末狀活性炭進(jìn)行脫色處理，加入量為0.5%，脫色30min，觀察發(fā)酵液外觀，測(cè)定酶活力。實(shí)施例三發(fā)酵液經(jīng)絮凝離心后加入中顆?；钚蕴窟M(jìn)行脫色處理，加入量為1.0%，脫色30min，觀察發(fā)酵液外觀，測(cè)定酶活力。實(shí)施例四發(fā)酵液經(jīng)絮凝離心后加入中顆?；钚蕴窟M(jìn)行脫色處理，加入量為1.0%，脫色20min，觀察發(fā)酵液外觀，測(cè)定酶活力。結(jié)果采用1。/。中顆?；钚蕴窟M(jìn)行發(fā)酵液脫色處理30min后，發(fā)酵液顏色由深褐色變?yōu)榻瘘S色，脫色效果最為明顯，，酶活收率為90.3%，達(dá)到了所需的最佳脫色效果。3超濾濃縮工藝實(shí)施例一將經(jīng)過(guò)絮凝、離心、脫色、紙板精濾后的發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度2(TC，操作壓力0.05MP，超濾2小時(shí)后，測(cè)定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數(shù)。實(shí)施例二將經(jīng)過(guò)絮凝、離心、脫色、紙板精濾后的發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度1(TC，操作壓力O.IOMP，超濾2小時(shí)后，測(cè)定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數(shù)。實(shí)施例三將經(jīng)過(guò)絮凝、離心、脫色、紙板精濾后的發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，采用聚丙烯膜，超濾溫度20。C，操作壓力0.05MP，超濾2小時(shí)后，測(cè)定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數(shù)。實(shí)施例四將經(jīng)過(guò)絮凝、離心、脫色、紙板精濾后的發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，采用聚丙烯膜，超濾溫度1(TC，操作壓力0.05MP，超濾2小時(shí)后，測(cè)定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數(shù)。結(jié)果采用聚丙烯材料的超濾膜進(jìn)行堿性蛋白酶的超濾，超濾溫度l(TC，操作壓力為0.05MP時(shí)，單位時(shí)間酶的濃縮倍數(shù)最高，且酶活回收率最大為96.1%，達(dá)到了所需的最佳濃縮效果。結(jié)論本試驗(yàn)在絮凝過(guò)程中采用了新型的絮凝劑NaA102，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絮凝效果優(yōu)于其他絮凝劑，而且更有利于下游工藝的順利進(jìn)行。經(jīng)活性炭脫色后用聚丙烯膜超濾，有效提高蛋白酶液澄清度，提高液體酶商品性狀。每個(gè)濃縮工藝階段酶的回收率都維持在較高的水平，絮凝離心、脫色過(guò)濾和超濾濃縮工藝酶的回收率分別達(dá)到96.4%、90.3%和96.1%，最終整個(gè)工藝流程的總回收率為83.6%(見(jiàn)下表l)，明顯高于采用傳統(tǒng)工藝流程時(shí)堿性蛋白酶的回收率，而且濃縮酶液澄清透明、色澤金黃。表l提取流程中酶活力檢測(cè)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>發(fā)酵液經(jīng)過(guò)絮凝離心、脫色過(guò)濾和超濾濃縮處理后所得酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析，可以看出酶液經(jīng)過(guò)上述工藝處理后得到了濃縮，而且雜蛋白減少，堿性蛋白酶得到了純化。有益效果本發(fā)明針對(duì)目前國(guó)內(nèi)堿性蛋白酶的現(xiàn)狀，對(duì)高產(chǎn)堿性蛋白酶的提取工藝進(jìn)行研究，建立了液體蛋白酶濃縮提取工藝0.1%NaAlO2絮凝劑在pH8.0時(shí)絮凝速度快、效果好；1%中型顆?；钚蕴济撋Ч黠@；聚丙烯膜超濾溫度10°C、壓力0.05MPa時(shí)酶的回收率最高。優(yōu)化后的工藝使初始發(fā)酵液濃縮了8.3倍，酶回收率達(dá)到83.6%。濃縮酶液澄清透明，色澤金黃，雜蛋白減少。因此，確定適宜的提取工藝流程發(fā)酵液—絮凝—離心—活性炭脫色—紙板過(guò)濾—超濾濃縮，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有較大經(jīng)濟(jì)效益。權(quán)利要求1、一種高產(chǎn)堿性蛋白酶的提取工藝，采用了離心、絮凝、脫色、超濾，紙板精濾等提取工藝2、根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)堿性蛋白酶的提取工藝，其特征是:發(fā)酵液的絮凝采用NaA102，用量0.08-0.15%。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)堿性蛋白酶的提取工藝，其特征是:發(fā)酵液絮凝的最佳PH值為7.5-8.5。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)堿性蛋白酶的提取工藝，其特征是:酶液脫色采用中型顆?；钚蕴歼M(jìn)行，用量為0.8-1.2%。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)堿性蛋白酶的提取工藝，其特征是:超濾濃縮采用聚丙烯膜超濾，操作溫度8-15'C、壓力0.05Mpa。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)堿性蛋白酶的提取工藝，其特征是:提取工藝路線為發(fā)酵液—絮凝—離心—活性炭脫色—紙板過(guò)濾—超濾濃縮。全文摘要一種高產(chǎn)堿性蛋白酶濃縮酶的提取工藝，為了獲得高質(zhì)量濃縮液體蛋白酶，對(duì)提取工藝中不同絮凝劑，不同大小活性炭以及膜過(guò)濾條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的工藝使初始發(fā)酵液濃縮了8.3倍，酶回收率達(dá)到83.6％。濃縮酶液澄清透明，色澤金黃，雜蛋白減少。確定適宜的提取工藝流程發(fā)酵液→絮凝→離心→活性炭脫色→紙板過(guò)濾→超濾濃縮。文檔編號(hào)C12N9/52GK101392243SQ20081015288公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年11月7日優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日發(fā)明者靚劉,劉敏堯,張長(zhǎng)霞,殷向彬申請(qǐng)人:天津市諾奧科技發(fā)展有限公司