專利名稱：Prlr特異性抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二價以上的抗體。例如，可以制備三重特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760(1991)。
“螯合重組抗體”是可識別靶抗原上相鄰而非重疊表位的雙特異性抗體，這種抗體的柔軟程度足以使其同時結(jié)合兩個表位(Neri等，J Mol Biol.246367-73，1995)。
雙特異性Fab-scFv(“雙體”)和三重特異性Fab-(scFv)(2)(“三體”)的制備方法見于Schoonjans等，(J Immunol.1657050-57，2000)和Willems等，(JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.786161-76，2003)的描述。在雙體或三體中，scFv分子融合到VL-CL(L)和VH-CH1(Fd)鏈中的一個或兩個上，例如，在三體中，兩個scFv融合到Fab的C區(qū)，而在雙體中，一個scFv融合到Fab的C區(qū)。
抗體的重組制備方法 抗體可利用本領(lǐng)域熟知的一種抗體表達系統(tǒng)通過重組DNA方法制備(參見，例如，Harlow和Lane《抗體實驗室操作手冊》(AntibodiesA LaboratoryManual)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988))。
編碼本發(fā)明抗體的DNA可被放置到表達載體內(nèi)，然后將表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、人胚胎腎293細胞(例如，293E細胞)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生其他免疫球蛋白的骨髓瘤細胞內(nèi)，從而在重組的宿主細胞內(nèi)合成單克隆抗體?？贵w的重組制備方法是本領(lǐng)域所熟知的。通過蛋白水解消化完整抗體可得到抗體片段(參見，例如，Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science22981(1985))。但是，現(xiàn)在這些片段可以由重組宿主細胞直接產(chǎn)生。制備抗體片段的其他技術(shù)，其中包括肽合成技術(shù)和共價連接技術(shù)，是技術(shù)人員所熟知的。
表達控制序列是指可操控連接的編碼序列在特定宿主有機體內(nèi)表達所必須的DNA序列。適用于原核細胞的控制序列，例如，包括啟動子、任選操縱子序列以及核糖體結(jié)合位點。真核細胞已知利用啟動子、多聚腺苷酸信號和增強子。
當核酸與另一種核酸序列處于功能性相互關(guān)系中時則核酸是可操控連接的。例如，當原序列或分泌前導(dǎo)子的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白時，則該DNA與多肽的DNA可操控地連接；當啟動子或增強子可影響序列的轉(zhuǎn)錄時，則該啟動子或增強子與編碼序列可操控地連接；或者當核糖體結(jié)合位點所處的位置能促進翻譯時則該核糖體結(jié)合位點與編碼序列可操控地連接。一般而言，可操控連接意味著被連接的DNA序列是連續(xù)的，以及在分泌前導(dǎo)序列中是連續(xù)的，并且處于閱讀框架中。然而，增強子不一定是連續(xù)的。在方便的限制性酶切位點上通過連接反應(yīng)可完成連接。如果這樣的位點不存在，那么可按照常規(guī)實驗合成寡核苷酸接頭或連接子。
在本文中，細胞、細胞系和細胞培養(yǎng)物可交互使用，所有這些定義都包括子代細胞。轉(zhuǎn)化子和轉(zhuǎn)化細胞包括對象的原代細胞及其衍生的培養(yǎng)物，不論傳代次數(shù)。還應(yīng)當理解，子代細胞在DNA含量上不一定完全一致，因為存在有意或無意突變。在篩選原始轉(zhuǎn)化細胞的過程中具有相同功能或生物活性的突變子代細胞也包括在該定義之內(nèi)。如果意味著不同的含義，那么可以從上下文中看出來。
在另一個實施方式中，目的免疫球蛋白的氨基酸序列可通過蛋白直接測序來確定?？梢愿鶕?jù)通用密碼表設(shè)計合適的編碼核苷酸序列。
通過將合適的核苷酸改變引入到編碼DNA內(nèi)或者通過肽合成可以制備出理想抗體的氨基酸序列突變體。這種突變包括，例如，抗體的氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失和/或插入和/或取代。缺失、插入和取代的任意組合都可使用以獲得最后的構(gòu)建體，只要最后的構(gòu)建體具有理想的特征。氨基酸改變還可以改變單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)或突變抗體的翻譯后處理過程，例如改變糖基化位點的數(shù)目和位置。
編碼抗體的氨基酸序列突變體的核酸分子可用本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括而不限于從天然資源中分離(在出現(xiàn)天然氨基酸序列突變的情況下)或者通過寡核苷酸介導(dǎo)的(位點特異性的)突變、PCR突變制備，以及盒式突變先前制備的突變體或抗體的非突變版本。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體的游離核酸，任選是核酸與控制序列可操控地連接，這些控制序列可被宿主細胞、載體和包含核酸的宿主細胞識別，以及制備抗體的重組技術(shù)，該技術(shù)包括培養(yǎng)宿主細胞以表達核酸，以及任選從宿主細胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中回收抗體。
為了通過重組方法制備抗體，將編碼抗體的核酸分離出來并插入到可復(fù)制載體內(nèi)以便于進一步克隆(擴增DNA)或表達。利用常規(guī)方法(例如，通過利用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)很容易分離和測序編碼單克隆抗體的DNA。許多載體都是可用的。載體一般包括而不限于下列元件中的一個或多個信號序列、復(fù)制起始位點、一個或多個篩選標志基因、增強子元件、啟動子以及轉(zhuǎn)錄終止序列。
(1)信號序列組件 本發(fā)明的抗體不僅可以通過重組方法直接制備，而且還可以通過與異源多肽形成融合多肽來制備，優(yōu)選的是，位于成熟蛋白或多肽N末端的信號序列或其他多肽包含特異性裂解位點。所選擇的異源信號序列優(yōu)選能夠被宿主細胞識別和處理(即，被信號肽酶裂解)的信號序列。對于不能識別和處理天然抗體信號序列的原核宿主細胞來說，信號序列可用所選擇的信號序列取代，例如，來源于果膠酶(例如，pelB)、堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定內(nèi)毒素II前導(dǎo)子的信號序列。對于酵母分泌來說，天然信號序列可以被，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)子、α因子前導(dǎo)子(包括酵母屬和克魯維酵母屬α因子前導(dǎo)子)或酸性磷酸酶前導(dǎo)子、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)子或WO 90/13646所描述的信號所取代。在哺乳動物細胞表達中，可以使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)子，如單純皰疹gD信號。
編碼這種前體區(qū)的DNA被連接到編碼抗體的DNA的閱讀框架內(nèi)。
(2)復(fù)制起始位點組件 表達載體和克隆載體都包含能使載體在一種或多種特殊宿主細胞內(nèi)復(fù)制的核酸序列。一般而言，在克隆載體內(nèi)這個序列是能夠使載體獨立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，其中包含復(fù)制起始位點或自主復(fù)制序列。許多細菌、酵母和病毒的這種序列都是已知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起始位點適于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2μ質(zhì)粒起始位點適于酵母，各種病毒的起始位點適于哺乳動物細胞的克隆載體。通常來說，哺乳動物表達載體不需要復(fù)制起始位點元件(一般只使用SV40起始位點，因為它包含早期啟動子)。
(3)篩選標記組件 表達載體和克隆載體可包含篩選基因，也被稱為篩選標志。典型的篩選基因編碼的蛋白質(zhì)能夠(a)賦予對抗生素或其他毒素如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、四環(huán)素、G418、遺傳霉素、組胺醇或霉酚酸的耐藥性，(b)彌補營養(yǎng)缺陷，或者(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基中缺少的關(guān)鍵營養(yǎng)素，例如，編碼Bacilli D丙氨酸消旋酶的基因。
篩選方法的一個例子是利用可以使宿主細胞生長停止的藥物。成功轉(zhuǎn)化外源基因的那些細胞可產(chǎn)生耐藥性蛋白，因而可在選擇培養(yǎng)基中存活下來。這種優(yōu)勢篩選的例子使用藥物甲氨蝶呤、新霉素、組胺醇、嘌呤霉素、霉酚酸和潮霉素。
對于哺乳動物細胞來說，合適篩選標志物的另一個例子是那些能夠用于鑒定細胞是否能夠攝取抗體編碼核酸的標志物，如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II，優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
例如，轉(zhuǎn)化DHFR篩選基因的細胞首先通過在包含甲氨蝶呤(Mtx)的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化子來鑒定，其中甲氨蝶呤是DHFR的競爭性拮抗劑。如果使用野生型DHFR，那么合適的宿主細胞是DHFR活性缺失的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
另外，轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化編碼本發(fā)明抗體、野生型DHFR蛋白以及其他篩選標志物如氨基糖甙3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列的宿主細胞(特別是包含內(nèi)源性DHFR的野生型宿主細胞)也可以通過在含篩選標志物的篩選藥物如氨基糖甙類抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)來進行篩選。參見美國專利號4,965,199。
適用于酵母的篩選基因是酵母質(zhì)粒YRp7上存在的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。trp1基因可為不能在色氨酸中生長的酵母的突變株提供篩選標志物，例如，ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，8512(1977)。因此，酵母宿主細胞基因組內(nèi)存在的trp1損傷為檢測轉(zhuǎn)化提供了一個有效環(huán)境，其中酵母可在缺乏色氨酸的條件下生長。同樣，缺乏Leu2的酵母細胞系(ATCC 20,622或38,626)可被已知的攜帶Leu2基因的質(zhì)粒彌補。缺乏Ura3的酵母細胞系可被攜帶ura3基因的質(zhì)粒彌補。
另外，1.6.mu.m環(huán)狀質(zhì)粒pKD1來源的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母。另外，利用乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng)大規(guī)模制備重組牛凝乳酶也已有報道。Van denBerg，Bio/Technology，8135(1990)。文獻還公開過利用穩(wěn)定的多拷貝表達載體和克魯維酵母的工業(yè)化細胞系分泌成熟的重組人血清白蛋白。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
(4)啟動子組件 表達和克隆載體一般都包含能被宿主有機體識別并與抗體編碼核酸可操控連接的啟動子。適用于原核宿主的啟動子包括阿拉伯糖啟動子(例如，araB)、phoA啟動子、β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)以及雜合啟動子如tac啟動子。但是其他已知的細菌啟動子也可以使用。適用于細菌系統(tǒng)的啟動子還包含與編碼本發(fā)明抗體的DNA可操控連接的夏因-達爾加諾(S.D.)序列。
真核細胞的啟動子序列是已知的。幾乎所有的真核細胞基因都有AT富含區(qū)，該區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約25到30個堿基處。位于許多基因的轉(zhuǎn)錄起始位點上游70到80個堿基處的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3’末端是AATAAA序列，這一序列可能是在編碼序列3’末端添加多聚腺苷酸尾巴的信號。所有這些序列都適于插入到真核表達載體內(nèi)。
可用于酵母宿主的合適啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他酵解酶如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、三磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶的啟動子。
其他酵母啟動子包括乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶以及負責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)，這些啟動子是可誘導(dǎo)啟動子，具有可通過培養(yǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)勢。適用于酵母表達的載體和啟動子在EP 73,657中有進一步描述。酵母啟動子優(yōu)選與酵母增強子聯(lián)合使用。
在哺乳動物宿主細胞內(nèi)，抗體從載體的轉(zhuǎn)錄是可控的，例如，通過病毒基因組來源的啟動子以及哺乳動物異源啟動子如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子，只要這種啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容，其中病毒的例子有艾貝爾遜(氏)白血病病毒、多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥類肉瘤病毒，最優(yōu)選的是巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)。
SV40病毒的早期和晚期啟動子作為SV40的限制性酶切片段可以很方便的獲得，其中還包含SV40的復(fù)制起始位點。人巨細胞病毒的立即早期啟動子作為Hind III E限制性酶切片段可以很方便地獲得。美國專利號4,419,446公開了利用牛乳頭狀瘤病毒為載體的在哺乳動物宿主內(nèi)表達DNA的系統(tǒng)。美國專利號4,601,978描述了對該系統(tǒng)的修飾。也可參見Reyes等，Nature297598-601(1982)所描述的在單純皰疹胸苷激酶啟動子的控制之下人β干擾素cDNA在小鼠細胞內(nèi)的表達。另外，魯斯氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列也可用作啟動子。
(5)增強子組件 通過在載體內(nèi)插入增強子序列通常會增強編碼本發(fā)明抗體的DNA在較高級的真核細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在已知有許多哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)來源的增強子序列。但是，人們通常使用真核細胞病毒來源的增強子。其中的例子包括位于復(fù)制起始位點后側(cè)(100-270bp)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復(fù)制起始位點后側(cè)的多瘤病毒增強子以及腺病毒增強子。也可參見Yaniv，Nature 29717-18(1982)所描述的用于活化真核啟動子的增強子元件。增強子可被插入到載體內(nèi)抗體編碼序列的3’或5’位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5’位置。
(6)轉(zhuǎn)錄終止組件 真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或其他多細胞有機體來源的有核細胞)所使用的表達載體還包含終止轉(zhuǎn)錄以及穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這種序列通常位于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻譯區(qū)，偶爾也會位于3’非翻譯區(qū)。這些區(qū)包含轉(zhuǎn)錄成多聚腺苷酸片段的核苷酸片段，位于編碼抗體的mRNA的非翻譯部分內(nèi)。一個有用的轉(zhuǎn)錄終止元件是牛生長激素多聚腺苷酸區(qū)。參見WO94/11026及其公開的表達載體。另一種是小鼠免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)錄終止子。
(7)宿主細胞的篩選和轉(zhuǎn)化 可用于克隆或表達本文所述的載體內(nèi)的DNA的合適宿主細胞包括上述原核細胞、酵母或較高級的真核細胞。用于此目的的合適原核細胞包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細菌，如埃希氏桿菌屬(Escherichia)的細菌如大腸桿菌(E.coli)，腸道細菌屬(Enterobacter)的細菌、歐文氏菌屬(Erwinia)的細菌、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)的細菌、變形桿菌屬(Proteus)的細菌、沙門氏菌屬(Salmonella)的細菌如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)的細菌如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志賀氏菌屬(Shigella)的細菌，以及桿菌(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日公開的DD 266,710所述的地衣芽孢桿菌)，假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌如綠膿桿菌(P.aeruginosa)，和鏈霉菌屬(Streptomyces)的細菌。一個優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，盡管其他株如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也適用。這些實施例是說明性的，而不是限制性的。除了原核細胞以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是抗體編碼載體的合適克隆或表達宿主。釀酒酵母或常見的發(fā)面酵母是最常用的低級真核宿主微生物。但是，其他屬、種和株也是常用的，也可用于本發(fā)明，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母(Kluyveromyce)宿主如乳酸克魯維酵母(K.lactis)，脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC36,906)，耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)以及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；畢赤酵母(Pichia pastors)(EP183,070)；念珠菌屬(Candida)；木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及絲狀真菌如鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉(Tolypocladium)；以及曲霉屬(Aspergillus)宿主如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
適用于表達糖基化抗體的宿主細胞來源于多細胞生物。無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。許多桿狀病毒株及其突變株和來源于宿主如草地貪夜蛾(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)和家蠶的相應(yīng)昆蟲允許宿主細胞都已被鑒定。用于轉(zhuǎn)染的許多病毒株都是公開的，例如苜蓿銀紋夜蛾NPV的L-1突變株和家蠶NPV的Bm-5株，這種病毒可用作本發(fā)發(fā)明的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾細胞。
棉花、玉米、土豆、大豆、牽?；ā⑽骷t柿、煙草、浮萍和其他植物細胞的培養(yǎng)物也可用作宿主。
但是，最感興趣的是脊椎動物細胞，在培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中繁殖脊椎動物細胞已經(jīng)成為常規(guī)方法?？墒褂玫牟溉閯游锛毎睦佑兄袊鴤}鼠卵巢細胞，其中包括CHOK1細胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；轉(zhuǎn)化SV40的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞系(可在懸浮培養(yǎng)物中生長的293或293亞克隆細胞[Graham等，J.Gen Virol.，3659(1977)])；幼兒倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞爾托利氏細胞(IM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1，ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房腫瘤細胞系(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC5細胞；FS4細胞；以及人肝細胞瘤細胞系(Hep G2)。
宿主細胞可用上述表達或克隆載體轉(zhuǎn)化用于制備抗體，并在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基可加以調(diào)整以便于誘導(dǎo)啟動子、篩選轉(zhuǎn)化子或擴增編碼目的序列的基因。另外，可通過篩選標志分離的新載體和用多個拷貝的轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)染的細胞系是特別有用的，優(yōu)選用于表達抗體。
(8)培養(yǎng)宿主細胞 用于制備本發(fā)明抗體的宿主細胞可在各種培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。商品化的培養(yǎng)基如Ham′s F10(Sigma)、基本必需培養(yǎng)基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)以及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適用于培養(yǎng)宿主細胞。另外，Ham等，Meth.Enz.5844(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)；美國申請?zhí)?,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或者美國專利登記號30,985所描述的培養(yǎng)基也可用于培養(yǎng)宿主細胞。所有這些培養(yǎng)基都必需添加激素和/或其他生長因子(例如，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如，氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶)、抗生素(例如，慶大霉素藥物)、微量元素(通常定義為最終濃度以微摩爾計的無機化合物)以及葡萄糖或等價的能量源。其他必需的添加物也可以適當?shù)臐舛忍砑?，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。培養(yǎng)條件如溫度、pH等為上面篩選宿主細胞表達時所用的那些條件，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
(9)抗體的純化 如果使用重組技術(shù)，抗體可在細胞內(nèi)產(chǎn)生，如胞質(zhì)周圍空間，或直接分泌到培養(yǎng)基內(nèi)，其中包括從微生物培養(yǎng)物中分泌。如果抗體在細胞內(nèi)合成，那么作為第一步，要去除宿主細胞的特定碎片或裂解片段，例如，通過離心或超濾。Better等，Science 2401041-1043(1988)；ICSU Short Reports(ICSU短報道)10105(1990)；以及Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90457-461(1993)描述了一種分離分泌到大腸桿菌胞質(zhì)周圍空間的抗體的方法。(也可參見，[Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992)]。
從微生物或哺乳動物細胞制備的抗體組合物可通過，例如，羥磷灰石色譜、陽離子或陰離子交換層析和親和層析純化，其中親和層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。蛋白A是否合適作為親和配基依賴于抗體的免疫球蛋白Fc區(qū)的種和同種型?；谌甩?、γ2或γ4重鏈，可用蛋白A純化抗體(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。推薦使用蛋白G純化所有小鼠同種型抗體和人γ3(Guss等，EMBO J.515671575(1986))。連接親和性配基最常用的基質(zhì)是瓊脂糖，但是其他基質(zhì)也可以使用。機械穩(wěn)定性的基質(zhì)如定孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯比瓊脂糖更易達到較快的流速和較短的處理時間。如果抗體包含CH3區(qū)，那么可以利用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)進行純化。根據(jù)所回收的抗體，用于蛋白純化的其他技術(shù)如利用離子交換柱進行分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅層析、利用陽離子或陰離子交換樹脂進行肝素SEPHAROSETM層析(例如聚天冬氨酸柱)、色譜聚焦、SDS-PAGE以及硫酸銨沉淀也可以使用。
嵌合抗體 嚙齒類抗體單獨或以偶聯(lián)物的形式重復(fù)給予人體內(nèi)可在受者體內(nèi)產(chǎn)生抗嚙齒類抗體的免疫反應(yīng)；就是所謂的HAMA反應(yīng)(人抗小鼠抗體)。如果需要重復(fù)給藥，HAMA反應(yīng)會限制藥理效應(yīng)。通過用親水聚合物如聚乙二醇化學(xué)修飾抗體或者通過利用基因工程方法制備結(jié)構(gòu)更類似人抗體的抗體如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)可降低抗體的免疫原性。由于這種基因工程抗體在人體內(nèi)的免疫原性比親本小鼠單克隆抗體低，因此它們用于治療人時產(chǎn)生過敏反應(yīng)的風(fēng)險會大大降低。因此，這些抗體在用于治療時是優(yōu)選的，其中包括用于人體內(nèi)。
嵌合單克隆抗體中小鼠單克隆抗體的可變Ig區(qū)被融合到人恒定Ig區(qū)上，利用本領(lǐng)域已知的方法可制備嵌合抗體(參見，Morrison，S.L.，等，(1984)“嵌合人抗體分子；小鼠抗原結(jié)合區(qū)與人恒定區(qū)”(Chimeric Human AntibodyMolecules；Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant RegionDomains)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6841-6855；以及Boulianne，G.L.等，Nature 312，643-646.(1984))。例如，可結(jié)合CEA的嚙齒類抗體的可變區(qū)基因序列可用人骨髓瘤蛋白的可變區(qū)取代，從而生成重組嵌合抗體。這些方法的細節(jié)參見EP 194276、EP 0120694、EP 0125023、EP 0171496、EP 0173494和WO86/01533。雖然某些嵌合的單克隆抗體已被證明在人體內(nèi)具有較低的免疫原性，但是小鼠可變Ig區(qū)依然能導(dǎo)致明顯的人抗鼠反應(yīng)。
人源化抗體 人源化抗體可通過各種方法制備，其中包括，例如(1)將非人補體決定區(qū)(CDR)嫁接到人框架區(qū)和恒定區(qū)上(這個過程在本領(lǐng)域中被稱為通過“CDR嫁接”人源化)，或者(2)移植完整的非人可變區(qū)，但是通過替換表面殘基從而用人樣表面“遮蔽”非人可變區(qū)(這個過程在本領(lǐng)域中被稱為“覆蓋”)。在本發(fā)明中，人源化抗體包括“人源化的”抗體和“覆蓋的”抗體。這些方法見于，例如Jones等，Nature 321522 525(1986)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，8168516855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，4465 92(1988)；Verhoeyer等，Science 2391534 1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28489 498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)169 217(1994)和Kettleborough，C.A.等，Protein Eng.4(7)773 83(1991)的描述，本文已完整納入?yún)⒖肌?br> 例如，嚙齒類抗體CDR的基因序列可以被分離出來，或者合成出來，并用同源人抗體基因的相應(yīng)序列區(qū)取代，形成具有原始嚙齒類抗體特異性的人抗體。這些方法見于EP 023940、WO 90/07861和WO91/09967的描述。
CDR嫁接包括將小鼠重鏈和輕鏈可變Ig區(qū)6個CDR中的一個或多個導(dǎo)入到人可變Ig區(qū)的四個合適框架區(qū)內(nèi)，這也被稱為CDR嫁接。這種技術(shù)(Riechmann，L.，等，Nature 332，323(1988))利用保守的框架區(qū)(FR1-FR4)作為支架支持主要與抗原接觸的CDR環(huán)。但是，CDR嫁接的缺點在于產(chǎn)生的人源化抗體的結(jié)合親和力明顯低于原來的小鼠抗體，因為框架區(qū)氨基酸的主要功能在于抗原結(jié)合，以及因為CDR環(huán)的氨基酸會影響兩個可變Ig區(qū)的聯(lián)系。為了保持人源化單克隆抗體的親和力，可以通過選擇與原來小鼠抗體的框架區(qū)最相似的人框架區(qū)，或者根據(jù)抗原結(jié)合位點的計算機模型的幫助通過位點特異性突變框架區(qū)或CDR內(nèi)的單個氨基酸來改善CDR嫁接技術(shù)(例如Co，M.S.，等，(1994)，J.Immunol.152，2968-2976)。
人源化抗體的一種方法包括將非人重鏈和輕鏈序列與人重鏈和輕鏈序列一起排列，根據(jù)排列的結(jié)果選擇并用人框架區(qū)替換非人框架區(qū)，制作分子模型預(yù)測人源化抗體的構(gòu)型并與親本抗體的構(gòu)型進行比較。然后重復(fù)回復(fù)突變CDR區(qū)內(nèi)的殘基以打破CDR的結(jié)構(gòu)，直到人源化序列模型的預(yù)測構(gòu)型非常接近親本非人抗體的非人CDR的構(gòu)型為止。這種人源化抗體還可以進一步衍化以促進攝取和清除，例如，通過Ashwell受體(參見，例如，美國申請?zhí)?,530,101和5,585,089，本文已納入作為參考)。
通過合理設(shè)計已經(jīng)完成了多種小鼠單克隆抗體的人源化(參見，例如，2002年7月11日公開的20020091240、WO 92/11018和美國專利No.，5,693,762、No.5,766,866)。
Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體) 術(shù)語“Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)”是指來源于非人抗體，一般是小鼠單克隆抗體，的抗體。另外，Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)可以來源于嵌合抗體，這種嵌合抗體保留或基本保留了親本非人抗體的抗原結(jié)合特性，但是與親本抗體相比在用于人體內(nèi)時無免疫原性。
Studnicka已描述過抗體可變區(qū)的Human EngineeringTM(人基因工程化)[參見，例如，Studnicka等，美國專利號5,766,886；Studnicka等，Protein Engineering7805-814(1994)]，這種方法可用于降低免疫原性，同時又能保持抗體分子的結(jié)合活性。根據(jù)該方法，每一個可變區(qū)氨基酸都被設(shè)定了取代的風(fēng)險。根據(jù)風(fēng)險不同氨基酸取代可分為三組(1)低風(fēng)險改變是破壞抗原結(jié)合活性的可能最小，并且最適合用于降低免疫原性的那些氨基酸；(2)中風(fēng)險改變是雖然可被用于進一步降低免疫原性，但是有較大可能影響抗原結(jié)合或蛋白折疊的那些氨基酸；(3)高風(fēng)險殘基是對于結(jié)合或維持抗體結(jié)構(gòu)具有重要作用并且最可能影響抗原結(jié)合或蛋白折疊的那些殘基。由于脯氨酸在維持三維結(jié)構(gòu)中的作用，通常認為在脯氨酸上進行修飾至少是中風(fēng)險改變，即使該位置一般是低風(fēng)險位置。
在預(yù)先確定不可能對抗原結(jié)合或蛋白折疊產(chǎn)生不良影響但是可能會降低抗體在人體環(huán)境中的免疫原性的位置上替換人氨基酸，這樣嚙齒類抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)就是人基因工程化的(Human EngineeredTM)。通過使嚙齒類可變區(qū)的氨基酸序列與人可變區(qū)序列一起排列可以鑒定出處于“低風(fēng)險”位置并且能夠用本發(fā)明的方法進行修飾的氨基酸殘基。所有人可變區(qū)都可以應(yīng)用，其中包括獨特的VH或VL序列、或者人共有VH或VL序列、或者獨特的或共有的人種系序列。低風(fēng)險位置上任意數(shù)目的氨基酸，或者全部氨基酸殘基都可以被改變。例如，在每一個低風(fēng)險位置上如果排列在一起的小鼠氨基酸殘基和人氨基酸殘基是不同的，那么就可以用人的殘基取代嚙齒類的殘基。另外，所有低風(fēng)險位置上的氨基酸殘基以及任意數(shù)目的中風(fēng)險位置上的氨基酸殘基都可以被改變。理想的狀況是，所有低風(fēng)險和中風(fēng)險位置都從嚙齒類序列改變?yōu)槿诵蛄幸赃_到最低程度的免疫原性。
構(gòu)建包含修飾重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的合成基因并連接到人γ重鏈和/或κ輕鏈恒定區(qū)。所有人重鏈和輕鏈恒定區(qū)都可用于連接Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)可變區(qū)，其中包括IgA(所有亞類的IgA，如gA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(所有亞類的IgG，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因?qū)氲剿拗骷毎绮溉閯游锛毎麅?nèi)，收獲產(chǎn)生出的重組免疫球蛋白產(chǎn)物并鑒定其特征。
來自于轉(zhuǎn)基因動物的人抗體 利用轉(zhuǎn)基因動物可以生產(chǎn)抗靶抗原的人抗體，其中轉(zhuǎn)基因動物無內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生，并且經(jīng)過基因工程改造包含人免疫球蛋白基因座。例如，WO98/24893公開了包含人Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物，其中動物因為其內(nèi)源性的重鏈和輕鏈基因座被滅活因而不產(chǎn)生功能性的內(nèi)源性免疫球蛋白。WO 91/10741也公開了能夠產(chǎn)生抗免疫原的免疫反應(yīng)的非靈長類轉(zhuǎn)基因哺乳動物宿主，其中抗體包含靈長類的恒定區(qū)和/或可變區(qū)，編碼內(nèi)源性免疫球蛋白的基因座被替換或被滅活。WO 96/30498公開了Cre/Lox系統(tǒng)在修飾哺乳動物免疫球蛋白基因座中的用途，例如替換全部或部分恒定區(qū)或可變區(qū)從而形成經(jīng)修飾的抗體分子。WO 94/02602公開了包含滅活的內(nèi)源性Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳動物宿主。美國專利號5,939,598公開了制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，其中小鼠缺乏內(nèi)源性重鏈，表達包含一個或多個異種恒定區(qū)的外源性免疫球蛋白基因座。
利用上述轉(zhuǎn)基因動物可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)以篩選抗原性分子，從動物體內(nèi)收獲抗體產(chǎn)生細胞，用于制備分泌人單克隆抗體的雜交瘤。免疫方法、佐劑等是本領(lǐng)域熟知的，可用于，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫，如WO 96/33735所述。這篇文獻公開了抗各種抗原性分子如IL 6、IL 8、TNFa、人CD4、L選擇素、gp39和破傷風(fēng)毒素的單克隆抗體。檢測單克隆抗體抑制或中和相應(yīng)蛋白的生物學(xué)活性或生理效應(yīng)的能力。WO 96/33735報道，來源于IL-8免疫轉(zhuǎn)基因小鼠免疫細胞的抗IL-8單克隆抗體可阻斷IL-8誘導(dǎo)的中性粒細胞的功能。用于免疫轉(zhuǎn)基因動物的具有抗原特異性的人單克隆抗體還可見于WO 96/34096和美國專利申請?zhí)?0030194404；以及美國專利申請?zhí)?0030031667的描述。還可參見Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.，733(1993)；以及美國專利號5,591,669、美國專利號5,589,369、美國專利號5,545,807；和美國專利申請?zhí)?0020199213、WO 96/34096以及美國專利申請?zhí)?0030194404；和美國專利申請?zhí)?0030031667。
可用于制備單克隆抗體的其他轉(zhuǎn)基因動物包括美國專利號5,770,429和Fishwild，等，(Nat.Biotechnol.14845-851，1996)所描述的MedarexHuMAb-

該動物包含來源于未重排人抗體基因的基因序列，其中的人抗體基因編碼人抗體的重鏈和輕鏈。免疫HuMAb-

可產(chǎn)生抗靶蛋白的單克隆抗體。
另外，Ishida等(Cloning Stem Cells.491-102，2002)描述了TransChromoMouse(轉(zhuǎn)染色體小鼠)(TCMOUSETM)，這種動物包含人DNA的Mb大小的片段，插入了完整的人免疫球蛋白(hIg)基因座。TCMOUSE包含hIg的全部多樣性譜，其中包括IgG的亞類(IgG1-G4)。用各種人抗體免疫TC Mouse可產(chǎn)生包含人抗體的抗體反應(yīng)。
美國專利申請?zhí)?0030092125描述了使動物的免疫反應(yīng)偏向于目的表位的方法。人抗體也可以通過在體外活化B細胞來制備(參見美國申請?zhí)?,567,610和5,229,275)。
來自于噬菌體展示技術(shù)的抗體 制備重組人抗體基因譜技術(shù)以及在絲狀噬菌體表面展示編碼抗體片段的技術(shù)的發(fā)展為我們提供了一種直接制備和篩選人抗體的重組方式，這種技術(shù)還可用于人源化的、嵌合的、小鼠的或突變的抗體。通過噬菌體技術(shù)制備的抗體是作為細菌內(nèi)的抗原結(jié)合片段，通常是Fv或Fab片段而產(chǎn)生的，因此缺少效應(yīng)功能。效應(yīng)功能可通過兩種策略之一引入片段被改造成可在哺乳動物細胞內(nèi)表達的完整抗體，或者被改造成包含能激發(fā)效應(yīng)功能的第二結(jié)合位點的雙特異性抗體片段。
一般而言，抗體的Fd片段(VH-CH1)和輕鏈(VL-CL)分別通過PCR克隆，然后隨機重組到組合噬菌體展示文庫中，然后根據(jù)與特定抗原的結(jié)合來篩選文庫。Fab片段表達在噬菌體表面，即，與編碼它們的基因物理相連。因此，通過抗原結(jié)合來篩選Fab的同時也篩選了編碼Fab的序列，后者可隨后進行擴增。經(jīng)過幾輪的抗原結(jié)合和重復(fù)擴增就可以富集并最終分離出抗原特異性的Fab，這一過程被稱為淘洗。
在1994年，報道了一種被稱為“引導(dǎo)篩選”的抗體人源化方法。引導(dǎo)篩選利用噬菌體展示技術(shù)人源化小鼠單克隆抗體(參見Jespers，L.S.，等，Bio/Technology 12，899-903(1994))。為了達到此目的，小鼠單克隆抗體的Fd片段與人輕鏈文庫一起展示，得到的雜合Fab文庫用抗原進行篩選。因而小鼠的Fab片段為引導(dǎo)篩選提供了一個模板。隨后，篩選出的人輕鏈與人Fd片段文庫結(jié)合。篩選所得到的文庫就可以獲得完整的人Fab。
從噬菌體文庫制備人抗體的各種方法都有報道(參見，例如，Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol，222581-597(1991)；美國申請?zhí)?,565,332和5,573,905；Clackson，T.和Wells，J.A.，TIBTECH 12，173-184(1994))。更具體地說，利用噬菌體文庫體外篩選和基因工程抗體已經(jīng)成為一種有效的工具(參見Burton，D.R.和Barbas III，C.F.，Adv.Immunol.57，191-280(1994)以及Winter，G.，等，Annu.Rev.Immunol.12，433-455(1994)；美國專利申請?zhí)?0020004215和WO92/01047；2003年10月9日公開的美國專利申請?zhí)?0030190317以及美國專利號6,054,287；美國專利號5,877,293)。
Watkins，“通過捕獲提升篩選噬菌體表達的抗體文庫”(“Screening ofPhage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift)，《分子生物學(xué)方法，抗體噬菌體展示方法和操作手冊》(Methods in Molecular Biology，Antibody PhageDisplayMethods and Protocols)178187-193以及2003年3月6日公開的美國專利申請?zhí)?00120030044772描述了通過捕獲提升(capture lift)篩選噬菌體表達抗體文庫或其他結(jié)合分子的方法，該方法包括將候選結(jié)合分子固定在固相支持物上。
也可以利用本發(fā)明的治療方法來篩選抗體產(chǎn)物的活性和適用性，如本文“篩選方法”部分所描述的方法以及本領(lǐng)域熟知的任何合適方法。
氨基酸序列突變體 本發(fā)明的抗體包括親本抗體的突變型蛋白或突變體，其中親本抗體的多肽序列被改變，可變區(qū)或與可變區(qū)等價的區(qū)域其中包括CDR內(nèi)至少有一個氨基酸取代、缺失或插入，但是突變型蛋白或突變體依然保留了理想的結(jié)合親和力或生物學(xué)活性。突變體可以與親本抗體基本同源或基本一致，例如，至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸是一致的或同源的。有關(guān)這個序列的一致性或同源性在本文中被定義為，當序列排列在一起，如果需要可引入間隙，達到最大序列百分一致性后，保守取代不被當作是序列一致性的一部分，候選序列上與親本序列一致的氨基酸參見所占的百分率。抗體序列的N端、C端或內(nèi)部延伸、內(nèi)部缺失或插入都被認為不會影響序列的一致性或同源性。因此，序列一致性可通過比較兩個多肽的氨基酸位置的相似性常用的標準方法確定。利用計算機程序如BLAST或FASTA，將兩個多肽排列在一起使其各自的氨基酸達到最佳匹配(在一個或兩個序列的全長上，或者在一個或兩個序列的預(yù)先確定區(qū)域)。這種程序提供了默認的缺口補償和默認的間隙補償，評分矩陣如PAM250[標準評分矩陣；Dayhoff等，《蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，第5卷，增刊3(1978)]可配合計算機程序一起使用。例如，百分一致性可按如下公式計算匹配一致的總數(shù)/(匹配區(qū)間內(nèi)較長序列的長度+為了排列兩個序列而在較長序列內(nèi)引入的間隙數(shù))×100。
本發(fā)明的抗體還包括恒定區(qū)多肽序列的改變，這種改變不會影響結(jié)合親和力但是會改變效應(yīng)功能，如抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)、補體依賴的細胞毒作用(CDC)或清除和攝取(以及對半衰期的影響)。
插入 氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，長度范圍從一個殘基到包含100或100以上殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基如2、3或更多氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括帶N端蛋氨酰殘基的抗體，或與表位標簽或補救受體表位融合的抗體?？贵w分子的另一類插入突變體包括添加糖基化位點、添加形成分子內(nèi)或分子間鍵的半胱氨酸、或與提高抗體血清半衰期的多肽融合，如融合到N端或C端。例如，半胱氨酸鍵可添加到抗體上以提高其穩(wěn)定性(特別是當抗體是抗體片段如Fv片段時)。
抗體的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接是指糖基基序連接到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是糖基基序經(jīng)酶催化連接到天冬酰胺側(cè)鏈上的識別序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。多肽上的這些三肽序列只要有一個存在就可以成為潛在的糖基化位點。因此，N-連接糖基化位點可以通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個這種三肽序列添加到抗體上。O-連接糖基化是指一個糖基N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖連接到羥氨基酸上，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸也可以使用。O-連接糖基化位點可通過將一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基插入到原始抗體的序列上或者用一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基取代原始抗體的序列來添加到抗體上。
術(shù)語“附加的表位”是指融合到表位標簽上的抗體。表位標簽多肽有足夠多的殘基以提供表位從而可制造針對該表位的抗體，但是表位標簽又很短，因此不會影響抗體的活性。優(yōu)選的表位標簽是十分獨特的，這樣抗該表位的抗體基本不與其他表位有交叉反應(yīng)。適宜的表位標簽多肽一般包含至少6個氨基酸殘基，通常在約8-50個氨基酸殘基之間(優(yōu)選約9-30個殘基)。表位標簽的例子包括流感病毒血凝素標簽多肽及其抗體12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.82159-2165(1988)]；c-myc標簽及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體[Evan等，Mol.Cell.Biol.5(12)3610-3616(1985)]；以及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標簽及其抗體[Paborsky等，Protein Engineering 3(6)547-553(1990)]。其他典型的標簽是多聚組氨酸序列，一般約6個組氨酸殘基，利用鎳螯合技術(shù)可以分離標記有這種標簽的化合物。其他標記和標簽如

標簽(紐約羅徹斯特柯達公司(Eastman Kodak，Rochester，NY))是本領(lǐng)域熟知和常用的，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本文中，術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)上的表位，負責(zé)提高IgG分子在體內(nèi)的血清半衰期。
缺失 氨基酸序列缺失包括長度從1個到100或100個以上殘基的氨基端和/或羧基端缺失，但是得到的片段還保留對靶抗原的結(jié)合親和力，以及單個或多個氨基酸殘基如2、3或更多氨基酸殘基的序列內(nèi)缺失。例如，通過缺失糖基化的部分或全部三肽序列或其他識別序列來刪除糖基化位點或者將糖基化位點轉(zhuǎn)移到其他位置。
取代 另一類突變體是氨基酸取代突變。在這些突變體中，抗體分子的至少一個氨基酸殘基被去除，同時在其位置上插入了另一個不同的殘基。本發(fā)明包括超級可變區(qū)或CDR區(qū)或框架區(qū)內(nèi)的取代突變。保守取代列于下面的表1中。如果這種取代不會導(dǎo)致生物活性的改變，則可以引入表1中被稱為“典型取代”的更多實質(zhì)改變或者在下文氨基酸分類部分所進一步描述的更多實質(zhì)改變，并且用于產(chǎn)物篩選。
表1 起始殘基 典型取代優(yōu)選取代 Ala(A)val；leu；ile val Arg(R)lys；gln；asn lys Asn(N)gln；his；asp，lys；gln arg Asp(D)glu；asnglu Cys(C)ser；alaser Gln(Q)asn；gluasn Glu(E)asp；glnasp Gly(G)ala His(H)asn；gln；lys；arg Ile(I)leu；val；met；ala；leu phe； 亮氨酸 Leu(L)norleucine；ile；val； ile met；ala；phe Lys(K)arg；gln；asn arg Met(M)leu；phe；ile leu Phe(F)leu；val；ile；ala；tyr Pro(P)ala Ser(S)thr Thr(T)ser ser Trp(W)tyr；phe tyr Tyr(Y)trp；phe；thr；ser phe Val(V)ile；leu；met；phe； leu ala；正亮氨酸 抗體生物學(xué)特性的實質(zhì)改變可通過篩選取代來完成，其中的取代在以下方面具有明顯不同的效應(yīng)(a)維持取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，形成折疊或螺旋構(gòu)型，(b)維持分子在靶位上的電荷或疏水性，或(c)維持側(cè)鏈的松散性(bulk)。天然殘基根據(jù)常見的側(cè)鏈特性可分成以下幾組 (1)疏水性的正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile； (2)中性親水性的cys，ser，thr； (3)酸性的asp，glu； (4)堿性的asn，gln，his，lys，arg； (5)影響側(cè)鏈方向的殘基gly，pro；以及 (6)芳香族殘基trp，tyr，phe。
保守取代包括用同一類氨基酸中的其他成員取代該氨基酸。非保守取代包括用另一類氨基酸的成員取代這些類中一類的成員。
不參與維持抗體正確構(gòu)型的所有半胱氨酸殘基都可以被取代，一般是用絲氨酸取代，以改善分子的氧化穩(wěn)定性，阻止異常交聯(lián)發(fā)生。
親和力成熟通常包括制備和篩選親本抗體CDR內(nèi)有取代的抗體突變體以及篩選生物學(xué)特性如結(jié)合親和力比親本抗體高的突變體。制備這種取代突變體的一種簡便方法是利用噬菌體展示技術(shù)進行親和力成熟。簡言之，突變幾個超級可變區(qū)位點(例如，6-7個位點)以使每個位點上都包含所有可能的氨基酸取代。然后將制備出的抗體突變體與包裹在每個絲狀噬菌體顆粒內(nèi)的M13的基因III產(chǎn)物融合并以單價方式展示在噬菌體顆粒上。然后再根據(jù)生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和力)篩選噬菌體展示的突變體。參見，例如，WO 92/01047、WO93/112366、WO 95/15388和WO 93/19172。
目前所用的抗體親和力成熟方法屬于兩類突變技術(shù)隨機的和非隨機的。易錯PCR、誘變菌株(Low等，J.Mol.Biol.260，359-68，1996)和飽和突變(Nishimiya等，J.Biol.Chem.27512813-20，2000；Chowdhury，P.S.，MethodsMol.Biol.178，269-85，2002)屬于典型的隨機突變方法(Rajpal等，Proc NatlAcad Sci U S A.1028466-71，2005)。非隨機突變技術(shù)通常利用丙氨酸掃描或位點特異性突變制備有限的特異性突變體群。某些方法將在下文作進一步描述。
通過淘洗方法進行親和力成熟-重組抗體的親和力成熟通常通過幾輪淘洗候選抗體來完成，隨著淘洗輪次的增加抗原數(shù)量逐漸減少。每一輪抗原數(shù)量的減少都會篩選出具有最高抗原親和力的抗體，從而可以從一大群起始材料中得到具有高親和力的抗體。通過淘洗進行親和力成熟是本領(lǐng)域所述的，可見于，例如，Huls等，(Cancer Immunol Immunother.50163-71，2001)的描述。利用噬菌體展示技術(shù)進行親和力成熟的方法在本文的其他地方也有描述，也是本領(lǐng)域所熟知的(參見，例如，Daugherty等，Proc Natl Acad Sci U S A.972029-34，2000)。
精確突變(Look-through mutagenesis)-精確突變(LTM)(Rajpal等，ProcNatl Acad Sci U S A.1028466-71，2005)提供了一種快速繪制抗體結(jié)合位點地圖的方法。在LTM中，代表20種天然氨基酸所提供的主要側(cè)鏈化學(xué)的9種氨基酸被用于分析在抗體所有6個CDR的每一個位置上功能側(cè)鏈對結(jié)合的貢獻大小。LTM可在CDR內(nèi)產(chǎn)生一系列單突變，其中每一個“野生型”殘基都被所選出的9個氨基酸中的一個有組織的取代。突變的CDR組合在一起就形成了復(fù)雜性和容量不斷增加但不會妨礙所用突變體定量展示的組合單鏈可變區(qū)片段(scFv)文庫。經(jīng)過正篩選以后，結(jié)合活性升高的克隆測序，繪制出有益的突變。
易錯PCR-易錯PCR包括不同篩選輪次之間的核酸的隨機化。由聚合酶內(nèi)源性出錯頻率導(dǎo)致的隨機化發(fā)生率很低，但是在轉(zhuǎn)錄期間使用具有高內(nèi)源性出錯率的聚合物(Hawkins等，J Mol Biol.226889-96，1992)進行易錯PCR可提高隨機化發(fā)生率(Zaccolo等，J.Mol.Biol.285775-783，1999)。經(jīng)過多個突變循環(huán)以后，利用本領(lǐng)域的常規(guī)方法可以篩選出抗原親和力升高的克隆。
DNA改組-核酸改組是一種在體內(nèi)或體外同源重組一群較短的或較小的多聚核苷酸以制備突變多聚核苷酸的方法。DNA改組可見于美國專利號6,605,449、美國專利6,489,145、WO 02/092780和Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9110747-51(1994)的描述。一般而言，DNA改組包括三步用DNA酶I將需要改組的基因片段化，片段隨機雜交并在DNA聚合酶存在的條件下通過PCR(有性PCR)裝配或填充片段化的基因，以及通過常規(guī)PCR擴增重新裝配的產(chǎn)物。
DNA改組與易錯PCR不同，后者是反向鏈式反應(yīng)。在易錯PCR中，聚合酶起始位點數(shù)目和分子數(shù)量呈指數(shù)升高。與之相反，在核酸重裝配或隨機多聚核苷酸改組中，起始位點的數(shù)目和隨機多聚核苷酸的數(shù)目(而不是大小)隨時間延長而減少。
對于抗體來說，DNA改組可以使所有的CDR1、所有的CDR2和所有的CDR3自由組合連接。值得注意的是，在同一個反應(yīng)中，多個家族的序列可以同時被改組。另外，改組通常具有相當次序，因此，例如，CDR1一般不會出現(xiàn)在CDR2的位置。稀有的改組子包含大量的上佳(例如，最高親和力的)CDR，這些稀有改組子可根據(jù)其超級親和力進行篩選。
可用于DNA改組的多聚核苷酸模板可以是DNA或RNA。根據(jù)被重組或重裝配的基因或者較短或較小多聚核苷酸的大小，模板可以是各種長度的。優(yōu)選的是，多聚核苷酸的長度為50bp到50kb。多聚核苷酸模板一般是雙鏈。
值得注意的是，在基因篩選的起始步驟，包含與多聚核苷酸模板具有一致性的區(qū)以及與多聚核苷酸模板具有異質(zhì)性的區(qū)的單鏈或雙鏈核酸可被添加到多聚核苷酸模板上。還應(yīng)當注意的是，在起始步驟中，兩個不同但相關(guān)的多聚核苷酸模板可以混合在一起。
丙氨酸掃描突變-丙氨酸掃描突變可用于鑒定對抗原結(jié)合有明顯影響的超級可變區(qū)殘基。Cunningham和Wells(Science，2441081-1085(1989))。殘基或靶殘基的基團被鑒定(例如，帶電荷的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并被中性的或帶負電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代以影響氨基酸與抗原的相互作用。那些被證明對取代具有功能敏感性的氨基酸位置再通過在取代位點上進一步引入突變或引入其他突變來確認。因此，雖然引入氨基酸序列改變的位點要被預(yù)先確定，但是突變的本質(zhì)性質(zhì)無須預(yù)先確定。例如，為了分析給定位點上突變的表現(xiàn)，要在靶編碼子或編碼區(qū)上進行丙氨酸掃描或隨機突變，然后篩選表達的具有理想活性的抗體突變體。
計算機輔助設(shè)計-另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)是有用的，晶體結(jié)構(gòu)可用于鑒定抗體和抗原之間的接觸點，或者用于通過計算機軟件制作這種接觸點的模型。這種接觸殘基及其鄰近殘基是利用本文所述的技術(shù)進行取代的候選殘基。一旦制備出這樣的突變體，就可以按照本文所述的方法篩選這一組突變體，篩選出在一個和多個相關(guān)分析中具有優(yōu)越特性的抗體用于進一步的開發(fā)。
親和力成熟通常包括制備和篩選親本抗體CDR內(nèi)有取代的抗體突變體以及篩選生物學(xué)特性如結(jié)合親和力比親本抗體高的突變體。制備這種取代突變體的一種簡便方法是利用噬菌體展示技術(shù)進行親和力成熟。簡言之，突變幾個超級可變區(qū)位點(例如，6-7個位點)以使每個位點上都包含所有可能的氨基酸取代。然后將制備出的抗體突變體與包裹在每個絲狀噬菌體顆粒內(nèi)的M13的基因III產(chǎn)物融合并以單價方式展示在噬菌體顆粒上。然后再根據(jù)生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和力)篩選噬菌體展示的突變體。
丙氨酸掃描突變可用于鑒定對抗原結(jié)合有明顯影響的超級可變區(qū)殘基。另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)是有用的，晶體結(jié)構(gòu)可用于鑒定抗體和抗原之間的接觸點。這種接觸殘基及其鄰近殘基是利用本文所述的技術(shù)進行取代的候選殘基。一旦制備出這樣的突變體，就可以按照本文所述的方法篩選這一組突變體，篩選出在一個和多個相關(guān)分析中具有優(yōu)越特性的抗體用于進一步的開發(fā)。
改變的效應(yīng)功能 本發(fā)明還涉及抗體的其他修飾。修飾與效應(yīng)功能有關(guān)的本發(fā)明的抗體是我們所期望的，例如，以此來增強抗體的癌癥治療效應(yīng)。例如，半胱氨酸殘基可以被引入到Fc區(qū)，從而允許在該區(qū)形成鏈間二硫鍵。因此，由此制備出的同源二聚體抗體的內(nèi)化能力得以提高，和/或補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)得以增強。參見Caron等，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)?；钚栽鰪姷耐炊垠w抗體還可以用異源雙功能交聯(lián)子來制備，如Wolff等，Cancer Research 532560-2565(1993)的描述。另外，抗體可以經(jīng)過改造使其包含兩個Fc區(qū)，從而增強其補體裂解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。另外，試驗證明CDR內(nèi)的序列可使抗體與MHC II類分子結(jié)合，激發(fā)不必要的輔助T細胞反應(yīng)。保守取代可使抗體保留其結(jié)合活性，但是卻喪失了激發(fā)不必要T細胞反應(yīng)的能力。也可參見Steplewski等，Proc Natl Acad Sci U SA.1988；85(13)4852-6，本文已完整納入作為參考，在該文獻所描述的嵌合抗體中，小鼠的可變區(qū)與人的γ1、γ2、γ3和γ4恒定區(qū)相連。
在本發(fā)明的某些實施方式中，比較理想的是用抗體片段而不是完整抗體來增加腫瘤滲透性。在這種情況下，最好修飾抗體片段以提高其血清半衰期，例如，在抗體片段上添加分子如PEG或其他水溶性聚合物，其中包括多糖聚合物，以提高半衰期。也可以通過，例如，在抗體片段上插入補救受體結(jié)合表位來達到此目的(例如，通過突變抗體片段上的合適區(qū)域或者將表位插入到肽標簽內(nèi)然后融合到抗體片段的一端或者插入到抗體片段中間，例如，通過DNA或肽合成)(參見，例如，WO96/32478)。
補救受體結(jié)合表位優(yōu)選組成一個區(qū)，在該區(qū)內(nèi)來自于Fc區(qū)的一個或兩個環(huán)的一個或多個氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移到抗體片段的相似位置。更優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)移Fc區(qū)的一個或兩個環(huán)的3個或3個以上殘基。更優(yōu)選的是，表位來自于Fc區(qū)(如IgG的Fc區(qū))的CH2區(qū)并被轉(zhuǎn)移到CH1、CH3或VH區(qū)或者抗體的多個這樣的區(qū)內(nèi)。另外，表位來自于Fc區(qū)的CH2區(qū)并被轉(zhuǎn)移到抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)，或者這兩個區(qū)內(nèi)。也可參見國際申請WO 97/34631和WO 96/32478，其中描述了Fc突變體及其與補救受體的相互作用。
因此，本發(fā)明的抗體可包含人Fc部分、人共有Fc部分或其突變體，其中突變體保留了與Fc補救受體相互作用的能力，這些突變體中參與形成二硫鍵的半胱氨酸被修飾或被去除，和/或蛋氨酸被添加在N端，和/或N端20個氨基酸中的一個或多個被刪除，和/或與補體結(jié)合的區(qū)域如C1q結(jié)合位點被刪除，和/或ADCC位點被刪除[參見，例如，Molec.Immunol.29(5)633-9(1992)]。IgG類的抗體也可以包含不同的恒定區(qū)，例如，IgG2抗體經(jīng)修飾后具有了IgG1或IgG4的恒定區(qū)。
對于IgG1來說，對恒定區(qū)特別是鉸鏈區(qū)或CH2區(qū)的修飾可增強或降低效應(yīng)功能，其中包括ADCC和/或CDC活性。在其他實施方式中，IgG2恒定區(qū)經(jīng)修飾后可降低抗體-抗原凝集物的形成。對于IgG4來說，對恒定區(qū)特別是鉸鏈區(qū)的修飾可減少半抗體的形成。在特別典型的實施方式中，本發(fā)明涉及將IgG4鉸鏈區(qū)序列Cys-Pro-Ser-Cys突變成IgG1鉸鏈區(qū)序列Cys-Pro-Pro-Cys。
以前的研究已經(jīng)繪制出了人和小鼠IgG上的FcR結(jié)合位點的地圖，這些位點主要位于低鉸鏈區(qū)，由IgG殘基233-239組成。其他研究結(jié)果表明，另外一些片段，例如，Gly316-Lys338用于結(jié)合人Fc受體I，Lys274-Arg301和Tyr407-Arg416用于結(jié)合人Fc受體III，或者在低鉸鏈區(qū)之外有幾個特殊的殘基，例如小鼠IgG2b的Asn297和Glu318與小鼠Fc受體II相互作用。文獻報道的人IgG1 Fc片段與人Fc受體IIIA結(jié)合的

晶體結(jié)構(gòu)說明IgG1殘基Leu234-Ser239、Asp265-Glu269、Asn297-Thr299和Ala327-Ile332參與和Fc受體IIIA的結(jié)合。該研究根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)證明，除了低鉸鏈區(qū)(Leu234-Gly237)，IgGCH2區(qū)環(huán)FG(殘基326-330)和BC(殘基265-271)可能在與Fc受體IIA結(jié)合時發(fā)揮關(guān)鍵作用。參見Shields等，J.Biol.Chem.，276(9)6591-6604(2001)，本文已完整納入作為參考。Fc受體結(jié)合位點內(nèi)的殘基突變可導(dǎo)致效應(yīng)功能的改變，例如ADCC或CDC活性的改變，或者半衰期的改變。如上所述，有效突變包括一個和多個殘基的插入、缺失或取代，其中包括丙氨酸的取代、保守取代、非保守取代或用不同IgG亞類同一位置上的相應(yīng)氨基酸殘基的取代(例如，用IgG2該位置的相應(yīng)殘基取代IgG1的殘基)。
Shields等報道，參與結(jié)合所有人Fc受體的IgG1殘基定位于靠近鉸鏈區(qū)的CH2區(qū)，可分為如下兩類1)與所有FcR直接相互作用的位置，其中包括Leu234-Pro238、Ala327和Pro329(可能還有Asp265；2)影響糖鏈性質(zhì)的位置或者包含Asp265和Asn297的位置。影響與Fc受體II結(jié)合的其他IgG1殘基還有(影響最大的)Arg255、Thr256、Glu258、Ser267、Asp270、Glu272、Asp280、Arg292、Ser298，以及(影響較小的)His268、Asn276、His285、Asn286、Lys290、Gln295、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322、Lys326、Pro331、Ser337、Ala339、Ala378和Lys414。A327Q、A327S、P329A、D265A和D270A抑制結(jié)合。除了已鑒定出的影響結(jié)合所有FcR的上述結(jié)合以外，可使Fc受體IIIA結(jié)合下降40％或更多的其他IgG1殘基有Ser239、Ser267(只有Gly)、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Val303、Lys338和Asp376。與FcRIIIA的結(jié)合活性提高的突變包括T256A、K290A、S298A、E333A、K334A和A339T。試驗證明，Lys414突變可使與FcRIIA和FcRIIB的結(jié)合活性下降40％，Arg416突變可使與FcRIIA和FcRIIIA的結(jié)合活性下降30％，Gln419突變可使與FcRIIA的結(jié)合活性下降30％，與FcRIIB的結(jié)合活性下降40％，以及Lys360突變可使與FcRIIIA的結(jié)合活性升高23％。也可參見Presta等，Biochem.Soc.Trans.(2001)30，487-490。
例如，美國專利號6,194,551，本文已完整納入作為參考，描述了效應(yīng)功能發(fā)生改變的突變體，該突變體的人IgG Fc區(qū)的329、331或322位(根據(jù)Kabat編號)氨基酸發(fā)生了突變，其中某些突變顯示可降低C1q結(jié)合活性或CDC活性。作為另一個例子，美國專利號6,737,056，本文已完整納入作為參考，描述了效應(yīng)功能或Fcγ受體結(jié)合活性發(fā)生改變的突變體，其中的突變發(fā)生在人IgG Fc區(qū)的238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439位氨基酸(根據(jù)Kabat編號)，某些突變體顯示出了與ADCC或CDC活性下降相關(guān)的受體結(jié)合特征。在這些突變中，238、265、269、270、327或329位氨基酸的突變可降低突變體與FCRI的結(jié)合活性，238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439位氨基酸的突變可降低突變體與FCRII的結(jié)合活性，以及238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437位氨基酸的突變可降低突變體與FCRIII的結(jié)合活性。
美國專利號5,624,821報道，本文已完整納入作為參考，小鼠抗體的CIq結(jié)合活性可通過突變重鏈的氨基酸殘基318、320或322來改變，取代殘基297(Asn)可導(dǎo)致溶解活性消失。
美國專利申請出版號20040132101，本文已納入作為參考，描述了在240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328或332位(根據(jù)Kabat編號)，或者234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332位(根據(jù)Kabat編號)包含突變的突變體，234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332位的突變可降低抗體的ADCC活性或降低抗體與Fcγ受體結(jié)合的能力。
Chappel等，Proc Natl Acad Sci U S A.1991；88(20)9036-40報道，本文已完整納入作為參考，IgG1的嗜細胞活性是其重鏈CH2區(qū)的內(nèi)在特性。IgG1的234-237位氨基酸中任一氨基酸的單點突變都可以明顯降低甚至消除其活性。將IgG1殘基234-237(LLGG)都取代成IgG2和IgG4是恢復(fù)完整結(jié)合活性所必須的。實驗證明包含完整ELLGGP序列(殘基233-238)的IgG2抗體比野生型IgG1的活性更高。
Isaacs等，J Immunol.1998；161(8)3862-9報道，F(xiàn)cγR結(jié)合關(guān)鍵基序內(nèi)的突變(谷氨酰胺233突變成脯氨酸，亮氨酸/苯丙氨酸234突變成纈氨酸，亮氨酸235突變成丙氨酸)可完全阻斷靶細胞的殺傷。谷氨酰胺318突變成丙氨酸可消除小鼠IgG2b的效應(yīng)功能，也能降低人IgG4的活性。
Armour等，Mol Immunol.2003；40(9)585-93，本文已完整納入作為參考，鑒定了IgG1突變體，該突變體與活化受體FcγRIIa反應(yīng)的活性比野生型IgG1至少低10倍，但是與抑制性受體FcγRIIb結(jié)合的能力只下降4倍。突變還發(fā)生在氨基酸233-236區(qū)和/或327、330和331位氨基酸上。也可參見WO 99/58572，本文已完整納入作為參考。
Xu等，J Biol Chem.1994；269(5)3469-74報道，本文已完整納入作為參考，將IgG1 Pro331突變成絲氨酸可顯著降低C1q結(jié)合活性，并且能基本消除抗體的溶解活性。相反，用Pro取代IgG4的Ser331只能將部分溶解活性(40％)賦予IgG4 Pro331突變體。
Schuurman等，Mol Immunol.2001；38(1)1-8報道，本文已完整納入作為參考，將參與重鏈內(nèi)鍵形成的一個鉸鏈區(qū)半胱氨酸Cys226突變成絲氨酸可使重鏈內(nèi)的連接更穩(wěn)定。將IgG4鉸鏈區(qū)序列Cys-Pro-Ser-Cys突變成IgG1鉸鏈區(qū)序列Cys-Pro-Pro-Cys也能夠明顯穩(wěn)定重鏈之間的共價連接。
Angal等，Mol Immunol.1993；30(1)105-8報道，本文已完整納入作為參考，與原始的嵌合IgG4相比，將IgG4內(nèi)241位的絲氨酸突變成脯氨酸(在IgG1和IgG2的相應(yīng)位置上是脯氨酸)可導(dǎo)致勻質(zhì)抗體產(chǎn)生、血清半衰期延長以及組織分布得以改善。
本發(fā)明還涉及因糖鏈結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致效應(yīng)活性發(fā)生改變的抗體分子的制備，其中包括缺少巖藻糖基化或巖藻糖基化程度降低的抗體分子，這種抗體分子的ADCC活性升高。本領(lǐng)域的多種方法都可以實現(xiàn)這一目的。例如，ADCC效應(yīng)活性是由抗體分子與FcγRIII受體的結(jié)合介導(dǎo)的，研究發(fā)現(xiàn)其結(jié)合依賴于CH2區(qū)Asn-297位置上N連接糖基化的糖鏈結(jié)構(gòu)。非巖藻糖基化的抗體與這個受體的結(jié)合親和力提高，比天然的巖藻糖基化抗體相比能更有效地激發(fā)FcγRIII-介導(dǎo)的效應(yīng)功能。例如，利用重組方法在α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶被敲除的CHO細胞內(nèi)制備非巖藻糖基化的抗體可得到ADCC活性升高100倍的抗體[Yamane-Ohnuki等，Biotechnol Bioeng.2004 Sep 5；87(5)614-22]。通過降低巖藻糖基化通路的這個酶或其他酶的活性也可以達到同樣的效應(yīng)，例如，通過siRNA或反義RNA處理、改造細胞系以敲除酶、或者用特異性糖基化抑制性培養(yǎng)[Rothman等，Mol Immunol.1989 Dec；26(12)1113-23]。某些宿主細胞系如Lec13或大鼠雜交瘤細胞系YB2/0可天然地產(chǎn)生低巖藻糖基化水平的抗體。Shields等，J Biol Chem.2002 Jul 26；277(30)26733-40；Shinkawa等，J Biol Chem.2003 Jan 31；278(5)3466-73。試驗證明，提高雙叉糖鏈的水平，例如，通過在過量表達GnTIII酶的細胞內(nèi)重組制備抗體，也能夠提高抗體的ADCC活性。Umana等，Nat Biotechnol.1999 Feb；17(2)176-80。據(jù)預(yù)測，兩個巖藻糖殘基中僅僅缺少一個就足以提高抗體的ADCC活性。Ferrara等，J Biol Chem.2005-12-5；[印刷前的電子出版物] 其他共價修飾 抗體的共價修飾也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如果適用的話，共價修飾可通過化學(xué)合成或通過抗體的酶催化或化學(xué)裂解實現(xiàn)?？贵w其他類型的共價修飾可通過抗體的靶氨基酸殘基與能和特定側(cè)鏈或N端或C端殘基發(fā)生反應(yīng)的有機衍生試劑發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)入到分子內(nèi)。
最常見的是半胱氨酸殘基與α-鹵素乙酸鹽(及相應(yīng)的胺)如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)形成羧甲基或羧胺甲基衍生物。半胱氨酸殘基也可以通過與溴代三氟乙酸、α-溴-β-(5-咪唑)丙酸、磷酸氯乙酰、3-氮-2-吡啶二硫化物、甲基-2-吡啶二硫化物、p-氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑反應(yīng)來生成。
組氨酰殘基可通過與焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0的條件下反應(yīng)來衍生，因為這個試劑對組氨酰側(cè)鏈有相對的特異性。對溴苯酰甲基溴也可以適用；反應(yīng)優(yōu)選在pH6.0的0.1M二甲胂酸鈉中進行。
賴氨酰殘基和氨基端殘基可與琥珀酸酐或其他羧酸酸酐反應(yīng)。利用這些試劑進行衍生可對賴氨酰殘基的電荷產(chǎn)生反向效應(yīng)。適于衍生含α氨基殘基的試劑包括亞氨酸酯類如吡啶甲酸亞胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、氫硼化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2，4-戊二酮和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
精氨酰殘基可通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)來修飾，其中包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生需要在堿性條件下進行反應(yīng)，因為胍功能基團具有較高的pKa。另外，這些試劑可與賴氨酸的基團以及精氨酸ε-氨基反應(yīng)。
為了特定的目的可以對酪氨酰殘基進行特殊修飾，例如，為了將光譜標簽導(dǎo)入到酪氨酰殘基內(nèi)，可以和芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)。最常見的是N-乙酰咪唑(N-acetylimidizole)和四硝基甲烷用于分別形成O-乙酰酪氨酰殘基和3-硝基衍生物。酪氨酰殘基用125I或131I碘化后形成標記蛋白，可用于放免分析。
羧基側(cè)鏈基團(天冬氨?；蚬劝滨；?可通過與碳二亞胺類(R-N＝C＝N-R′)反應(yīng)進行特異性的修飾，其中R和R’是不同的烷基，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基苯基)碳二亞胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰殘基可通過與銨離子反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成天冬酰胺和谷氨酰胺殘基。
谷氨酰胺和天冬酰胺殘基常常會脫去酰胺基分別形成相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。這些殘基在中性或堿性條件下脫去酰胺基。這些殘基的脫酰胺基形式也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化、絲氨酰和蘇氨酰殘基羥基的磷酸化、賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α氨基的甲基化(T.E.Creighton，《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性》(ProteinsStructure and Molecular Properties)，洛杉磯WHF公司(W.H.Freeman & Co.，San Francisco)，79-86頁(1983))、N端氨基的乙?；约叭我籆端羧基的酰胺化。
另一類共價修飾包括在抗體上化學(xué)或酶催化偶聯(lián)糖苷。這些方法的優(yōu)點在于不需要在具有N-或O-糖基化能力的宿主細胞內(nèi)制備抗體。根據(jù)所使用的偶聯(lián)模式，糖可被連接到(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基如半胱氨酸的那些巰基，(d)游離羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的那些游離羥基，或者(f)谷氨酰胺的氨基上。這些方法可見于1987年11月11日公開的WO87/05330以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，59-306頁(1981)的描述。
利用化學(xué)方法或酶催化方法可以去除抗體上所有的糖鏈基序?；瘜W(xué)去糖基化需要將抗體暴露于三氟甲烷磺酸或其等價化合物中。這種處理可將除連接糖基(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或所有糖基裂解，但是依然能保持抗體的完整性?；瘜W(xué)去糖基化的方法可見于Hakimuddin，等，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118131(1981)的描述。酶催化裂解抗體上的糖鏈基序可通過使用各種內(nèi)源性和外源性糖苷酶來實現(xiàn)，如Thotakura等，Meth.Enzymol.138350(1987)所述。
抗體的另一類共價修飾包括將抗體連接到各種非蛋白聚合物上，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基多元醇、聚氧乙基山梨醇、聚氧乙基葡萄糖、聚氧乙基甘油、聚氧乙烯或多糖聚合物如葡聚糖。這種方法是本領(lǐng)域熟知的，參見，例如，美國申請?zhí)?,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337；4,766,106；4,179,337；4,495,285；4,609,546或EP 315 456。
每一個抗體分子可以連接一個或多個(即，1、2、3、4、5或更多)聚合物分子。聚合物分子優(yōu)選通過連接子連接到抗體上。一般而言，聚合物可以是合成的或天然的聚合物，例如，任選取代直鏈或支鏈聚烯烴、聚氧烷烯聚合物、支鏈或非支鏈多糖，如同多糖和雜多糖。優(yōu)選的聚合物是聚氧乙基多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫下是水溶性的，通用化學(xué)式為R(O-CH2-CH2)n O-R，其中R是氫或保護性基團，如烷基或鏈烯醇基。優(yōu)選的是，保護性基團含有1到8個碳原子，更優(yōu)選的是甲基。符號n是正整數(shù)，優(yōu)選1到1000，更優(yōu)選2到500。優(yōu)選的PEG是平均分子量為1000到40000的PEG，更優(yōu)選的是2000到20000，最優(yōu)選的是3000到12000。優(yōu)選的是，PEG至少包含一個羥基，更優(yōu)選的是包含末端羥基。這個羥基優(yōu)選通過與抑制劑上的游離氨基反應(yīng)而活化。但是，應(yīng)當理解的是，活潑基團的類型和數(shù)量是可以變化的，只要能使PEG和本發(fā)明的抗體共價連接就可以。優(yōu)選的聚合物以及將其連接到肽上的方法可見于美國申請?zhí)?,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546，本文都已完整納入作為參考。
基因治療 治療性抗體向合適細胞的轉(zhuǎn)移可以通過使用本領(lǐng)域熟知的任何合適方法進行體外、原位或體內(nèi)基因治療來加以改變，其中包括通過使用DNA物理轉(zhuǎn)移方法(例如，脂質(zhì)體或化學(xué)處理)、或者通過使用病毒載體(例如，腺病毒、腺相關(guān)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)。例如，當進行體內(nèi)治療時，可將編碼目的抗體的核酸單獨或者與載體、脂質(zhì)體或沉淀物一起注射到患者體內(nèi)，在某些實施方式中，可以注射到需要抗體化合物在其中表達的部位。對于體外處理來說，取出患者的細胞，將核酸導(dǎo)入到這些細胞內(nèi)，然后將修飾過的細胞直接或者用多孔膜包裹后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，其中包裹細胞的多孔膜可植入到患者體內(nèi)。參見，例如，美國申請?zhí)?,892,538和5,283,187。目前有許多技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入到活細胞內(nèi)。選擇何種方法要根據(jù)核酸是轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)的細胞內(nèi)還是轉(zhuǎn)移到目的宿主體內(nèi)的細胞內(nèi)而定。適于將核酸轉(zhuǎn)移到體外的哺乳動物細胞內(nèi)的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖和鈣磷酸鹽沉淀。體外轉(zhuǎn)移核酸的常用載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
其他體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(如腺病毒、單純皰疹I(lǐng)病毒或腺相關(guān)病毒)和脂質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染。任選是，核酸和轉(zhuǎn)染試劑與微粒相連。典型的轉(zhuǎn)染試劑包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、季銨雙親性DOTMA((二油酰氧基丙基)三甲基溴化銨(商品名為Lipofectin，GIBCO-BRL)(Felgner等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417；Malone等，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86 6077-6081)；含下垂三甲銨頭的親脂性谷氨酸二酯(Ito等，(1990)Biochem.Biophys.Acta 1023，124-132)；可代謝的親本脂質(zhì)如陽離子脂質(zhì)二-十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(dioctadecylamidoglycylspermine)(DOGS，Transfectam，Promega)和二-棕櫚酰磷脂酰乙醇胺基精胺(dipalmitoylphosphatidyl ethanolamylspermine)(DPPES)(J.P.Behr(1986)Tetrahedron Lett.27，5861-5864；J.P.Behr等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6982-6986)；可代謝的季銨鹽(DOTB，N-[1-(2，3-二油酰基氧)丙基]-N，N，N-三甲氨甲基硫酸(DOTAP)(Boehringer Mannheim)、聚乙烯亞胺(PEI)、二油酰酯類、ChoTB、ChoSC、DOSC)(Leventis等，(1990)Biochim.Inter.22，235-241)；3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰]膽固醇(DC-Chol)，二油?；字Ｒ掖及?DOPE)/3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰]膽固醇1∶1的混合物(Gao等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065，8-14)，精胺、精脒、脂多胺(Behr等，Bioconjugate Chem，1994，5382-389)，親脂性的聚賴氨酸(LPLL)(Zhou等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，帶額外磷脂酰膽堿/膽固醇的[[(1，1，3，3-四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基芐基銨氫氧化物([[(1，1，3，3-tetramethylbutyl)cre-soxy]ethoxy]ethyl]dimethylbenzylammoniumhydroxide(DEBDA氫氧化物)(Ballas等，(1988)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，溴化十六烷基三甲銨(CTAB)/DOPE混合物(Pinnaduwage等，(1989)Biochim.Biophys.Acta 985，33-37)，谷氨酸(TMAG)與DOPE、CTAB、DEBDA、二-十二烷基溴化銨(DDAB)形成的親脂性二酯，乙基硬脂胺與磷脂酰乙醇胺形成的混合物(Rose等，(1991)Biotechnique 10，520-525)，DDAB/DOPE(TransfectACE，BRL)，以及帶寡半乳糖的脂質(zhì)。可提高轉(zhuǎn)染效率的典型轉(zhuǎn)染增強試劑包括，例如，DEAE-葡聚糖、聚凝胺、溶酶體破裂肽(OhmoriNI等，Biochem Biophys Res Commun 1997/6/27；235(3)726-9)、軟骨素(chondroitan)基蛋白聚糖、硫酸化的蛋白聚糖、聚乙烯亞胺、多聚賴氨酸(PollardH等，J Biol Chem，1998 273(13)7507-11)、整合素結(jié)合肽CYGGRGDTP、線性葡聚糖九糖、甘油、系于寡核苷酸3’端內(nèi)部核苷連接上的膽固醇基(Letsinger，R.L.1989 Proc Natl Acad Sci USA 86(17)6553-6)、溶血磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺和1-油?；苎字Ｄ憠A。
在某些情況下，比較理想的是用直接將含核酸載體轉(zhuǎn)移給靶細胞的試劑轉(zhuǎn)移核酸。這種“靶向”分子包括靶細胞表面膜蛋白特異性抗體或靶細胞受體的配基。如果使用脂質(zhì)體，可與胞吞作用相關(guān)的細胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白可用于靶向到細胞和/或促進攝取。這種蛋白的例子包括特定細胞類型向性的殼蛋白及其片段、在循環(huán)中經(jīng)歷內(nèi)化的蛋白的抗體、以及用于胞內(nèi)定位和提高胞內(nèi)半衰期的蛋白。在其他實施方式中，可以利用受體介導(dǎo)的胞吞作用。這種方法可見于，例如，Wu等，1987或Wagner等，1990的描述。有關(guān)目前已知的基因標記和基因治療方法的綜述可參見Anderson 1992。也可參見WO 93/25673及其引用的參考文獻。有關(guān)基因治療技術(shù)的其他綜述可參見Friedmann，Science，2441275-1281(1989)；Anderson，Nature，392卷的增刊，6679，25-30頁(1998)；Verma，Scientific American68-84(1990)；以及Miller，Nature，357455-460(1992)。
篩選方法 本發(fā)明的另一方面涉及鑒定能夠調(diào)節(jié)(即，降低)PRLR活性的抗體的方法，該方法包括使PRLR與抗體接觸，確定抗體是否能夠調(diào)節(jié)PRLR的活性。比較存在被測抗體時的活性與不存在被測抗體時的活性。如果包含被測抗體的樣品的活性比不含被測抗體的樣品的活性低則說明抗體具有抑制活性。有效治療藥物依賴于鑒定出缺乏明顯毒性的有效治療劑?？衫帽绢I(lǐng)域熟知的方法根據(jù)結(jié)合活性來篩選抗體。例如，凝膠移動分析、蛋白質(zhì)印跡、放射性標記的競爭分析、利用色譜共分餾、共沉淀、交聯(lián)、ELISA、表面等離振子共振(例如，

)、時間分辨熒光術(shù)(例如，DELFIA)等都可以使用，這些方法見于，例如，《當代分子生物學(xué)手冊》(Current Protocols in Molecular Biology)(1999)、《當代免疫學(xué)手冊》(Current Protocols in Immunology)(2007)，紐約約翰威利父子公司(John Wiley & Sons，NY)，本文都已完整納入作為參考。另外，表面等離振子共振(例如，

)可用于評價兩個抗體之間的競爭(參見，例如，下面的實施例7)。時間分辨熒光術(shù)(例如，DELFIA)也可用于評價兩個抗體之間的競爭水平。例如，根據(jù)廠家提供的方法可進行以微孔板為基礎(chǔ)的競爭篩選

分析(PE公司(Perkin Elmer))。
為了初步篩選能與靶抗原上目的表位結(jié)合的抗體，可進行常規(guī)的交叉封閉試驗，如《抗體，實驗室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社，Harlow和David Lane編輯(1988)所描述的。也可以采用常規(guī)的競爭結(jié)合試驗，其中根據(jù)未知抗體抑制靶抗原與本發(fā)明的靶抗原特異性抗體結(jié)合的能力來確定未知抗體的特征。完整抗體、其片段如胞外域或者線性表位也可以使用。表位繪圖方法可參見Champe等，J.Biol.Chem.2701388-1394(1995)的描述。
在體外結(jié)合試驗的一個變體中，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括步驟(a)使固定的PRLR與候選抗體接觸以及(b)檢測候選抗體與PRLR的結(jié)合。在另一個實施方式中，候選抗體被固定，并檢測PRLR的結(jié)合。固定可利用本領(lǐng)域熟知的方法完成，其中包括共價結(jié)合到支持物、小珠或色譜樹脂上，以及非共價高親和力的相互作用如抗體結(jié)合，或者使用鏈親和素/生物素結(jié)合，其中被固定的化合物包含生物素基序。結(jié)合的檢測可通過如下方法完成(i)利用未固定的化合物上的放射性標記物，(ii)利用非固定化合物上的熒光標記物，(iii)利用非固定化合物免疫特異性抗體，(iv)利用未固定的能激發(fā)熒光素支持物的化合物上的標記物，其中固定的化合物被連接在熒光素支持物上，以及本領(lǐng)域熟知的和常規(guī)使用的其他技術(shù)。
能調(diào)節(jié)(即增強、降低或阻斷)靶抗原活性的抗體可通過如下方法鑒定使候選抗體與靶抗原(或表達靶抗原的細胞)共孵育，確定候選抗體對靶抗原的活性或表達水平的影響。比較存在被測抗體時的活性與不存在被測抗體時的活性。如果包含被測抗體的樣品的活性比不含被測抗體的樣品的活性低則說明抗體具有抑制活性。調(diào)節(jié)靶抗原多肽或多聚核苷酸活性的抗體的特異性可通過比較其對靶抗原的效應(yīng)與對其他相關(guān)化合物的效應(yīng)來評價。
在特殊的典型實施方式中，本發(fā)明涉及通過測定抗體在培養(yǎng)的細胞系統(tǒng)中的效應(yīng)來確定其抑制PRLR二聚化和/或中和PRLR的能力，其中PRLR的二聚化和/或中和PRLR可誘導(dǎo)STAT5和/或MAPK和/或AKT磷酸化或PRLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其他指示分子。另外，細胞試驗包括本文所述的增殖試驗、軟瓊脂試驗和/或細胞毒試驗可用于評價特定的PRLR抗體。
特定抗體或抗體組合的生物學(xué)活性可利用合適的動物模型通過體內(nèi)試驗來評價。例如，可以利用異種移植癌癥模型，其中人癌細胞被輸入到免疫妥協(xié)動物如裸鼠或SCID小鼠體內(nèi)。通過測定腫瘤形成、腫瘤消褪或轉(zhuǎn)移等被抑制的水平來預(yù)測療效。
本發(fā)明還涉及高通量篩選(HTS)試驗，用于鑒定能與靶抗原相互作用的抗體或者能抑制靶抗原生物學(xué)活性(即，抑制酶催化活性、結(jié)合活性、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等)的抗體。HTS試驗?zāi)芤砸环N高效的方式篩選大量化合物。本發(fā)明包括利用以細胞為基礎(chǔ)的HTS系統(tǒng)研究靶抗原與其結(jié)合伙伴之間的相互作用。設(shè)計出的HTS試驗可用于鑒定具有理想特性的“采樣化合物”或“先導(dǎo)化合物”，可以對這些化合物進行修飾以改善其理想特性。
在本發(fā)明的另一實施方式中，利用了高通量的篩選方法來篩選與靶抗原多肽具有合適結(jié)合親和力的抗體片段或CDR內(nèi)有1、2、3或更多氨基酸修飾的CDR。
組合治療 目前已經(jīng)鑒定出了多個在動物模型中有效的抗體，但是如果將兩種或多種這類抗體混合在一起(結(jié)合相同的或不同的靶抗原)就可能提供更好的療效?？梢詫环N或多種抗體的組合物給予患有癌癥或者易患癌癥的人或哺乳動物。同時給予兩種治療劑并不是說要在一個時間點同時給藥，只要兩種藥物發(fā)揮其療效的時間段有重合就可以。也可以同時或先后給藥，例如隔不同的天數(shù)或不同的周數(shù)給藥。
雖然抗體治療適用于所有階段的癌癥，但是抗體治療特別適于晚期癌癥或轉(zhuǎn)移癌。還未進行過化療的患者優(yōu)選采用抗體療法和化療或放療的組合療法，那些接受過一次或多次化療的患者也適于抗體治療。另外，抗體治療也能減少同時使用的化療的給藥劑量，特別是對于那些無法良好耐受化療藥物的毒性的患者來說。
本發(fā)明的方法包括給予單一抗體以及給予不同抗體的組合或“雞尾酒”。這種抗體混合物具有某些優(yōu)勢，因為抗體混合物包含能發(fā)揮不同效應(yīng)機制的抗體，或者是細胞毒抗體與依賴免疫效應(yīng)功能的抗體的直接組合。組合物中的這種抗體具有協(xié)同療效。例如，本發(fā)明的方法包括給予M-CSF、RANKL、TaxotereTM、HerceptinTM、AvastinTM、ErbituxTM或抗-EGFR抗體以及他莫昔芬的抗體。
細胞毒藥物是指能抑制或阻斷細胞功能和/或?qū)е录毎茐牡奈镔|(zhì)。該術(shù)語包放射性同位素(例如，I131、I125、Y90和Re186)、化療藥物和毒素如細菌、真菌、植物和動物來源的酶催化活化毒素或者合成毒素或其片段。非細胞毒劑是指不會抑制或阻斷細胞功能和/或?qū)е录毎茐牡奈镔|(zhì)。非細胞毒劑包括經(jīng)過活化后變成細胞毒性的試劑。非細胞毒劑包括小珠、脂質(zhì)體、基質(zhì)或顆粒(參見，例如，美國專利出版號2003/0028071和2003/0032995，本文已納入作為參考)。這種試劑可與本發(fā)明的抗體綴合、偶聯(lián)、結(jié)合或相連。
癌癥化療藥物包括而不限于烷化劑如卡鉑和順鉑；氮芥類烷化劑；亞硝脲類烷化劑如卡莫司汀(BCNU)；抗代謝藥如甲氨蝶呤；亞葉酸；嘌呤類似物抗代謝藥如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他濱(

)；激素類抗腫瘤藥如戈舍瑞林、亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗腫瘤藥如阿地白介素、IL-2、多西紫杉醇、依托泊甙(VP-16)、干擾素α、紫杉醇(

)和維甲酸(ATRA)；抗生素天然抗腫瘤藥如博來霉素、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、道諾霉素和絲裂霉素包括絲裂霉素C；以及長春花堿天然抗腫瘤藥如長春堿、長春新堿、長春地辛；羥基脲；醋葡醛內(nèi)酯、阿霉素、異環(huán)磷酰胺、依諾他濱、環(huán)硫雄醇、阿柔比星、安西他濱、尼莫司汀、鹽酸丙卡巴肼、卡巴醌、卡鉑、卡莫氟、色霉素A3、抗腫瘤多糖、抗腫瘤血小板因子、環(huán)磷酰胺(

)、施佐菲蘭、阿糖胞苷(胞嘧啶阿糖胞苷)、達卡巴嗪、硫代肌苷、塞替派、喃氟啶、多拉司他汀、多拉司他汀類似物如奧瑞斯他汀、CPT-11(伊立替康)、米托蒽醌、長春瑞濱、替尼泊苷、氨基蝶呤、洋紅霉素、埃斯波霉素(參見，例如，美國專利號4,675,187)、新制癌菌素、OK-432、博來霉素、氟鐵龍、溴甙、白消安、二磷酸己烯雌酚四鈉、培洛霉素、苯丁抑制素(

(烏苯美司))、干擾素β、美雄烷、二溴甘露醇、美法侖、層粘連蛋白肽、香菇多糖、采絨革蓋菌提取物、喃氟啶/尿嘧啶、雌氮芥(雌激素/氮芥)。
另外，可用于治療腫瘤患者的其他藥物包括EPO、G-CSF、更昔洛韋；抗生素、亮丙瑞林；哌替啶；齊多夫定(AZT)；白細胞介素1到18，其中包括突變體和類似物；干擾素或細胞因子，如干擾素α、β和γ；激素如促黃體激素釋放激素(LHRH)及其類似物和促性腺激素釋放激素(GnRH)；生長激素如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、生長激素釋放因子(GHRF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子同源因子(FGFHF)、肝細胞生長因子(HGF)和胰島素生長因子(IGF)；腫瘤壞死因子α和β(TNF-α和β)；侵入抑制因子-2(IIF-2)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白1-7(BMP1-7)；生長抑素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；EGFR(表皮生長因子受體)拮抗劑如西妥昔單抗和吉非替尼；PR(孕激素受體)拮抗劑和調(diào)節(jié)劑如米非司酮和OnapristoneTM；芳香酶(aromatoase)抑制劑如阿那曲唑、依西美坦和來曲唑；抗雌激素藥物、雌激素受體拮抗劑和調(diào)節(jié)劑如他莫昔芬、托瑞米芬和氟維司群；補體因子；抗血管生成因子；抗原性物質(zhì)；以及前藥。
前藥是指具有藥理活性的物質(zhì)的前體或衍生物，與親本藥物相比前藥對腫瘤細胞的毒性較低或者無毒性，但是能夠被催化活化或者轉(zhuǎn)化成有活性的或者比親本藥物活性更高的形式。參見，例如，Wilman，“癌癥化療的前藥”(″Prodrugsin Cancer Chemotherapy″)Biochemical Society Transactions，14，375-382頁，615屆貝爾法斯特會議(1986)和Stella等，“前藥靶向性藥物轉(zhuǎn)移的化學(xué)方法”(″ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，″)，《定向藥物轉(zhuǎn)移》(Directed Drug Delivery)，Borchardt等，(編輯)，247-267頁，HumanaPress(1985)。前藥包括而不限于包含磷酸鹽的前藥、包含硫代硫酸鹽的前藥、包含硫酸鹽的前藥、包含肽的前藥、D氨基酸修飾的前藥、糖基化的前藥、包含β-內(nèi)酰胺的前藥、包含任選取代苯氧乙酰胺的前藥或包含任選取代苯乙酰胺的前藥、可轉(zhuǎn)化為細胞毒活性更高的游離藥物的5-氟胞嘧啶和其他5-尿嘧啶前藥?？捎糜诒景l(fā)明的可轉(zhuǎn)化成前藥形式的細胞毒藥物的例子包括而不限于上述化療藥物。
給藥及制備 本發(fā)明的抗體可制成包含適用于理想給藥方法的載體的藥物組合物。合適的載體包括與抗體組合時能保持抗體的理想活性并且不與患者免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)的任何材料。載體的例子包括而不限于標準藥學(xué)上可接受的載體中的任何一種，如無菌磷酸緩沖鹽溶液、抑菌水等。各種水性載體也可以使用，例如，水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等，還包括可增強穩(wěn)定性的其他蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等，這些物質(zhì)可對制劑產(chǎn)生溫和的化學(xué)修飾效應(yīng)等。
抗體的治療性制劑可通過使具有理想純度的抗體與任選生理性載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合而制備以便于儲存(《雷明頓藥學(xué)》(Remington′s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編輯，(1980))，制劑可以是凍干制劑或水溶液。合適的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在應(yīng)用劑量和濃度下對受者是無毒的，其中包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；包含維生素C和甲硫氨酸的抗氧化劑；防腐劑(如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯己雙銨；苯扎氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥苯甲酸如甲基或丙基對羥苯甲酸；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；以及m-甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)的多糖；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和其他糖類如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗平衡離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文的制劑還包含特定治療用途所必須的多個活性化合物，尤其是具有補充活性并且互相之間沒有反作用的那些化合物。這些分子適于以能達到預(yù)定目的的有效量組合存在。
活性組分還可以包裹在微囊中，例如，通過凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微囊，如膠體藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米微囊)或粗滴乳狀液中分別存在的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基甲酰胺微囊。這種技術(shù)在《雷明頓藥學(xué)》第16版，Osol，A編輯，(1980)中有描述。
可用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。通過無菌濾膜過濾可以很容易實現(xiàn)這一點。
抗體可以合適的方式給藥，其中包括胃腸外途徑、皮下注射、腹膜內(nèi)注射、肺內(nèi)給藥和鼻內(nèi)給藥，如果需要局部治療也可以采用損傷部位內(nèi)給藥。胃腸外輸注包括靜脈注射、動脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉注射、真皮內(nèi)注射或皮下注射。另外，抗體也適于通過脈沖輸注方式給藥，尤其是抗體給藥劑量不斷下降時。優(yōu)選通過注射給藥，最優(yōu)選的是通過靜脈或皮下注射給藥。本發(fā)明也包括其他給藥方法，如局部給藥，特別是透皮給藥、透粘膜給藥、直腸給藥、口服或局部給藥，例如，通過靠近目的部位的導(dǎo)管。
對于鼻腔粘膜給藥來說，藥學(xué)上可接受的制劑和藥物可以是噴霧劑或氣溶膠，其中包含合適的溶劑和任選其他化合物，例如但不限于穩(wěn)定劑、抗菌劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)節(jié)劑以及上述物質(zhì)的組合。氣溶膠制劑推進劑包括壓縮空氣、氮氣、二氧化碳或以烴類物質(zhì)為基礎(chǔ)的低沸點溶劑。
可注射的制劑一般包括水性懸液或油性懸液，這些溶液可利用合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑制備。可注射的制劑可位于溶液相中，或者以懸液的形式，用溶劑或稀釋劑制備。藥學(xué)上可接受的溶劑或載體包括無菌水、林格液或等滲的鹽水溶液。
如果用于注射，藥學(xué)上可接受的制劑和/或藥物可以是適于用上述合適的溶液重組成的粉末。其中包括而不限于冷凍干燥的、旋轉(zhuǎn)干燥的或噴霧干燥的粉末、無定形粉末、顆粒、沉淀物或微粒。用于注射時制劑任選可包含穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)劑劑以及上述物質(zhì)的混合。
也可以制備緩釋制劑。合適的緩釋制劑的例子包括包含抗體的固相疏水聚合物的半透性基質(zhì)，這種基質(zhì)可以具有固定的形狀，例如，膜或微囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯類、水凝膠類(例如，聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚乳酸(美國專利號3,773,919)、L谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸的共聚物、不能降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-羥乙酸可以使分子的釋放時間達到100天以上，但是某些水凝膠維持蛋白釋放的時間卻較短。當包裹的抗體在體內(nèi)存在較長時間時，抗體會因長期暴露于37℃濕潤環(huán)境中而變性或凝集，結(jié)果導(dǎo)致生物學(xué)活性喪失，免疫原性可能會改變?？梢愿鶕?jù)參與的機制來設(shè)計合理的策略以使抗體穩(wěn)定。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝集是由硫-二硫化物交換而形成的分子間二硫鍵導(dǎo)致的，那么就可以通過修飾巰基殘基、在酸溶液中冷凍干燥、控制含濕量、使用合適的添加物以及開發(fā)特異性的聚合物基質(zhì)組合物來達到穩(wěn)定的目的。本領(lǐng)域熟知的其他策略也可以使用。
本發(fā)明的制劑可以是短效的、速釋的、長效的或緩釋的，如本文所述。藥學(xué)上可接受的制劑也可以制備成控釋或緩釋的形式。
即釋組合物還可包含，例如，微粒或脂質(zhì)體或某些其他包裹形式，或者以緩釋形式給藥以延長保存時間和/或轉(zhuǎn)移效應(yīng)。因此，藥學(xué)上可接受的制劑和藥物可壓縮成片劑或圓柱形，作為倉儲式注射劑或植入物如支架植入肌肉內(nèi)或皮下。這種植入物可利用已知的惰性材料如聚硅酮和生物可降解聚合物。
除了上述那些典型制劑形式以外，藥學(xué)上可接受的賦形劑和載體也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，也可以包含在本發(fā)明中。這種賦形劑和載體描述于，例如，《雷明頓藥學(xué)》第16版，Osol，A.編輯，(1980)中，本文已納入作為參考。
根據(jù)患者的疾病狀況、年齡、體重、一般健康狀況、基因型、性別和飲食、給藥間隔時間、給藥途徑、排泄率以及合并用藥來調(diào)節(jié)特殊劑量。上述包含有效量的所有劑型都在常規(guī)試驗的范圍內(nèi)，因此也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的抗體制劑可基本不含其他天然免疫球蛋白或其他生物分子。優(yōu)選的抗體在給予腫瘤患者或者易患腫瘤的患者時毒性很小。
本發(fā)明的組合物可通過常規(guī)的已知滅菌技術(shù)除菌。得到的溶液包裝起來直接使用，或者在無菌狀態(tài)下過濾并凍干，在給藥前用無菌溶液溶解凍干制劑。組合物可包含接近生理調(diào)節(jié)所必須的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑等，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和穩(wěn)定劑(例如120％麥芽糖等)。
本發(fā)明的抗體可通過脂質(zhì)體給藥，脂質(zhì)體是由各種脂質(zhì)和/或磷脂和/或表面活性劑組成的小載體，可用于轉(zhuǎn)移藥物(例如，本文所述的抗體，和任選化療藥物)。脂質(zhì)體包括乳化劑、泡沫、微粒、不溶性的單層、磷脂分散液、板狀層等，可以作為載體將抗體靶向到特定組織以及提高組合物的半衰期。許多方法都可用于制備脂質(zhì)體，如美國申請?zhí)?,837,028和5,019,369所述，本文已納入作為參考。
包含抗體的脂質(zhì)體可用本領(lǐng)域已知的方法制備，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 774030(1980)以及美國申請?zhí)?,485,045和4,544,545所描述的。循環(huán)時間延長的脂質(zhì)體在美國專利號5,013,556中有描述。特別適用的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)法制備。通過確定孔徑的濾膜擠出可得到具有理想直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可通過二硫交換反應(yīng)連接到脂質(zhì)體上，如Martin等，J.Biol.Chem.257286-288(1982)所述。任選是，化療藥物(如多柔比星)也可以包裹到脂質(zhì)體內(nèi)[參見，例如，Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)]。
這些組合物中的抗體濃度范圍可以很寬，即，重量百分比從低于約10％，通常是至少約25％，到高達75％或90％，使用何種濃度主要根據(jù)液體體積、粘度等以及所選擇的特定給藥模式來確定。制備可通過口服、局部給藥和胃腸外途徑給藥的組合物的實際制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，詳細描述參見《雷明頓藥學(xué)》第19版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)，本文已納入作為參考。
通過本領(lǐng)域熟知的標準經(jīng)驗方法可以確定治療患者疾病所需的本發(fā)明組合物的有效量。
本發(fā)明的組合物可以足以阻止或至少部分抑制疾病進展的劑量給予已患或易患或有可能患，例如，乳腺癌、前列腺癌或肺癌的哺乳動物。足以達到此目的的劑量被定義為“治療有效量”?？贵w的有效量可根據(jù)疾病的嚴重程度以及被治療患者的體重和一般狀況而作出調(diào)整，但是一般在每公斤體重約1.0μg到100mg之間。典型的劑量范圍為每次給予約10μg/kg到約30mg/kg、或約0.1mg/kg到約20mg/kg或約1mg/kg到約10mg/kg。還可以根據(jù)體表面積計算抗體的給藥劑量(例如，最高可達4.5g/m2)?？贵w的其他典型劑量包括單次給藥總劑量高達8g(假設(shè)體重為80kg或體表面積為1.8m2)。
可以通過本領(lǐng)域熟知的任何方式給藥。例如，抗體可以一個或多個分次給藥的方式給藥，或者通過在一段時間內(nèi)，例如，5、10、15、30、60、90、120分鐘或更長時間內(nèi)，短期或長期輸注給藥。經(jīng)過初始治療期后，根據(jù)患者的反應(yīng)及對治療的耐受情況，如果需要維持患者的反應(yīng)，可以給予維持劑量，例如，每周一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每兩月一次、每三月一次或每六月一次。最常用的治療方案是根據(jù)需要隨時調(diào)整給藥劑量，直到疾病癥狀的改善達到理想的效果。通過常規(guī)技術(shù)和試驗可以很容易地監(jiān)測治療的進程。治療可進行一個確定的時段，或者長期和持續(xù)進行數(shù)年，直到疾病惡化或者患者死亡。
可根據(jù)主治醫(yī)師所選擇的給藥劑量和給藥模式單次或多次給予組合物。當用于預(yù)防或治療疾病時，抗體的合適給藥劑量要根據(jù)如下因素確定如上所述的被治療的疾病類型、疾病的嚴重程度和進程、抗體給藥的目的是為了預(yù)防或治療、用藥史、患者的病史和對抗體的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷。抗體適于在一個時間點或者通過一系列治療來給予患者。
在任何情況下，一段時間內(nèi)制劑所提供的治療性抗體的量都應(yīng)該足以產(chǎn)生理想的生物學(xué)活性，例如，抑制癌癥或使癌癥的嚴重程度降到最低。本發(fā)明的組合物可單獨給藥，也可以作為輔助治療方法與本領(lǐng)域已知的用于治療這種疾病的其他治療方法一起使用。
抗體組合物應(yīng)按照GMP的標準制劑、給藥和管理。因此需要考慮的因素包括特定適應(yīng)癥、特定適用哺乳動物、各個患者的臨床狀況、病因、給藥部位、給藥方法、給藥方案、以及主治醫(yī)師所熟知的其他因素。要根據(jù)這些因素來確定抗體的治療有效量，并且應(yīng)該是預(yù)防、抑制或治療靶位介導(dǎo)的疾病所必須的最小劑量。這種劑量優(yōu)選低于會對宿主造成毒性或者使宿主對感染更敏感的劑量。
雖然不是必須的，但是抗體也可以和目前所用的預(yù)防或治療疾病的一種或多種藥物一起制成制劑。這種其他藥物的有效量要根據(jù)制劑中存在的抗體量、疾病或治療的類型、以及上面所討論的其他因素而定。這些藥物通常用于同一給藥劑量中，并通過上文所述的給藥途徑給藥，或者約占迄今為止所用劑量的1到99％。
在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了制品，其中包括用于治療適應(yīng)癥的材料。制品包含容器和標簽。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和試管。容器可用各種材料制造，如玻璃或塑料。容器內(nèi)包含的組合物可有效治療疾病，容器有一個無菌接口(例如，容器可以是靜脈注射袋或能被皮下注射針頭刺穿的塞子)。組合物中的活性成分是本發(fā)明的抗體。容器上或與容器相連的標簽說明了組合物可用于治療所選擇的疾病。制品還包含第二容器，其中含有第二治療性藥物(包括用于治療本文所討論的或本領(lǐng)域已知的疾病的任何第二治療性藥物)。制品還可以包含其他容器，其中含有藥學(xué)上可接受的緩沖液，如磷酸鹽緩沖液、林格式液或葡萄糖溶液，用于重組成凍干的抗體制劑。制品還可以包含其他材料，這些材料從生產(chǎn)商和用戶的觀點來看是必須的，其中包括其他緩沖液、稀釋劑、濾膜、針頭、注射器和包裝說明書。
免疫治療 可用于治療癌癥患者的抗體包括能起始有效抗腫瘤免疫反應(yīng)的那些抗體以及能直接產(chǎn)生細胞毒作用的那些抗體。與細胞毒藥物連接的抗體可用于將細胞毒藥物靶向到表達PRLR的腫瘤組織內(nèi)。另外，抗體可通過補體介導(dǎo)的或抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)機制誘導(dǎo)腫瘤細胞的溶解，兩種機制都需要與效應(yīng)細胞Fc受體位點或補體蛋白產(chǎn)生相互作用的免疫球蛋白分子完整的Fc部分。另外，對腫瘤生長有直接生物效應(yīng)的抗體也可用于實現(xiàn)分發(fā)明。這種細胞毒抗體發(fā)揮作用的潛在機制包括抑制細胞的生長、調(diào)控細胞的分化、調(diào)控腫瘤血管生成因子的表達模式、以及誘導(dǎo)凋亡。特定抗體產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的機制可通過確定ADCC、ADMMC、補體介導(dǎo)的細胞溶解等的體外試驗來分析，這是本領(lǐng)域所熟知的。
在一個實施方式中，免疫治療用結(jié)合PRLR并抑制LRLR活化的抗體進行。
抗PRLR抗體可以其“裸”抗體或未連接形式給藥，也可以直接連接到其他治療或診斷劑上，或者間接連接到包含這種其他治療或診斷劑的載體聚合物上。
抗體可用放射性同位素、親和力標記物(如生物素、鏈親和素等)、酶催化標記物(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、熒光素或化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光標記物(如FITC或羅丹明等)、順磁性原子等進行可檢測標記。完成這種標記的方法是本領(lǐng)域熟知的；例如，參見(Sternberger，L.A.等，J.Histochem.Cytochem.18315(1970)；Bayer，E.A.等，Meth.Enzym.62308(1979)；Engval，E.等，Immunol.109129(1972)；Goding，J.W.J.Immunol.Meth.13215(1976))。
抗體基序的連接可見于美國專利號6,306,393的描述。通用技術(shù)也可見于Shih等，Int.J.Cancer 41832-839(1988)；Shih等，Int.J.Cancer 461101-1106(1990)和Shih等，美國專利號5,057,313的描述。這種通用方法包括使包含氧化糖鏈部分的抗體組分與包含至少一個游離氨基并且攜帶有一群藥物、毒素、螯合劑、硼附加物或其他治療劑的載體聚合物反應(yīng)。這個反應(yīng)可產(chǎn)生初始希夫堿(亞胺)連接，通過還原成仲胺后得以穩(wěn)定并形成最后的偶聯(lián)物。
載體聚合物可以是，例如，氨基葡聚糖(aminodextran)或至少包含50個氨基酸殘基的多肽。用于將藥物或其他試劑連接到載體聚合物上的各種方法都是本領(lǐng)域所熟知的。多肽載體可用于取代氨基葡聚糖，但是多肽載體的多肽鏈應(yīng)該包含至少50個氨基酸殘基，優(yōu)選100-5000個氨基酸殘基。其中至少有一些氨基酸應(yīng)該是賴氨酸殘基或谷氨酰胺或天冬氨酸殘基。賴氨酸的下垂氨基以及谷氨酰胺和天冬氨酸的下垂羧基適于連接藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼附加物或其他治療劑。合適多肽載體的例子包括多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、上述氨基酸的共聚物以及這些氨基酸和能賦予加載載體和偶聯(lián)物理想溶解特性的其他氨基酸如絲氨酸的混合聚合物。
另外，結(jié)合抗體可通過將抗體組分與治療劑直接連接來制備。通用方法與間接連接方法相似，只是治療劑是直接連接到氧化抗體組分上。例如，抗體的糖鏈基序連接到聚乙二醇上以延長半衰期。
另外，治療劑可通過二硫鍵的形成或通過使用異源雙功能交聯(lián)子如N-琥珀酰-3(2-聯(lián)硫基吡啶)-丙酸鹽(SPDP)連接到還原抗體的鉸鏈區(qū)。Yu等，Int.J.Cancer56244(1994)。用于這種連接的通用技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，Wong，《蛋白質(zhì)結(jié)合和交聯(lián)化學(xué)》(Chemistry Of Protein Conjugation andCross-Linking)(CRC出版社(CRC Press)1991)；Upeslacis等，“化學(xué)方法修飾抗體”(″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″)，《單克隆抗體原理及應(yīng)用》(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Applications)，Birch等，(編輯)，187-230頁(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“合成肽來源的抗體的制備和特征”(″Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″)，《單克隆抗體制備、改造及臨床應(yīng)用》(Monoclonal AntibodiesProduction，Enineering and Clinical Application)，Ritter等，(編輯)，60-84頁(劍橋大學(xué)出版社(Cambridge University Press)1995)。各種雙功能蛋白偶聯(lián)劑都是本領(lǐng)域熟知的，如N-琥珀酰-3(2-聯(lián)硫基吡啶)-丙酸鹽(SPDP)、亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸脂肪酸二甲酯(dimethyl adipimidateHCL))、活性酯類(如辛二酸二琥珀酸亞胺)、醛類(如戊醛(glutareldehyde))、疊氮化合物(如雙(p-疊氮苯甲酰)己二胺)、二疊氮衍生物(如雙-(p-重氮基苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸鹽(如甲苯2，6-二異氰酸酯)以及雙活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
最后，可以構(gòu)建包含一種或多種抗PRLR抗體基序和另一多肽的融合蛋白。制備抗體融合蛋白的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，美國專利號6,306,393。包含IL-2基序的抗體融合蛋白在Boleti等，Ann.Oncol.6945(1995)，Nicolet等，Cancer Gene Ther.2161(1995)，Becker等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA937826(1996)，Hank等，Clin.Cancer Res.21951(1996)和Hu等，Cancer Res.564998(1996)中有描述。
在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體可用作放射增敏劑。在這種實施方式中，抗體與放射增敏劑相連。術(shù)語“放射增敏劑”在本文中是指一種分子，優(yōu)選低分子量的分子，當以治療有效量的劑量給予動物時可提高被放射增敏細胞對電磁輻射的敏感性和/或提高可用電磁輻射治療的疾病的療效?？捎秒姶泡椛渲委煹募膊“[瘤性疾病、良性和惡性腫瘤以及癌細胞。
本文所用的術(shù)語“電磁輻射”和“輻射”包括而不限于波長為10-20到100米的射線。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式利用電磁輻射γ輻射(10-20到10-13m)、X射線輻射(10-12到10-9m)、紫外光(10nm到400nm)、可見光(400nm到700nm)、紅外線輻射(700nm到1.0mm)以及微波輻射(1mm到30cm)。
已知放射增敏劑可提高癌細胞對電磁輻射毒性效應(yīng)的敏感性。目前許多癌癥治療方案都利用可被X射線電磁輻射活化的放射增敏劑。X射線活化的放射增敏劑的例子包括而不限于甲硝唑、醚醇硝唑、去甲基醚醇硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、硝唑嗎啉、絲裂霉素C、RSU1069、SR423、EO9、RB6145、尼克酰胺、5-溴脫氧尿苷(BUdR)、5-碘脫氧尿苷(IUdR)、溴脫氧胞苷、氟脫氧尿苷(FUdR)、羥基脲、順鉑以及上述物質(zhì)治療有效性的類似物及衍生物。
癌癥的光敏療法(PDT)利用可見光作為致敏劑的輻射活化劑。光促輻射增敏劑的例子包括而不限于血卟啉衍生物、光卟啉(r)、苯-卟啉衍生物、NPe6、錫本卟啉(SnET2)、脫鎂葉綠甲酯酸-a(pheoborbide-a)、細菌葉綠素-a、萘花青(naphthalocyanine)、酞菁、鋅酞菁以及上述物質(zhì)治療有效性的類似物和衍生物。
在另一實施方式中，抗體可與腫瘤預(yù)靶向治療所用的受體(如抗生物素蛋白鏈菌素)連接，其中抗體-受體偶聯(lián)物被給予患者，然后利用清除藥物從循環(huán)中清除未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予連接有細胞毒藥物(如放射性核素)的配基(如，卵蛋白)。
“標記物”是指與抗體直接或間接連接的可檢測化合物或組合物。標記物可以是本身就是可以被檢測的標記物(如，放射性同位素標記物或熒光素標記物)，或者酶催化標記物，可催化可檢測底物化合物或組合物發(fā)生化學(xué)改變。另外，標記物本身可能是不能被檢測的，但卻是被可檢測的另一種試劑結(jié)合的元素(例如，表位標簽或結(jié)合伙伴對中的一個，如生物素-卵白素等)。因此，抗體可包含有利于其分離的標記物或標簽，本發(fā)明的鑒定抗體的方法包括通過與標記物或標簽的相互作用分離抗體的方法。
典型的治療性免疫偶聯(lián)物包含連接有細胞毒劑如化療藥物、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源的酶催化活化毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性偶聯(lián)物)的本文所述的抗體。融合蛋白將在下文作進一步描述。
放射性金屬或磁共振增強劑的螯合劑是本領(lǐng)域熟知的。比較典型的有乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的衍生物。這些螯合劑一般在側(cè)鏈上都含有基團，螯合劑通過這些基團連接到載體上。這些基團包括，例如，異硫氰酸芐酯，DTPA或EDTA通過該基團偶聯(lián)到載體的氨基上。另外，螯合劑上的羧基或氨基可通過活化或先衍生化然后偶聯(lián)而連接到載體上，所有這些都是通過已知的方式完成的。
硼附加物如碳硼可通過常規(guī)方法連接到抗體上。例如，用下垂側(cè)鏈上的羧基制備碳硼，這也是本領(lǐng)域所熟知的。這種碳硼與載體如氨基葡聚糖的連接可通過碳硼的羧基活化并與載體上的胺凝縮來完成，形成有治療作用的免疫偶聯(lián)物，如下文所述。
多肽載體可用于取代氨基葡聚糖，但是多肽載體的多肽鏈應(yīng)該包含至少50個氨基酸殘基，優(yōu)選100-5000個氨基酸殘基。其中至少有一些氨基酸應(yīng)該是賴氨酸殘基或谷氨酰胺或天冬氨酸殘基。賴氨酸的下垂氨基以及谷氨酰胺和天冬氨酸的下垂羧基適于連接藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼附加物或其他治療劑。合適多肽載體的例子包括多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、上述氨基酸的共聚物以及這些氨基酸和能賦予加載載體和偶聯(lián)物理想溶解特性的其他氨基酸如絲氨酸的混合聚合物。
通過氧化抗體的糖鏈部分、所得的醛(和酮)羰基與加載藥物、毒素、螯合劑、免疫調(diào)節(jié)劑、硼附加物或其他治療性藥物的載體上的氨基反應(yīng)可以影響中間偶聯(lián)物與抗體組分的結(jié)合。另外，中間偶聯(lián)物可通過加載治療性藥物的中間偶聯(lián)物上引入的氨基連接到氧化抗體組分上。例如，與NaIO4或其他糖酵解試劑進行化學(xué)反應(yīng)，或者，例如，與神經(jīng)氨酸苷酶和半乳糖氧化酶進行酶催化反應(yīng)可以很方便地影響氧化作用。對于氨基葡聚糖載體來說，并不是氨基葡聚糖的所有氨基都用于加載治療性藥物。氨基葡聚糖的剩余氨基與氧化的抗體組分凝縮形成希夫堿加成物，然后通過還原而穩(wěn)定，一般是用硼氫化物還原劑進行還原。
類似的方法可用于制備本發(fā)明的其他免疫偶聯(lián)物。加載有多肽的載體優(yōu)選包含富裕的游離殘基用于和抗體組分的氧化糖鏈部分凝縮。如果需要，多肽載體上的羧基可轉(zhuǎn)化成胺，例如，通過用DCC活化或者與過量的二胺(diamme)反應(yīng)。
最終得到的免疫偶聯(lián)物利用常規(guī)技術(shù)純化，例如，在Sephacryl S-300上進行分子篩層析，或者用一個或多個CD84Hy表位進行親和層析。
另外，免疫偶聯(lián)物可通過將抗體組分與治療劑直接連接來制備。通用方法與間接連接方法相似，只是治療劑是直接連接到氧化的抗體組分上。
應(yīng)當理解的是，其他治療劑也可用螯合劑取代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員無需特別的試驗就可以制定出結(jié)合方案。
作為進一步的闡述，治療劑可通過二硫鍵的形成連接到還原抗體組分的鉸鏈區(qū)。例如，破傷風(fēng)毒素肽可通過用于將肽連接到抗體組分上的單個半胱氨酸殘基構(gòu)建。另外，這種肽可用異源雙功能交聯(lián)子如N-琥珀酰-3(2-聯(lián)硫基吡啶)-丙酸鹽(SPDP)連接到抗體組分上。Yu等，Int.J.Cancer 56244(1994)。用于這種連接的通用技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，Wong，《蛋白質(zhì)結(jié)合和交聯(lián)化學(xué)》(Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking)(CRC出版社1991)；Upeslacis等，“化學(xué)方法修飾抗體”(″Modification of Antibodies byChemical Methods，″)，《單克隆抗體原理及應(yīng)用》(MonoclonalAntibodiesPrinciples and Applications)，Birch等，(編輯)，187-230頁(WL公司(Wiley-Liss，Inc.)1995)；Price，“合成肽來源的抗體的制備和特征”(″Productionand Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″)，《單克隆抗體制備、改造及臨床應(yīng)用》(Monoclonal AntibodiesProduction，Enineering andClinical Application)，Ritter等，(編輯)，60-84頁(劍橋大學(xué)出版社1995)。
抗體與細胞毒劑的偶聯(lián)物可通過各種雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰-3(2-聯(lián)硫基吡啶)-丙酸鹽(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸脂肪酸二甲酯)、活性酯類(如辛二酸二琥珀酸亞胺)、醛類(如戊醛)、疊氮化合物(如雙(p-疊氮苯甲酰)己二胺)、二疊氮衍生物(如雙-(p-重氮基苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸鹽(如甲苯2，6-二異氰酸酯)以及雙活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制備。例如，蓖麻蛋白免疫毒素可按照Vitetta等，Science2381098(1987)描述的方法制備。碳-14-標記的1-異硫氰基苯基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種典型的用于將放射性核素連接到抗體上螯合劑(參見，例如，WO94/11026)。
如上所述，抗體Fc區(qū)的糖鏈基序可用于連接治療劑。但是如果免疫偶聯(lián)物的抗體組分用抗體片段，那么抗體片段可不包含F(xiàn)c區(qū)。然而，在抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)內(nèi)引入糖鏈基序也是可能的。參見，例如，Leung等，J.Immunol.1545919(1995)；Hansen等，美國專利號5,443,953。人基因工程糖鏈基序再用于連接治療劑。
另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會了解結(jié)合方法無數(shù)可能的變體。例如，糖鏈基序可用于連接聚乙二醇以延長完整抗體或抗原結(jié)合片段在血液、淋巴或其他細胞外液體內(nèi)的半衰期。另外，通過將治療劑連接到糖鏈基序和游離巰基上來構(gòu)建“二價免疫偶聯(lián)物”也是有可能的。這種游離巰基可位于抗體組分的鉸鏈區(qū)。
抗體融合蛋白 本發(fā)明涉及包含一種或多種抗體基序和另一種多肽如免疫調(diào)節(jié)劑或毒素基序的融合蛋白的用途。制備抗體融合蛋白的方法是本領(lǐng)域所熟知的。參見，例如，美國專利號6,306,393。包含IL-2基序的抗體融合蛋白可見于Boleti等，Ann.Oncol.6945(1995)，Nicolet等，Cancer Gene Ther.2161(1995)，Becker等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 937826(1996)，Hank等，Clin.Cancer Res.21951(1996)以及Hu等，Cancer Res.564998(1996)的描述。另外，Yang等，Hum.Antibodies Hybridomas 6129(1995)描述了一種包含F(xiàn)(ab′)2片段和腫瘤壞死因子α基序的融合蛋白。
抗體-毒素融合蛋白的制備方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其中的重組分子包含一種或多種抗體組分和毒素或化療藥物。Chaudhary等，Nature 339394(1989)，Brinkmann等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 888616(1991)，Batra等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 895867(1992)，F(xiàn)riedman等，J.Immunol.1503054(1993)，Wels等，Int.J.Can.60137(1995)，F(xiàn)ominaya等，J.Biol.Chem.27110560(1996)，Kuan等，Biochemistry 352872(1996)和Schmidt等，Int.J.Can.65538(1996)所描述的抗體-假單胞菌外毒素A融合蛋白。Kreitman等，Leukemia 7553(1993)，Nicholls等，J.Biol.Chem.2685302(1993)，Thompson等，J.Biol.Chem.27028037(1995)和Vallera等，Blood 882342(1996)所描述的包含白喉毒素基序的抗體-毒素融合蛋白。Deonarain等，Tumor Targeting 1177(1995)描述了一種包含RNA酶基序的抗體-毒素統(tǒng)合蛋白，而Linardou等，Cell Biophys.24-25243(1994)制備了一種包含DNA酶I組分的抗體-毒素融合蛋白。白樹毒素被用于Wang等，《第209界ACS全國會議摘要》(Abstracts of the 209th ACS NationalMeeting)，Anaheim，Calif.，8月2-6日，1995，第1部分，BIOT005所描述的抗體-毒素融合蛋白中的毒素基序。作為另一個例子，Dohlsten等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 918945(1994)報道了一種包含葡萄球菌內(nèi)毒素A的抗體-毒素融合蛋白。
適用于制備這種偶聯(lián)物的毒素的例子有蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌內(nèi)毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。參見，例如，Pastan等，Cell 47641(1986)和Goldenberg，CA-A Cancer Journal for Clinicians 4443(1994)。其他合適的毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
通過將抗體連接到可將前藥(例如，肽基化療藥物，參見WO81/01145)轉(zhuǎn)化成活化的抗癌藥物的前藥轉(zhuǎn)化酶上，本發(fā)明的抗體還可用于ADEPT中。參見，例如，WO88/07378和美國專利號4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括能以這種方式作用于前藥以將其轉(zhuǎn)化為其活性更高的細胞毒形式的酶。
可用于本發(fā)明方法中的酶包括而不限于用于將含磷酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含硫酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物的芳香基硫酸酯酶；用于將非毒性的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；用于將含肽前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶如粘質(zhì)沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)；用于轉(zhuǎn)化含D氨基酸取代的前藥的D-丙氨?；入拿福挥糜趯Ⅳ驶八庌D(zhuǎn)化成游離藥物的糖鏈裂解酶如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶；用于將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化成游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；以及用于將藥物轉(zhuǎn)化成游離藥物的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，其中的藥物是在其胺氮上分別用苯氧乙?；虮揭阴；苌?。另外，具有酶活性的抗體，在本領(lǐng)域中也被稱為抗體酶，可用于將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)化成游離的活性藥物(參見，例如，Massey，Nature 328457-458(1987))?？贵w-抗體酶偶聯(lián)物可按照本文所述的方法制備，用于將抗體酶轉(zhuǎn)運到腫瘤細胞群中。
本發(fā)明的酶可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)共價結(jié)合到抗體上，例如使用上述異源雙功能交聯(lián)劑。利用本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)可以構(gòu)建包含本發(fā)明抗體的至少一個抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白，其中抗原結(jié)合區(qū)被連接到本發(fā)明的酶的至少一個功能活性部分上。(參見，例如，Neuberger等，Nature 312604-608(1984))。
非治療性用途 本發(fā)明的抗體可用作靶抗原的親和純化試劑，或者用于靶抗原的診斷試驗，例如，檢測特殊細胞、組織或血清中抗原的表達水平?？贵w還可用于體內(nèi)診斷試驗。一般而言，用于此目的的抗體用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)標記，這樣可通過免疫液閃成像術(shù)來定位腫瘤。
本發(fā)明的抗體可用于任何已知的分析方法中，如競爭結(jié)合分析、直接和間接夾心分析如ELISA以及免疫沉淀分析。Zola，《單克隆抗體技術(shù)操作手冊》(Monoclonal AntibodiesA Manual of Techniques)，147-158頁(CRC出版社1987)。抗體還可用于免疫組化分析，用本領(lǐng)域熟知的方法標記腫瘤樣品。
為了便于操作，本發(fā)明的抗體可以試劑盒的方式提供，即，預(yù)定量的試劑和診斷分析操作說明書的包裝組合。如果抗體用酶標記，那么試劑盒將包含酶所需要的底物和輔因子(例如，可提供可檢測發(fā)色基團或熒光基團的底物前體)。另外，其他附加物也可以包括在內(nèi)，例如，穩(wěn)定劑、緩沖液(例如，封閉緩沖液或裂解緩沖液)等。各種試劑的相對量可以變化很大，只要試劑溶液的濃度可以使分析的敏感性達到最佳就可以。優(yōu)選的是試劑以干粉的形式提供，通常的冷凍干燥的，其中包括溶解時能提供具有合適濃度的試劑溶液的賦形劑。
本發(fā)明通過下面的實施例來說明，這些實施例并不意味著以任何方式限定本發(fā)明。
實施例 實施例1 制備PRLR的ECD、S1和S2區(qū)片段 PRLR胞外域(ECD，SEQ ID NO2的25-234位氨基酸)、S1區(qū)(SEQ ID NO2的25-125位氨基酸)和S2區(qū)(SEQ ID NO2的126-234位氨基酸)相應(yīng)的PRLR片段的表達和純化按如下方法進行。如表2所示，設(shè)計出ECD、S1和S2的昆蟲表達構(gòu)建體，引物是根據(jù)其各自的氨基酸序列設(shè)計的，可用于克隆片段(如表3所述)。
表2
表3
為了克隆S1和S2區(qū)，利用巢式PCR方法插入標簽并改造3’/5’區(qū)。克隆S1用6個正向巢式引物和1個反向引物?？寺2用5個正向巢式引物和3個反向引物。
PCR擴增用PfuUltraTM Hotstart PCR Master Mix(PfuUltraTM熱啟動PCR主混合物)(斯圖特基因公司(Stratagene))按照廠家推薦的方法進行。用于擴增的模板是克隆到pDEST3218內(nèi)的PRLR的ECD片段(數(shù)據(jù)未顯示)。利用拓撲異構(gòu)酶克隆策略將ECD PCR產(chǎn)物克隆到BlueBac4.5/V5-His TOPO-TA(因維曲根公司(Invitrogen))內(nèi)。利用門控技術(shù)(Gateway Technology)(因維曲根公司)將S1和S2 PCR產(chǎn)物克隆到內(nèi)部適用pAcMP3中。最后篩選出的克隆通過雙鏈測序來確認。制備10-20ug DNA用于昆蟲轉(zhuǎn)染。
按照如下方法在昆蟲細胞內(nèi)利用重組構(gòu)建體表達各個PRLR片段。通過編碼PRLR胞外域的質(zhì)粒DNA和SapphireTM基因組苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)DNA共轉(zhuǎn)染的噬斑純化分離桿狀病毒。擴增重組病毒并用于感染Tn5昆蟲細胞，密度為1x106-1.5x106細胞/ml，10L(工作體積)波浪式生物反應(yīng)器內(nèi)的moi為2-10。感染48小時后，收獲細胞和上清，離心，得到的上清用于濃縮。上清在0.45um中空纖維柱上澄清，然后用正切流動過濾截止膜進行5倍濃縮。在進行蛋白純化前上清用1L、0.2um孔徑的真空瓶過濾除菌。
可用相似的方法在昆蟲細胞內(nèi)表達S1和S2區(qū)，只是在純化前不用濃縮S1片段，S2片段在5kDa MW柱上濃縮。
PRLR片段純化方法如下。從凈表達組(expression group neat)中收獲包含表達的PRLR的ECD或亞區(qū)的昆蟲細胞培養(yǎng)物上清，或者利用標稱截止分子量為1或5kD的疊加膜盒式裝置(PF公司(Pall Filtron))濃縮，最高可濃縮10倍。在實際應(yīng)用時，上清通過0.2微米的濾膜過濾。上清直接加載到PBS平衡柱上。
按照廠家推薦的流速在1或5mL HisTrap柱(GE健康護理公司(GEHealthcare))純化His標簽蛋白。在固定抗glu單克隆抗體的柱子上純化Glu標簽蛋白，純化柱的制備方法如下純化的抗glu單克隆抗體溶于PBS中，濃度為3-10mg/mL，按照廠家的說明書將其連接到Affi-gel 10(伯樂公司(Bio-Rad))上，這是一種正-羥基琥珀酰亞胺活化的瓊脂糖凝膠。抗glu瓊脂糖包裹進XK16柱(GE健康護理公司)，以15-30cm/小時的線性流速運行。
通過用20倍柱體積的緩沖液A(PBS)到緩沖液B(PBS+0.25M咪唑(IX-0005，EMM公司(EM Merck))pH7.4)的梯度洗脫將蛋白從HisTrap柱上洗脫下來。用含0.1mg/mL肽EYMPTD的PBS從抗glu柱上將蛋白洗脫下來。通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡或質(zhì)譜鑒定各組分并適當混合。
混合的PRLR的ECD或亞區(qū)通過分子排阻層析進一步純化，柱子為用PBS平衡的Superdex 75 26/60柱(GE健康護理公司)，流速為2.5mL/分。這些柱子的加載體積不超過10mL。通過SDS-PAGE鑒定各組分并適當混合。
實施例2 從人抗體噬菌體展示文庫中分離靶特異性抗體 為了分離一組能中和人PRLR活性的抗體，平行篩選表達scFv片段的三個人抗體噬菌體展示文庫。用于文庫淘洗的靶位是促乳素受體的可溶性胞外域(ECD)(人促乳素受體氨基酸25-234)，其制備方法見上述實施例1。受體被生物素化(NHS-LC生物素，皮爾斯公司(Pierce))，可溶性淘洗在生物素化的ECD上進行。
從噬菌體展示文庫中篩選靶抗原特異性抗體可按照Marks等，(MethodsMol Biol.248161-76，2004)描述的方法進行。簡言之，噬菌體展示文庫與50pmol生物素化的ECD在室溫下共孵育1小時，然后用100μl抗生物素蛋白鏈菌素小珠懸液(

M-280鏈霉抗生物素蛋白，因維曲根公司)捕獲形成的復(fù)合物。通過用洗滌緩沖液(PBS+5％牛奶)洗滌小珠來去除非特異性的噬菌體。結(jié)合的噬菌體用0.5ml 100nM三乙胺(TEA)洗脫，然后立即加入等體積的1M TRIS-Cl pH7.4進行中和。洗脫下來的噬菌體群用于感染處于指數(shù)生長期的TG1大腸桿菌細胞，按照描述的方法(Methods Mol Biol.248161-76，2004)恢復(fù)噬菌粒。篩選共重復(fù)三輪。從第三輪淘洗得到的噬菌體感染的TG1細胞中獲得的單個克隆通過ELISA分析測定其結(jié)合活性進行篩選。簡言之，從感染洗脫的噬菌體感染的TG1細胞中獲得的單個克隆用于接種96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)微孔板內(nèi)的培養(yǎng)物使其OD500達到0.6，此時在微孔板內(nèi)添加1mMIPTG然后在30℃的振蕩孵育器中過夜培養(yǎng)以誘導(dǎo)可溶性抗體的表達。旋轉(zhuǎn)沉降細菌，制備胞質(zhì)提取物用于檢測與96孔微孔板(96孔平底免疫吸附板，Nunc)上固定的ECD的抗體結(jié)合活性，所用方法為微孔板制造商提供的標準ELISA方法。
抗促乳素受體(PRLR)抗體與重組胞外域(ECD)的親和力利用

2000測定，用于評價抗體的親和力等級。蛋白A/G捕獲表面用于人scFv-Fc融合蛋白，兔抗小鼠IgG-Fc(RAM-Fc)抗體捕獲表面用于雜交瘤產(chǎn)生的抗體。蛋白A/G和RAM-Fc雙捕獲芯片是CM5傳感器芯片，按照

公司推薦的方法通過標準的EDC-NHS胺偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)可以使固定在所有4個流動池上的捕獲分子(蛋白A/G或RAM-Fc)達到最大捕獲水平。流動緩沖液是HBS-EP(

公司)，溫度設(shè)定在25℃，流速最初設(shè)定在10μL/分。純化出的抗體稀釋到HBS-EP中，濃度約為1-3μg/mL，并在1到2分鐘內(nèi)注射到捕獲芯片上。流速增加到25到30μL/分。PRLR的重組ECD稀釋到1μg/mL，在5到6分鐘內(nèi)注射，解離10分鐘。
曲線擬合采用BIAEvaluation軟件，用于計算動力結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)(分別為kon和koff)。1∶1朗繆爾相互作用模型和質(zhì)量輸運校正(masstransport correction)用于完成每一樣品的同時ka/kd擬合。一些樣品同時采用設(shè)置成適合當?shù)氐腞max、kon和koff參數(shù)進行擬合。當發(fā)生基線漂移時，使用漂移值設(shè)定為常數(shù)并手工輸入的漂移基線模型。漂移值的變化范圍為-0.03到+0.05RU/秒。
也可以利用熒光活化細胞分選(FACS)分析和熒光微容量試驗技術(shù)(FMAT，F(xiàn)luorometric Microvolume Assay Technology)通過測定與表達促乳素受體的細胞的結(jié)合來評價抗體結(jié)合活性(Swartzman等，Anal Biochem.271143-51，1999)。通過FACS或FMAT分析顯示有結(jié)合活性的克隆進行測序，編碼獨特重鏈CDR3和輕鏈CDR3蛋白序列的克隆重新格式化成scFv-Fc，如下面的實施例3所描述的。按照下面實施例5和6描述的方法分析這些scFv-Fc抑制PRLR誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化的能力以及抑制PRLR誘導(dǎo)的BaF3/PRLR細胞系增殖的能力。如實施例7所述，進一步鑒定篩選出的抗體結(jié)合ECD、S1和S2的特征以及抗體對之間結(jié)合PRLR的ECD的相對競爭力。篩選出的抗體的數(shù)據(jù)顯示在下面的表4中。
表4 實施例3 克隆重新格式化成scFv-Fc格式 對于實施例2所鑒定出的每一個獨特scFv克隆來說，通過PCR從噬菌體展示載體中擴增出編碼scFv片段的cDNA，然后連接到哺乳動物表達載體內(nèi)，該載體是XOMA的專利表達載體經(jīng)修飾而成的(描述于WO 2004/033693，編碼κ、λ或γ2恒定區(qū)基因)，可表達scFv-Fc蛋白的每一個抗體，其中蛋白的Fc區(qū)代表IgG1分子的CH2和CH3區(qū)。scFv-Fc融合蛋白的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域熟知的，例如，參見Fredericks等，Protein Eng Des Sel.2004Jan；17(1)95-106，Powers等，J Immunol Methods.2001May 1；251(1-2)123-35或Shu等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1993，90，7995-7998。美國專利5,892,019也公開了Fc融合蛋白載體的構(gòu)建方法及scFv-Fc融合蛋白的表達方法。
利用脂轉(zhuǎn)染胺2000(Lipofectamine 2000)(因維曲根公司)按照廠家的說明書通過轉(zhuǎn)染293E細胞可實現(xiàn)融合蛋白的表達。5天以后，通過離心去除細胞，按照廠家推薦的方法利用蛋白A瓊脂糖(GE健康護理公司)從上清中純化scFv-Fc融合蛋白。
實施例4 小鼠雜交瘤分泌的靶特異性抗體的鑒定 抗人促乳素受體(PRLR)胞外域的小鼠抗體按如下方法制備。通過皮下注射重組的PRLR胞外域(如上所述)免疫6只Balb/C小鼠。在28天內(nèi)小鼠共接受10次注射。最后一次注射后4天處死小鼠，取出引流淋巴結(jié)。將淋巴結(jié)細胞懸浮后采用BTX ECM2001電-細胞操縱器(BTX ECM2001 Electro-CellManipulator)(哈佛儀器公司(Harvard Apparatus))通過電促細胞融合與小鼠骨髓瘤細胞系P3xAg8.653融合。
融合以后，細胞接種到大約40個96孔板內(nèi)。12天后通過抗重組ECD的ELISA和FMAT篩選微孔板。FMAT試驗使用CHO細胞系，該細胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，能表達高水平的PRLR受體。
按照下面實施例5和6描述的方法分析篩選出的雜交瘤抑制PRLR誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化的能力以及抑制PRLR誘導(dǎo)的BaF3/PRLR細胞系增殖的能力。如實施例7所述，進一步鑒定篩選出的抗體結(jié)合重組ECD、S1和S2的特征以及抗體對之間結(jié)合PRLR的ECD的相對競爭力。篩選出的抗體的數(shù)據(jù)顯示在上面的表4中。
實施例5 確定抗體對ERK1/2磷酸化的影響 經(jīng)過5個小時的血清饑餓以后，T47D細胞接種到包含完全生長培養(yǎng)基的微孔滴定板中，37℃孵育24小時。細胞用于磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，與抗體在37℃共孵育30分鐘，其中抗體用包含0.1％BSA的無血清培養(yǎng)基稀釋?？贵w的終濃度為30ng/ml。細胞與促乳素在37℃共孵育30分鐘，然后用冰預(yù)冷的PBS洗滌兩次。加入包含去污劑、螯合劑和各種蛋白酶以及磷酸酶抑制劑的標準裂解緩沖液以制備細胞裂解物。按照R&D系統(tǒng)公司(R&D Systems，Inc.)的

IC磷酸-ERK1/ERK2的說明書利用標準ELISA測定磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)的水平。典型試驗的結(jié)果顯示在圖2、3和4中，篩選出的抗體的試驗結(jié)果顯示在上面的表4中。
圖7A-7C顯示的是抗體的VH和VL氨基酸序列在pERK試驗中可產(chǎn)生80％以上的抑制作用。
實施例6 確定抗體對PRL反應(yīng)性細胞系增殖的影響 通過電穿孔方法將包含全長人PRLR和新霉素耐藥盒的表達載體導(dǎo)入到小鼠前B細胞系BaF3中以制備BaF3/PRLR細胞。細胞在添加G418(1mg/ml)和rmIL-3(10ng/ml)的培養(yǎng)基中篩選7天，然后在不含G418或IL-3的rhPRL(1ug/ml)中再篩選7天。在14天的時間內(nèi)，培養(yǎng)基中的PRL濃度逐步降低直到達到50ng/ml的維持水平。在試驗的第一天，平底96孔板的每一孔中接種1×104細胞?？字屑尤?0ug/ml的抗體(scFv-Fc融合蛋白的形式)，添加和不加50ng/mlrhPRL。培養(yǎng)板孵育48小時，然后用CellTiter Glo試劑分析。樣品設(shè)三復(fù)孔，激動作用定義為在不含PRL的情況下抗體所誘導(dǎo)的細胞增殖，而拮抗作用定義為在存在PRL的情況下的細胞增殖。篩選出的抗體的這種增殖試驗結(jié)果顯示在上面的表4中。
為了分析PRL誘導(dǎo)的增殖作用以及抗PRLR抗體對增殖的抑制作用，T47D或MCF7-NCI細胞以1x106細胞/ml調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基(無酚紅的RPMI/10％FCS)的密度在T75培養(yǎng)瓶(總體積12ml)中分裂。分裂72小時后細胞用胰酶消化，計數(shù)，然后以每孔5000個細胞(T47D)或每孔20000個細胞(MCF7)的密度接種到平底96孔板中(100ul/孔)。MCF7細胞接種到無血清和無酚紅RPMI培養(yǎng)基中，T47D細胞接種到無血清RPMI培養(yǎng)基或含10％碳條過濾血清的RPMI培養(yǎng)基中。接種24小時后在各孔中加入PRL和抗-PRLR抗體(50ul，濃縮3倍)。孵育72小時后，3[H]胸苷(1μci/孔)加到微孔板內(nèi)，在37°孵育器中至少孵育6小時。利用胰酶和Tomtec 96孔微孔板細胞收獲儀收獲細胞。然后將濾膜轉(zhuǎn)移到Trilux光度計中進行分析(1分鐘計數(shù))。圖5中的增殖試驗結(jié)果說明scFv可抑制促乳素介導(dǎo)的對增殖的促進作用。
實施例7 通過BIACORE測定結(jié)合親和力和競爭作用 重復(fù)進行上述實施例2所述的BIACORE分析以確定篩選出的抗體與上述PRLR的ECD、S1和S2區(qū)的相對結(jié)合水平，只是S1、S2或ECD蛋白以10μg/mL的濃度、15μL/分鐘的速率在2分鐘內(nèi)注射。利用

控制軟件采集這個分析的數(shù)據(jù)，表示為報告點(共振單元(RU))，結(jié)合抗原的量除以捕獲抗體的量使數(shù)據(jù)標準化。數(shù)據(jù)顯示在下面的表5中。
表5.標準化后的抗PRLR抗體結(jié)合的S1、S2和ECD。

通過在

2000上進行一系列注射來確定純化的抗體的親和力。所得到的親和力和速率常數(shù)與這些抗體在HBS-EP緩沖系統(tǒng)中、25℃下與促乳素受體(PRLR)的重組胞外域(ECD)的結(jié)合有關(guān)。按照

公司推薦的方法通過標準的EDC-NHS胺偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)制備帶有約5000-1000RU蛋白A/G的CM5傳感器芯片，用于捕獲抗體。用HBS-EP捕獲緩沖液將純化的抗體稀釋到約1ug/mL。確定達到250-400RU抗體捕獲所需的注射時間。用于動力學(xué)分析的抗體的捕獲通過以10uL/分的速率在1.5到3分鐘內(nèi)注射抗體來完成，注射時間根據(jù)最佳捕獲水平的結(jié)果而定。
動力學(xué)分析時流速設(shè)定為40uL/分。從148nM(4ug/mL)或37nM(1ug/mL)開始以1∶3連續(xù)稀釋制備5種濃度的PRLR ECD。每個濃度+緩沖液對照(濃度為0)都設(shè)雙份。數(shù)據(jù)組是雙參照的，用1∶1朗繆爾結(jié)合相互作用模型進行擬合。還對用IgG1和IgG2構(gòu)建體重格式化得到的XPA.06.167的IgG重格式化(reformatted)構(gòu)建體進行相同的分析。
動力學(xué)常數(shù)和篩選出的抗體與PRLR的ECD的結(jié)合親和力顯示在下面的表6中。
表6.親和力分析結(jié)果 用相同方法確定其他抗體的動力學(xué)常數(shù)和親和力(總結(jié)在下面的表7中)。
表7 抗體對之間與PRLR結(jié)合的相對競爭或干擾(例如，配對分析)按照如下方法利用系列競爭分析策略確定。在這種方法中，一種抗體被直接或者通過捕獲劑固定在傳感器芯片上，通過將ECD注射到固定的抗體上使其與ECD結(jié)合。如果需要，通過注射高濃度的不相關(guān)IgG封閉過量的捕獲劑(例如，當利用兔抗鼠IgG捕獲表面檢測兩種小鼠抗體時)。隨后注射用于測定競爭力的抗體，確定抗體與第一抗體捕獲的ECD結(jié)合的能力。如果兩種抗體分別結(jié)合ECD上的不同表位，那么第二抗體應(yīng)該也能夠結(jié)合ECD/第一抗體復(fù)合物。如果兩種抗體互相干擾或競爭，那么第二抗體同樣不能或根本不能結(jié)合ECD/第一抗體復(fù)合物。這種競爭分析的結(jié)果顯示在上面的表4中(如果兩種抗體具有相同的表位盒(bin)數(shù)，那么它們會彼此競爭結(jié)合ECD，以相同的模式與其他盒內(nèi)的抗體競爭)。本發(fā)明特別涉及鑒定能與本文所述的盒中任何抗體結(jié)合相同表位的其他抗體，或者與這種抗體競爭結(jié)合PRLR的ECD的其他抗體。
實施例8 蛋白質(zhì)印跡分析對PRL誘導(dǎo)的PRLR、STAT5和AKT磷酸化的影響 篩選出的抗體抑制PRL誘導(dǎo)的STAT5和AKT磷酸化的能力通過如下方法確定。細胞以3×105/ml的密度接種到添加無酚紅RPMI/10％FCS的6孔板中培養(yǎng)過夜。24小時后用無血清RPMI更換培養(yǎng)基繼續(xù)孵育30分鐘。在某些試驗中，在這個血清饑餓期間細胞與抗PRLR抗體或非特異性的對照抗體共孵育。然后在孔中加入50ng/ml PRL繼續(xù)孵育30分鐘，細胞用PBS漂洗一次，用含50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40，1mM Na3OV4，50mM NaF，0.25％脫氧膽酸鹽和蛋白酶抑制劑的緩沖液裂解。試管在冷凍微量離心機中以14,000rpm離心，利用BCA試劑定量測定裂解物。用10％SDS-PAGE分離30μg全細胞裂解物，利用STAT5A/B(Y694/Y699，Upstate)或PRLR(Y546/Y611，自制的)的磷酸特異性抗體和ECL檢測蛋白。通過用總STAT5(BD公司)或PRLR(酶化公司(Zymed))或AKT(細胞信號傳導(dǎo)公司(CellSignalling))特異性抗體染色來確定等量的蛋白上樣量。圖6顯示的是PRLR特異性抗體對PRLR胞內(nèi)磷酸化的效應(yīng)的典型分析結(jié)果。
實施例9 小鼠抗體的人源化 本實施例展示了一種人源化小鼠抗PRLR抗體的方法。
人源化PRLR抗體輕鏈和重鏈基因的設(shè)計 小鼠抗體XHA.06.983、XHA.06.275和XHA.06.642的VL和VH氨基酸序列顯示在

圖10中。利用國家生物醫(yī)藥基礎(chǔ)蛋白序列鑒定數(shù)據(jù)庫或相似數(shù)據(jù)庫鑒定的人抗體序列用于提供人源化抗體的框架。為了篩選人源化重鏈的序列，小鼠重鏈序列與人抗體重鏈的序列一起排列。在每一個點上，人抗體的氨基酸都被選擇為人源化序列所用的氨基酸，除非該位置屬于以下四種情形之一，在這四種情況下選擇小鼠的氨基酸 (1)該位置位于補體決定區(qū)(CDR)，如Kabat，J.Immunol.，125，961-969(1980)所定義的； (2)人抗體氨基酸在人重鏈的這個位置上是稀有的，而小鼠氨基酸在人重鏈的這個位置上是常見的； (3)該位置與小鼠重鏈氨基酸序列上的CDR非常接近；或者 (4)小鼠抗體的三維模型顯示該氨基酸在物理空間位置上靠近抗原結(jié)合區(qū)。
為了篩選人源化輕鏈的序列，小鼠輕鏈序列與人抗體輕鏈的序列一起排列。在每一個點上，人抗體的氨基酸都被選擇為人源化序列所用的氨基酸，除非該位置屬于上述情形之一，這些情形重復(fù)如下 (1)CDR； (2)小鼠氨基酸比人抗體更常見； (3)靠近CDR；或 (4)在三維結(jié)構(gòu)上可能靠近結(jié)合區(qū)。
實際使用的重鏈和輕鏈基因的核苷酸序列按如下步驟選擇 (1)編碼按照上述情形選擇出的氨基酸序列的核苷酸序列； (2)這些編碼序列的5′端為編碼前導(dǎo)(信號)序列的核苷酸序列。選擇這些前導(dǎo)序列作為典型抗體； (3)編碼序列的3’端為小鼠輕鏈J5片段和小鼠重鏈J2片段之后的核苷酸序列，這些都是小鼠序列的一部分。這些序列包含其中是因為它們包含剪接供者信號；以及 (4)在序列的兩端是Xba I位點，以便于在Xba I位點上剪切并克隆到載體的Xba I位點內(nèi)。
人源化輕鏈和重鏈基因的構(gòu)建 為了合成重鏈，利用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)的380B DNA合成儀合成4種寡核苷酸。兩種寡核苷酸分別是一條重鏈的一部分，每條寡核苷酸都與下一條寡核苷酸重疊約20個核苷酸以便于復(fù)性。總之，寡核苷酸可覆蓋整個人源化重鏈可變區(qū)，但是幾個位于末端的核苷酸除外，這樣便于在Xba I位點剪切。寡核苷酸用聚丙烯酰胺凝膠純化。
按照標準方法利用ATP和T4多聚核苷酸激酶磷酸化每一條寡核苷酸(Maniatis等，《分子克隆實驗室操作手冊》，第2版，冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港，(1989))。為了使磷酸化的寡核苷酸復(fù)性，將寡核苷酸懸浮在40ulTA(33mM Tris乙酸鹽，pH7.9，66mM乙酸鉀，10mM乙酸鎂)中，每種寡核苷酸的濃度約為3.75μM，95℃變性4分鐘，然后緩慢冷卻到4℃。為了通過合成每一條寡核苷酸的相對鏈而從寡核苷酸合成完整基因，加入下列組分，總體積為100ul 10ul 退火的寡核苷酸 0.16mM 每種脫氧核糖核苷酸 0.5mM ATP 0.5mM DTT 100ug/ml BSA 3.5ug/ml T4 g43蛋白(DNA聚合酶) 25ug/mlT4 g44/62蛋白(聚合酶輔助蛋白) 25ug/ml45蛋白(聚合酶輔助蛋白) 混合物在37℃孵育30分鐘，然后加入10u的T4 DNA連接酶，在37℃再孵育30分鐘。通過在70℃孵育15分鐘滅活聚合酶和連接酶。基因用Xba I消化，在反應(yīng)中加入50ul含200ug/ml BSA、1mM DTT、43ul水和5ul Xba I的2×TA。反應(yīng)在37℃孵育3小時，然后在凝膠上純化。從凝膠上純化Xba I片段，然后利用標準方法克隆到質(zhì)粒pUC19的Xba I位點。利用標準技術(shù)純化質(zhì)粒，通過雙脫氧法測序。
表達人源化輕鏈和重鏈的質(zhì)粒通過如下過程構(gòu)建從已插入重鏈和輕鏈Xba I片段的pUC19質(zhì)粒中分離輕鏈和重鏈Xba I片段，然后將其插入到合適表達載體的Xba I位點，這種載體被轉(zhuǎn)染到合適的宿主細胞內(nèi)時可表達高水平的完整重鏈。
人源化抗體的合成和親和力 表達載體轉(zhuǎn)染到小鼠Sp2/0細胞內(nèi)，根據(jù)表達載體賦予的可篩選標記物按照標準方法篩選整合了質(zhì)粒的細胞。為了證明這些細胞能夠分泌結(jié)合PRLR的抗體，細胞的上清與已知表達PRLR的細胞共孵育。洗滌以后，細胞用熒光素標記的羊抗人抗體標記，洗滌，并在FACSCAN細胞熒光測定儀上測定熒光強度。
體外培養(yǎng)可產(chǎn)生人源化抗體的細胞。按照標準方法，通過蛋白A的親和層析柱(馬薩諸塞州利特爾頓的PC公司(Pro-Chem Inc.，Littleton，MA)或類似裝置)從細胞上清液中純化人源化抗體，使其達到基本勻質(zhì)化。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)確定人源化抗體相對于起始小鼠抗體的親和力。
實施例10 小鼠抗體的Human EngineeringTM(人基因工程化) 本實施例描述了Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)的克隆和表達以及這種抗體的純化和結(jié)合親和力測定 Human EngineeredTM(人基因工程化)序列的設(shè)計 抗體可變區(qū)的Human EngineeringTM(人基因工程化)已由Studnicka描述[參見，例如，Studnicka等，美國專利號5,766,886；Studnicka等，ProteinEngineering 7805-814(1994)]，這是一種用于降低抗體分子的免疫原性同時又能保持其結(jié)合活性的方法。根據(jù)該方法，氨基酸取代可分為風(fēng)險不同的三組(1)低風(fēng)險改變是降低免疫原性的潛能最大而破壞抗原結(jié)合活性的可能最小的那些改變；(2)中風(fēng)險改變是雖然可被用于進一步降低免疫原性，但是有較大可能影響抗原結(jié)合或蛋白折疊的那些氨基酸；(3)高風(fēng)險殘基是對于結(jié)合或維持抗體結(jié)構(gòu)具有重要作用并且最可能影響抗原結(jié)合或蛋白折疊的那些殘基。由于脯氨酸在維持三維結(jié)構(gòu)中的作用，通常認為在脯氨酸上進行修飾至少是中風(fēng)險改變，即使該位置一般是低風(fēng)險位置。圖10顯示的是小鼠抗體XHA.06.983、XHA.06.275和XHA.06.642的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
采用這種方法將小鼠抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)Human EngineeredTM(人基因工程化)。通過使小鼠可變區(qū)的氨基酸序列與人可變區(qū)序列一起排列可以鑒定出處于低風(fēng)險位置并且能夠用該方法進行修飾的候選氨基酸殘基。所有人可變區(qū)都可以應(yīng)用，其中包括獨特的VH或VL序列、或者人共有VH或VL序列。低風(fēng)險位置上任意數(shù)目的氨基酸，或者全部氨基酸殘基都可以被改變。
同樣，通過使小鼠可變區(qū)的氨基酸序列與人可變區(qū)序列一起排列可以鑒定出處于低風(fēng)險和中風(fēng)險所有位置并且能夠用該方法進行修飾的候選氨基酸殘基。低風(fēng)險或中風(fēng)險位置上任意數(shù)目的氨基酸，或者低風(fēng)險和中風(fēng)險位置上的全部氨基酸殘基都可以被改變。
Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)序列的制備 編碼Human EngineeredTM(人基因工程化)重鏈和輕鏈V區(qū)序列和信號序列(例如，抗體來源的信號序列)的DNA序列通過合成核苷酸合成技術(shù)構(gòu)建。將編碼本文所述的每一種輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA插入到包含κ或λ輕鏈恒定區(qū)的載體內(nèi)。將編碼本文所述的每一種重鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA插入到包含γ1、2、3或4重鏈恒定區(qū)的載體內(nèi)。所有這些載體都包含啟動子(例如，hCMV啟動子)和3’非翻譯區(qū)(例如，小鼠κ輕鏈3’非翻譯區(qū))以及其他調(diào)節(jié)序列，選擇何種其他調(diào)節(jié)序列要根據(jù)其用于瞬時表達還是用于穩(wěn)定細胞系培養(yǎng)而定(美國2006/0121604)。
為了使用上述包含可變區(qū)序列的載體表達Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)，從低風(fēng)險輕鏈、低風(fēng)險+中風(fēng)險輕鏈、低風(fēng)險重鏈和低風(fēng)險+中風(fēng)險重鏈的不同組合中制備至少四種突變體。在輕鏈或重鏈或者二者都不包含中風(fēng)險改變的那些例子中，可以相應(yīng)地少制備幾個突變體。
瞬時表達載體的制備 構(gòu)建包含上述輕鏈或重鏈基因的載體用于瞬時轉(zhuǎn)染。除了上述HumanEngineeredTM抗體(人基因工程抗體)序列、啟動子和輕鏈3’非翻譯區(qū)以外，這些載體優(yōu)選包含EB病毒oriP以便于在表達EB病毒核抗原的HEK293細胞中復(fù)制。
Human-EngineeredTM PRLR抗體(人基因工程化PRLR抗體)在HEK293細胞中的瞬時表達 將包含上述EB病毒oriP和重鏈或輕鏈基因的各種載體瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293細胞內(nèi)，如美國2006/0121604所述。瞬時轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)最多可達10天，然后收集上清，利用蛋白A層析純化抗體。
用于永生細胞系生長的表達載體的制備 除了上述Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)序列、啟動子和輕鏈3’非翻譯區(qū)以外，用于永生細胞系生長的載體還包含可篩選標記基因，如用于分別篩選G418耐藥轉(zhuǎn)染子或組氨醇耐藥轉(zhuǎn)染子的neo或his。最終構(gòu)建出的載體包含一個拷貝的重鏈和一個拷貝的輕鏈編碼區(qū)。
永久轉(zhuǎn)染的CHO-K1細胞的培養(yǎng) 上述包含一個拷貝的輕鏈或重鏈基因的載體轉(zhuǎn)染到Ex-Cell 302適應(yīng)的CHO-K1細胞內(nèi)。適應(yīng)在Ex-Cell 302培養(yǎng)基內(nèi)懸浮生長的CHO-K1細胞通常用線性載體轉(zhuǎn)染，線性化的載體是用線性聚乙烯亞胺(PEI)制備的。細胞接種到包含Ex-Cell 302培養(yǎng)基的96孔板中，其中添加了1％FBS和G418。篩選96孔板內(nèi)的克隆，每個轉(zhuǎn)染最多約有10％的克隆被轉(zhuǎn)移到深孔96孔板中，培養(yǎng)基為添加G418的Ex-Cell 302培養(yǎng)基。
繁殖力試驗在深孔96孔板內(nèi)進行，用Ex-Cell 302培養(yǎng)基培養(yǎng)14天，取此時的上清通過IgG的免疫球蛋白ELISA試驗測定分泌的抗體水平。
將頂部克隆轉(zhuǎn)移到含Ex-Cell 302培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)。用Ex-Cell 302培養(yǎng)基內(nèi)的這些克隆進行搖瓶試驗。細胞在含25ml培養(yǎng)基的125ml錐形瓶中培養(yǎng)14天。在孵育結(jié)束時通過IgG ELISA或HPLC測定培養(yǎng)基內(nèi)的免疫球蛋白多肽的水平。用兩種或三種多單位轉(zhuǎn)錄載體順序轉(zhuǎn)染同一細胞系可得到免疫球蛋白表達水平進一步升高的克隆和細胞系，優(yōu)選表達水平升高到300μg/ml或更高。
純化 從本發(fā)明的載體和所有細胞系來純化免疫球蛋白多肽的方法已有報道(參見，例如，US 2006/0121604)。例如，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，培養(yǎng)終止后通過過濾去除細胞。濾液上載到蛋白A色譜柱上(如果需要，可以反復(fù)過柱)。洗滌色譜柱，然后從色譜柱洗脫下來分泌的免疫球蛋白多肽。為了制備抗體產(chǎn)物，將蛋白A群置于低pH(在pH3環(huán)境中處理30分鐘到1小時)環(huán)境中作為病毒滅活步驟。然后通過吸附性陽離子交換步驟進一步純化產(chǎn)物。從吸附性分離柱上洗脫下來的產(chǎn)物通過病毒阻留濾膜以進一步清除可能存在的病毒顆粒。過濾物通過陰離子交換柱進一步純化，產(chǎn)物不與陰離子交換柱結(jié)合。最后，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到制劑緩沖液中進行透析過濾結(jié)束純化過程。將蛋白濃度調(diào)整到至少1mg/mL并添加穩(wěn)定劑。
結(jié)合活性 評價重組Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)的PRLR結(jié)合活性。搖瓶培養(yǎng)物上清通過蛋白A色譜柱以純化蛋白，然后在A280確定蛋白濃度。結(jié)合活性試驗按照其他實施例描述的方法進行。
實施例11 人基因工程抗體 上述小鼠抗體中的三種抗體是Human EngineeredTM(人基因工程抗體)，如實施例10所述。
促乳素受體抗體XHA.06.642和XHA.06.275的Human EngineeringTM(人基因工程化) XHA.06.642的重鏈在11個低風(fēng)險位置或13個低+中風(fēng)險位置上被HumanEngineeredTM(人基因工程化)；輕鏈只在低風(fēng)險位置(14個改變)上被HumanEngineeredTM(人基因工程化)，因為所有的中風(fēng)險位置都已經(jīng)是人氨基酸。XHA.06.275的重鏈在7個低風(fēng)險位置或11個低+中風(fēng)險位置上被HumanEngineeredTM(人基因工程化)；輕鏈在8個低風(fēng)險位置或10個低+中風(fēng)險位置上被Human EngineeredTM((人基因工程化))。
XHA.06.642、XHA.06.275和XHA.06.983來源的Human-EngineeredTM(人基因工程化)可變區(qū)的氨基酸序列顯示在下面(下劃線部分是CDR)。這些可變區(qū)可以各種組合裝配(例如SEQ ID NO88和SEQ ID NO89；SEQ ID NO88和SEQ ID NO90；SEQ ID NO91和SEQ ID NO93；SEQ ID NO91and SEQ IDNO94；SEQ ID NO92和SEQ ID NO93；或SEQ ID NO92和SEQ ID NO94)以形成Human-EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4。
he.06.642 LC可變區(qū)低風(fēng)險(SEQ ID NO88) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASKSVSTSGYTYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDVATYYCQHSGELPPSFGQGTKLEIK he.06.642 HC可變區(qū)低風(fēng)險(SEQ ID NO89) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSSYGMSWVRQAPGKRLEWVATVSSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCARHRGNYYATYYYAMDYWGQGTLVTVSS he.06.642 HC可變區(qū)低風(fēng)險+中風(fēng)險(SEQ ID NO90) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRGNYYATYYYAMDYWGQGTLVTVSS he.06.275 LC可變區(qū)低風(fēng)險(SEQ ID NO91) DVQITQSPSSLSASPGDRITLTCRASKNIYKYLAWYQEKPGKTNNLLIYSGSTLHSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAMYYCQQHNDYPYTFGQGTKLEIK he.06.275 LC可變區(qū)低風(fēng)險+中風(fēng)險(SEQ ID NO92) DVQITQSPSSLSASPGDRITLTCRASKNIYKYLAWYQEKPGKANKLLIYSGSTLHSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAMYYCQQHNDYPYTFGQGTKLEIK he.06.275 HC可變區(qū)低風(fēng)險(SEQ ID NO93) DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTATYFCARDYGYVFDYWGQGTTLTVSS he.06.275 HC可變區(qū)低風(fēng)險+中風(fēng)險(SEQ ID NO94) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTAVYFCARDYGYVFDYWGQGTTLTVSS he.06.983 LC可變區(qū)低風(fēng)險(SEQ ID NO95) DIVMTQSPDSLAVSAGERVTINCKASQGVSNDVAWFQQKPGQSPKLLIYSASTRYTGVPDRLSGSGSGTDFTFTISSVQAEDVAVYFCQQDYTSPTFGQGTKLEIK he.06.983 LC可變區(qū)低風(fēng)險+中風(fēng)險(SEQ ID NO96) DIVMTQSPDSLAVSLGERVTINCKASQGVSNDVAWFQQKPGQSPKLLIYSASTRESGVPDRLSGSGSGTDFTFTISSVQAEDVAVYFCQQDYTSPTFGQGTKLEIK he.06.983 HC可變區(qū)低風(fēng)險(SEQ ID NO97) DVQLVESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFAFSSFGMQWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRSGRDYWGQGTLVTVSS he.06.983 HC可變區(qū)低風(fēng)險+中風(fēng)險(SEQ ID NO98) EVQLVESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFAFSSFGMQWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNPKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRSGRDYWGQGTLVTVSS 實施例12 he.06.642和he.06.275抗體的表達及純化 Human EngineeredTM(人基因工程化)he.06.642和he.06.275輕鏈和重鏈可變區(qū)與人κ和γ-1或γ-2恒定區(qū)分別連接。然后將重鏈和輕鏈基因連接到強啟動子和有效的3’非翻譯區(qū)上并克隆到包含EB病毒復(fù)制起點的瞬時表達載體內(nèi)。
抗體在HEK293細胞內(nèi)瞬時表達，使用的質(zhì)粒分別編碼抗體重鏈和輕鏈序列，其中重鏈和輕鏈序列是各種低風(fēng)險或低風(fēng)險+中風(fēng)險的組合，如實施例10所述。重鏈∶輕鏈DNA的比例等于1∶2。利用PEI轉(zhuǎn)染細胞，DNA∶PEI等于1∶2，DNA的濃度為1ug/mL。細胞密度為8e5細胞/mL。DNA利用標準恰根(Qiagen)試劑盒制備。表達培養(yǎng)物在包含IS293培養(yǎng)基(伊耳文科技公司(IrvineScientific))+1％低Ig FBS(海克隆公司(Hyclone))的2 L培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每瓶含400mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37C、5％CO2、90-95 RPM搖動。培養(yǎng)5-7天后，收獲培養(yǎng)基，澄清后用于純化上樣。
上述抗體的嵌合形式和Human EngineeredTM形式(人基因工程化形式)的純化通過一步就可以完成，只需使瞬時表達培養(yǎng)物上清直接通過重組蛋白A快速流動色譜柱(GE健康護理公司)就可以。用pH3.5的0.1mM甘氨酸洗脫主要的峰?；旌鲜占姆逶赑BS中透析，利用標稱截止分子量為30kD的離心濃縮機濃縮蛋白。最終的純度可達95％以上，總收率約為60％。利用Endosafe PTS LAL單元(查爾斯河公司(Charles River))或QCL-1000顯色LAL終點試驗(QCL-1000Chromogenic LAL Endpoint Assay)(隆薩公司(Lonza))分析最終混合物中的內(nèi)毒素，結(jié)果顯示所有抗體的內(nèi)毒素含量都小于0.05EU/mg(在檢測限以下)。通過在Superdex 200 10/300 GL色譜柱(GE健康護理公司)上進行SEC來確定嵌合抗體he.06.642-2的凝集狀態(tài)，結(jié)果顯示這個抗體是單體。
通過一個層析步驟和透析進行緩沖交換可以使chXHA.06.642的純度達到95％以上。chXHA.06.642在PBS中是可溶性的，濃度為3mg/mL，通過分子排阻層析檢測發(fā)現(xiàn)其中基本不含雜質(zhì)或凝集物。
通過流式細胞術(shù)檢測人基因工程抗人PRLR抗體 收獲CHO-K1親本細胞和表達人促乳素受體(PRLR)的細胞，離心然后懸浮到含2％FBS和0.1％疊氮鈉的1×PBS(FACS緩沖液)中，細胞濃度約為5x106/ml。人基因工程抗人PRLR抗體和抗KLH同種型對照抗體用FACS緩沖液稀釋到2×終濃度，并加到適當?shù)臉悠房字?50ml/孔)。二抗對照和自發(fā)熒光對照孔內(nèi)也加入50ml FACS緩沖液。每個樣品孔加入50ml細胞懸液。樣品在4℃孵育1小時，用2×冷FACS緩沖液洗滌，然后重懸到包含PE標記的羊抗人IgG(賓西法尼亞州西樹林的杰克遜免疫研究公司(JacksonImmunoresearch，West Grove，PA))的FACS緩沖液中，以1∶100稀釋。在4℃孵育30分鐘后，用2X冷FACS緩沖液洗滌，然后重懸到含1mg/ml碘化丙啶(因維曲根公司，圣地亞哥，加州)的FACS緩沖液中，通過流式細胞儀分析。如表7所示，抗PRLR抗體可結(jié)合PRLR表達細胞，但是不結(jié)合親本細胞。
表8
實施例13 Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)的親和力 通過Biacore分析確定嵌合抗體和Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)的親和力。蛋白A/G(皮爾斯公司)通過NHS/EDC固定在CM5傳感器芯片(Biacore)上，用于捕獲芯片表面上約600RU的抗體。從5ug/ml(185nM)開始以1∶5的比例連續(xù)稀釋到0.3nM，得到5個濃度的PRLR ECD，以動態(tài)滴定注射模式從最低濃度到最高濃度注射，收集15分鐘的解離數(shù)據(jù)。試驗設(shè)雙參照，即自動扣減相鄰流動細胞反應(yīng)(adjacent flow cell response)，從試驗數(shù)據(jù)組減去緩沖液注射試驗的反應(yīng)。通過擬合成1∶1朗繆爾模型來確定動態(tài)的和衍生的參數(shù)(ka、kd和KD)，擬合采用動態(tài)滴定注射模式定制的BiaEval軟件進行?？谷撕投涛埠颬RLR的ECD的嵌合抗體和所有Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)的親和力測定數(shù)據(jù)總結(jié)在表9和表10中。
表8 表10 為了利用共價固定的抗體比較大鼠和小鼠的交叉反應(yīng)，按照

公司推薦的方法通過標準EDC-NHS胺偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)將he.06.642-2和he.06.275-4抗體偶聯(lián)到CM4芯片上。注射5個濃度的PRLR的ECD，這5個濃度是以111nM開始，以1∶3的比例連續(xù)稀釋到1.37nM得到的。用pH3.0的甘氨酸再生。XHA.06.642和XHA.06.275的所有HE突變體的親和力與親本嵌合抗體的親和力非常相似?？贵whe.06.642-2與人、小鼠和大鼠PRLR結(jié)合的親和力相同。其與短尾猴PRLR結(jié)合的親和力比與人PRLR結(jié)合的親和力低15倍?？贵whe.06.275-4與短尾猴PRLR結(jié)合的親和力比與人PRLR結(jié)合的親和力低5倍?？贵whe.06.275-4不能有效結(jié)合小鼠或大鼠PRLR。這些數(shù)據(jù)總結(jié)在表11中。
表10-某些HE突變體與共價固定的抗體的交叉特異性親和力分析 he.06.642-2結(jié)果 短尾猴KD/人KD＝15 小鼠KD/人KD＝1 大鼠KD/人KD＝0.75 he.06.275-4結(jié)果 短尾猴KD/人KD＝5 小鼠KD/人KD＝13,548 大鼠KD/人KD＝ 實施例14 抑制BaF/PRLR細胞的增殖和存活以及抑制PRLR-誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化 分析嵌合單克隆抗體抑制BaF/PRLR細胞增殖和存活的能力[圖11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有被測嵌合抗體都保留了其相應(yīng)雜交瘤克隆的潛能。事實上，這個試驗的結(jié)果表明XHA.06.642和XHA.06.275在嵌合后獲得了這種潛能。為了分析嵌合抗體在人乳腺癌模型中的PRLR信號中和能力，在用PRL刺激前先用1ug/ml mAb處理T47D細胞30分鐘。同時，其他細胞樣品只與抗體共孵育以檢測候選抗體通過嵌合所獲得的潛在激動作用。如圖12所示，所有的嵌合抗體都保留了其阻斷T47D細胞內(nèi)PRL誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，但是只有chXHA.06.983可以檢測到對PRLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的誘導(dǎo)作用(雖然很弱，但是確實是具有重現(xiàn)性的效應(yīng))，其表現(xiàn)為磷酸-PRLR和磷酸-Stat5。
抗體對ERK1/2磷酸化的效應(yīng)的測定 按照下文和上述實施例5的描述檢測篩選出的Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)抑制PRLR誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化的能力。
血清饑餓5小時后，T47D細胞接著到包含完全生長培養(yǎng)基的微孔滴定板中，37℃孵育24小時。細胞用于磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，與抗體在37℃共孵育30分鐘，其中抗體用包含0.1％BSA的無血清培養(yǎng)基稀釋。抗體的終濃度為40ug/ml。去除培養(yǎng)基，添加終濃度為30ng/ml的用含0.1％BSA的無血清培養(yǎng)基稀釋的促乳素。細胞與促乳素在37℃共孵育30分鐘，然后用冰預(yù)冷的PBS洗滌兩次。加入包含去污劑、螯合劑和各種蛋白酶以及磷酸酶抑制劑的標準裂解緩沖液以制備細胞裂解物。按照R&D系統(tǒng)公司的

IC磷酸-ERK1/ERK2的說明書利用標準ELISA測定磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)的水平。典型試驗的結(jié)果顯示在圖13中。
實施例15 A.候選單克隆抗體介導(dǎo)的抗PRLR表達靶細胞ADCC的能力 抗PRLR單克隆抗體的預(yù)期機制之一是能夠介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)。為了分析候選抗體的ADCC能力，T47細胞作為表達PRLR的乳腺上皮靶細胞。如圖14所示，兩種嵌合的抗PRLR單克隆抗體能夠誘導(dǎo)由純化的人NK細胞介導(dǎo)的ADCC。試驗證明chXHA.06.275在4小時內(nèi)可特異性誘導(dǎo)殺傷約30％的靶細胞。由于chXHA.06.642的制備時間延遲，因此這個候選抗體并沒有包括在最初的ADCC試驗中。
B.抗PRLR抗體對細胞因子表達水平的影響 利用乳腺癌細胞檢測了PRL調(diào)控的細胞因子。在這個試驗中，MCF7或T47D細胞與PRL共孵育48小時，其中添加或不添加chXHA.06.642。利用MS診斷試劑公司(MesoScale Diagnostics)的多層夾心免疫分析試驗測定chXHA.06.642對PRL調(diào)節(jié)的潛在細胞因子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRL可誘導(dǎo)T47D細胞分泌VEGF，但是這個效應(yīng)可被抗體chXHA.06.642完全阻斷。在這些試驗中沒有檢測到PRL或抗PRLR單克隆抗體對IL-

IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、p70、IFN-γ或TNF-α的明顯調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果說明PRL/PRLR通路可能對血管發(fā)生以及乳腺癌的細胞生長和存活有影響，抑制這種VEGF調(diào)節(jié)通路可能是抗PRLR治療性抗體的另一種潛在體內(nèi)作用機制。
C.利用抗PRLR單克隆抗體和化療藥物在體外進行組合試驗 由于存在抗PRLR治療性抗體與細胞毒藥物治療方案組合應(yīng)用于臨床的可能性，因此需要分析這種組合治療方法對培養(yǎng)細胞的存活能力的效應(yīng)。為達到此目的，BaF3/PRLR細胞用各種濃度的chXHA.06.642或chXHA.06.275以及化療藥物處理5天，然后利用CellTiter Glo測定細胞的存活能力，以細胞數(shù)為指標。下面一組臨床相關(guān)和機制各異(mechanistically diverse)的細胞毒藥物用于這個試驗阿霉素(蒽環(huán)類拓撲異構(gòu)酶II抑制劑)、紫杉醇(微管穩(wěn)定劑)、氟達拉濱(抗代謝藥)和順鉑(以鉑為基礎(chǔ)的DNA交聯(lián)藥)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)chXHA.06.275和chXHA.06.642與阿霉素有協(xié)同效應(yīng)，可增加BaF/PRLR細胞的死亡，其中chXHA.06.642的作用更明顯[參見圖15]。添加或不添加抗PRLR單克隆抗體chXHA.06.642和chXHA.06.275的化療IC50值之間的差異顯示在表11中。
表11 D.抗PRLR單克隆抗體的抗PRLR功能活性 利用靶調(diào)節(jié)和細胞增殖試驗評價抗體。圖16顯示的是兩個濃度的chXHA.06.642和Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)he.06.642-1及he.06.642-2在T47D細胞內(nèi)PRL誘導(dǎo)的Stat5磷酸化的影響。兩個濃度的抗體都具有很強的拮抗活性，結(jié)果表現(xiàn)為p-Stat5信號完全被抑制。另外，所有抗體都沒有激動活性，僅用單克隆抗體處理的細胞也是如此。chXHA.06.275突變體也得到了相似的結(jié)果。因此，Human EngineeringTM(人基因工程化)不會對這些抗體的整體拮抗或激動特性產(chǎn)生影響。
BaF/PRLR細胞增殖試驗用于確定抗PRLR嵌合抗體和HumanEngineeredTM抗體(人基因工程抗體)的相對IC50值[參見圖17]。這些試驗的結(jié)果表明，所有Human EngineeredTM抗體(人基因工程抗體)都與其小鼠對應(yīng)物的能力相似。
實施例16 在Nb2-C11大鼠淋巴瘤模型中評價抗PRLR抗體的抗腫瘤活性 在Nb2-C11腫瘤異種移植物模型中用chXHA.06.642進行單劑量PD試驗以確定抗PRLR單克隆抗體釋放能夠作用于腫瘤并阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?？贵wchXHA.06.642用于此試驗是基于它與大鼠PRLR的親和力(如上所述)。監(jiān)測的PD標志物是p-STAT5，這是PRLR信號途徑的一個下游介質(zhì)，利用免疫印跡或IHC方法可檢測該物質(zhì)。由于Nb2-C11腫瘤異種移植物中的基礎(chǔ)p-STAT5水平太低，難以檢測，因此小鼠要用外源的羊(o)PRL刺激以提高基礎(chǔ)p-STAT5水平，這樣可以提供一個更合適的動態(tài)范圍。
通過蛋白質(zhì)印跡和IHC試驗檢測攜帶Nb2-C11腫瘤的小鼠體內(nèi)的p-STAT5，并且比較注射羊PRL和注射鹽水的動物之間的差異[參見圖18A和B]。結(jié)果顯示，在oPRL注射前48小時用10mg/kg chXHA.06.642處理小鼠可抑制p-STAT5，但是用KLH IgG1處理的對照動物卻沒有出現(xiàn)這種結(jié)果。
為了確定PRLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制是否與Nb2-C11腫瘤生長的抑制相關(guān)，通過每周一次給予chXHA.06.642進行多劑量效應(yīng)研究[參見圖19A和B]。在細胞植入后4天(腫瘤生長到可觸及前)開始給予10mg/kg的chXHA.06.642或KLH IgG1或者鹽水對照。腹膜內(nèi)注射單克隆抗體，每周一次，連續(xù)四周。模型采用條件存活或發(fā)展到終點的時間來評價，由于這些腫瘤侵入肌肉而難以用卡鉗準確測量。chXHA.06.642處理組的某些腫瘤直到植入后約11周也未檢測到(第四次注射單克隆抗體后7.5周)，但是這個組的15只動物中有兩只因腫瘤而死亡。鹽水和KLH IgG1對照處理組的中位存活時間為細胞植入后20天(p＜0.0001)，在此時動物因腫瘤負荷過大而被處死。chXHA.06.642處理組的動物體重增加，而對照動物體重未增加或有下降，可能是因為疾病負擔(dān)造成的。
這個試驗還包括第二功效評定分支(second efficacy arm)，其中，在細胞植入后12天加入已建立腫瘤的動物[參見圖20A和B]。在開始給藥時腫瘤平均體積為135mm3。動物腹膜內(nèi)注射10mg/kg chXHA.06.642，每周一次，或KLHIgG1對照抗體共兩次。第二次給藥后兩天(植入后3周)腫瘤被完全抑制。但是，大約兩周后腫瘤在小鼠體內(nèi)又重新出現(xiàn)。與此相比，KLH IgG1對照動物有很大的腫瘤負荷，腫瘤平均體積超過600mm3。由于這些腫瘤直接長入肌肉，腫瘤平均體積可能比卡鉗記錄的還要大。鹽水組和KLH IgG1組的平均存活時間為細胞植入后23天(p＝0＜0.0001)。在這個初步試驗中，chXHA.06.642處理組的動物體重增加，而對照組的動物體重不變或下降。因此，chXHA.06.642mAb不僅可以有效抑制低數(shù)目的腫瘤細胞(植入后治療開始4天)，而且能夠完全抑制已建立超過兩周的侵襲性Nb2-C11腫瘤。
Nb2-C11模型證明抗PRLR單克隆抗體能夠有效靶向到體內(nèi)的表達靶抗原的腫瘤，抑制腫瘤內(nèi)PLR啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及誘導(dǎo)腫瘤負荷出現(xiàn)可測量的結(jié)果，即使動物已經(jīng)建立了侵襲性的腫瘤。
實施例17 PD評價所用的人乳腺癌T47D模型 利用乳腺癌T47D細胞和實施例16檢測的抗體chXHA.06.642A進行體內(nèi)單劑量PD研究。利用體內(nèi)試驗評價oPRL刺激PRLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力以及chXHA.06.642抑制這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。植入腫瘤的動物腹膜內(nèi)注射鹽水、KLH IgG1對照單克隆抗體或chXHA.06.642，48小時后通過單次快速注射給予鹽水或20ug oPRL。40分鐘后收取腫瘤組織。通過蛋白質(zhì)印跡分析發(fā)現(xiàn)，oPRL處理動物的腫瘤內(nèi)可以看到明顯的p-STAT5，但是鹽水對照組動物的腫瘤沒有觀察到，雖然IHC分析的結(jié)果有些小的不同(圖21)。oPRL體內(nèi)刺激不會升高p-AKT和p-ERK的水平。有意義的是，用chXHA.06.642而不是KLH IgG1對照抗體處理可強烈抑制oPRL注射后誘導(dǎo)的p-STAT5。IHC分析的結(jié)果通常與此結(jié)果一致。蛋白質(zhì)印跡和IHC分析的結(jié)果都證明，所有4只chXHA.06.642處理動物的腫瘤內(nèi)的p-STAT5都被抑制。
實施例18 PRLR表達以及PRLR表達與ER和Her2-neu表達的關(guān)系 通過RT-PCR定量檢測發(fā)現(xiàn)，在正常組織中，PRLR的表達水平在乳腺和子宮中最高，隨后是腎、肝臟、前列腺和卵巢。氣管、腦和肺中的PRLR mRNA的水平最低(Pierce SK，等，J Endocr；171(1)R1-R4(2001))。
免疫組化(IHC)分析按如下方法進行。取自癌癥患者的冷凍組織樣品放入最佳切割溫度(OCT)化合物中，在含干冰的異戊醇中快速冷凍。用Leica 3050CM微切皮機(mictrotome)將樣品切成5μm厚的冷凍切片，并融裱在vectabound-包被的玻片上。切片用-20℃的乙醇固定，室溫下過夜使其干燥。固定的切片儲存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ〕鼋M織切片，首先放入封閉緩沖液(PBS，5％正常羊血清，0.1％吐溫20)中，室溫放置30分鐘，然后與封閉緩沖液稀釋的癌癥相關(guān)蛋白特異性單克隆抗體和對照單克隆抗體(1μg/ml)共孵育120分鐘。切片用封閉緩沖液洗滌三次。用羊抗鼠IgG+IgM(H+L)F(ab’)2-過氧化物酶和0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.05)溶解的過氧化物酶底物二氨基聯(lián)苯(1mg/ml，西格瑪(Sigma)，目錄號D 5637)以及0.003％過氧化氫(西格瑪，目錄號H1009)檢測結(jié)合的單克隆抗體。染色的玻片用蘇木精反染色，然后在尼康顯微鏡下觀察。
抗癌癥相關(guān)蛋白(抗原)的單克隆抗體用于檢測與不同類型的組織來源的各種細胞系的反應(yīng)性。不用蛋白酶消化從生長表面上取下不同確立細胞系來源的細胞，包裹后包埋到OCT化合物中。細胞冷凍后切片，然后用標準IHC方法染色。CellArrayTM技術(shù)見于WO 01/43869的描述。手術(shù)切除得到的正常組織(人)冷凍并包埋。用Leica 3050 CM微切皮機將樣品切成5μm厚的冷凍切片，并融裱在vectabound-包被的玻片上。切片用-20℃的乙醇固定，室溫下過夜使其干燥。PolyMICATM檢測試劑盒用于確定癌癥相關(guān)抗原特異性單克隆抗體與正常組織的結(jié)合。初級單克隆抗體的使用終濃度為1μg/ml。
為了檢測PRLR的表達水平及其與ER和Her2-neuB表達的關(guān)系，利用免疫組化(IHC)技術(shù)分析122個侵潤性乳腺癌患者的標本。總之，62/122(50％)的樣品表達PRLR，58/122(47％)表達ER，32/122(26％)表達Her2-neu。96(78％)個樣品是侵潤性導(dǎo)管癌，其中有48(50％)個表達PRLR。在這些樣品中，24/48(50％)也表達ER，13/48(26％)也表達Her2-neu。
上述所有美國專利、美國專利申請出版物、美國專利申請、外國專利、外國專利申請以及本說明書參考的和/或申請書數(shù)據(jù)表中所列的非專利出版物都已完整納入作為參考。
從上文可以看出，雖然本文為了闡述本發(fā)明已經(jīng)描述了本發(fā)明的特殊實施方式，但是只要不偏離本發(fā)明的精神和范圍可以作出各種改變。
序列表
<110>貝丁格爾(Bedinger)等
<120>PRLR特異性抗體及其用途
<130>27527/43177
<150>60/838648
<151>2006-08-18
<150>60/946360
<151>2007-06-26
<160>98
<170>PatentIn版本3.4
<210>1
<211>1846
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
atgaaggaaa atgtggcatc tgcaaccgtt ttcactctgc tactttttct caacacctgc 60
cttctgaatg gacagttacc tcctggaaaa cctgagatct ttaaatgtcg ttctcccaat 120
aaggaaacat tcacctgctg gtggaggcct gggacagatg gaggacttcc taccaattat 180
tcactgactt accacaggga aggagagaca ctcatgcatg aatgtccaga ctacataacc 240
ggtggcccca actcctgcca ctttggcaag cagtacacct ccatgtggag gacatacatc 300
atgatggtca atgccactaa ccagatggga agcagtttct cggatgaact ttatgtggac 360
gtgacttaca tagttcagcc agaccctcct ttggagctgg ctgtggaagt aaaacagcca 420
gaagacagaa aaccctacct gtggattaaa tggtctccac ctaccctgat tgacttaaaa 480
actggttggt tcacgctcct gtatgaaatt cgattaaaac ccgagaaagc agctgagtgg 540
gagatccatt ttgctgggca gcaaacagag tttaagattc tcagcctaca tccaggacag 600
aaataccttg tccaggttcg ctgcaaacca gaccatggat actggagtgc atggagtcca 660
gcgaccttca ttcagatacc tagtgacttc accatgaatg atacaaccgt gtggatctct 720
gtggctgtcc tttctgctgt catctgtttg attattgtct gggcagtggc tttgaagggc 780
tatagcatgg tgacctgcat ctttccgcca gttcctgggc caaaaataaa aggatttgat 840
gctcatctgt tggagaaggg caagtctgaa gaactactga gtgccttggg atgccaagac 900
tttcctccca cttctgacta tgaggacttg ctggtggagt atttagaagt agatgatagt 960
gaggaccagc atctaatgtc agtccattca aaagaacacc caagtcaagg tatgaaaccc 1020
acatacctgg atcctgacac tgactcaggc cgggggagct gtgacagccc ttcccttttg 1080
tctgaaaagt gtgaggaacc ccaggccaat ccctccacat tctatgatcc tgaggtcatt 1140
gagaagccag agaatcctga aacaacccac acctgggacc cccagtgcat aagcatggaa 1200
ggcaaaatcc cctattttca tgctggtgga tccaaatgtt caacatggcc cttaccacag 1260
cccagccagc acaaccccag atcctcttac cacaatatta ctgatgtgtg tgagctggct 1320
gtgggccctg caggtgcacc ggccactctg ttgaatgaag caggtaaaga tgctttaaaa 1380
tcctctcaaa ccattaagtc tagagaagag ggaaaggcaa cccagcagag ggaggtagaa 1440
agcttccatt ctgagactga ccaggatacg ccctggctgc tgccccagga gaaaaccccc 1500
tttggctccg ctaaaccctt ggattatgtg gagattcaca aggtcaacaa agatggtgca 1560
ttatcattgc taccaaaaca gagagagaac agcggcaagc ccaagaagcc cgggactcct 1620
gagaacaata aggagtatgc caaggtgtcc ggggtcatgg ataacaacat cctggtgttg 1680
gtgccagatc cacatgctaa aaacgtggct tgctttgaag aatcagccaa agaggcccca 1740
ccatcacttg aacagaatca agctgagaaa gccctggcca acttcactgc aacatcaagc 1800
aagtgcaggc tccagctggg tggtttggat tacctggatc ccgcat 1846
<210>2
<211>622
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Lys Glu Asn Val Ala Ser Ala Thr Val Phe Thr Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Leu Asn Thr Cys Leu Leu Asn Gly Gln Leu Pro Pro Gly Lys Pro Glu
20 25 30
Ile Phe Lys Cys Arg Ser Pro Asn Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp
35 40 45
Arg Pro Gly Thr Asp Gly Gly Leu Pro Thr Asn Tyr Ser Leu Thr Tyr
50 55 60
His Arg Glu Gly Glu Thr Leu Met His Glu Cys Pro Asp Tyr Ile Thr
65 70 75 80
Gly Gly Pro Asn Ser Cys His Phe Gly Lys Gln Tyr Thr Ser Met Trp
85 90 95
Arg Thr Tyr Ile Met Met Val Asn Ala Thr Asn Gln Met Gly Ser Ser
100 105 110
Phe Ser Asp Glu Leu Tyr Val Asp Val Thr Tyr Ile Val Gln Pro Asp
115 120 125
Pro Pro Leu Glu Leu Ala Val Glu Val Lys Gln Pro Glu Asp Arg Lys
130 135 140
Pro Tyr Leu Trp Ile Lys Trp Ser Pro Pro Thr Leu Ile Asp Leu Lys
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Thr Leu Leu Tyr Glu Ile Arg Leu Lys Pro Glu Lys
165 170 175
Ala Ala Glu Trp Glu Ile His Phe Ala Gly Gln Gln Thr Glu Phe Lys
180 185 190
Ile Leu Ser Leu His Pro Gly Gln Lys Tyr Leu Val Gln Val Arg Cys
195 200 205
Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser Ala Trp Ser Pro Ala Thr Phe Ile
210 215 220
Gln Ile Pro Ser Asp Phe Thr Met Asn Asp Thr Thr Val Trp Ile Ser
225 230 235 240
Val Ala Val Leu Ser Ala Val Ile Cys Leu Ile Ile Val Trp Ala Val
245 250 255
Ala Leu Lys Gly Tyr Ser Met Val Thr Cys Ile Phe Pro Pro Val Pro
260 265 270
Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Ala His Leu Leu Glu Lys Gly Lys
275 280 285
Ser Glu Glu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Cys Gln Asp Phe Pro Pro Thr
290 295 300
Ser Asp Tyr Glu Asp Leu Leu Val Glu Tyr Leu Glu Val Asp Asp Ser
305 310 315 320
Glu Asp Gln His Leu Met Ser Val His Ser Lys Glu His Pro Ser Gln
325 330 335
Gly Met Lys Pro Thr Tyr Leu Asp Pro Asp Thr Asp Ser Gly Arg Gly
340 345 350
Ser Cys Asp Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Lys Cys Glu Glu Pro Gln
355 360 365
Ala Asn Pro Ser Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Val Ile Glu Lys Pro Glu
370 375 380
Asn Pro Glu Thr Thr His Thr Trp Asp Pro Gln Cys Ile Ser Met Glu
385 390 395 400
Gly Lys Ile Pro Tyr Phe His Ala Gly Gly Ser Lys Cys Ser Thr Trp
405 410 415
Pro Leu Pro Gln Pro Ser Gln His Asn Pro Arg Ser Ser Tyr His Asn
420 425 430
Ile Thr Asp Val Cys Glu Leu Ala Val Gly Pro Ala Gly Ala Pro Ala
435 440 445
Thr Leu Leu Asn Glu Ala Gly Lys Asp Ala Leu Lys Ser Ser Gln Thr
450 455 460
Ile Lys Ser Arg Glu Glu Gly Lys Ala Thr Gln Gln Arg Glu Val Glu
465 470 475 480
Ser Phe His Ser Glu Thr Asp Gln Asp Thr Pro Trp Leu Leu Pro Gln
485 490 495
Glu Lys Thr Pro Phe Gly Ser Ala Lys Pro Leu Asp Tyr Val Glu Ile
500 505 510
His Lys Val Asn Lys Asp Gly Ala Leu Ser Leu Leu Pro Lys Gln Arg
515 520 525
Glu Asn Ser Gly Lys Pro Lys Lys Pro Gly Thr Pro Glu Asn Asn Lys
530 535 540
Glu Tyr Ala Lys Val Ser Gly Val Met Asp Asn Asn Ile Leu Val Leu
545 550 555 560
Val Pro Asp Pro His Ala Lys Asn Val Ala Cys Phe Glu Glu Ser Ala
565 570 575
Lys Glu Ala Pro Pro Ser Leu Glu Gln Asn Gln Ala Glu Lys Ala Leu
580 585 590
Ala Asn Phe Thr Ala Thr Ser Ser Lys Cys Arg Leu Gln Leu Gly Gly
595 600 605
Leu Asp Tyr Leu Asp Pro Ala Cys Phe Thr His Ser Phe His
610 615 620
<210>3
<211>70
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggctac gaaggagata tacatatgaa ggaaaatgtg60
gcatctgcaa 70
<210>4
<211>79
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
gggaccactt tgtacaagaa agctgggttt aagctccgtg atggtgatgg tgatgtgctc60
catcattcat ggtgaagtc 79
<210>5
<211>48
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggcttc gaaggagata gaaccatg 48
<210>6
<211>50
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
caggcttcga aggagataga accatgaagg aaaatgtggc atctgcaacc 50
<210>7
<211>49
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
gaaggaaaat gtggcatctg caaccgtttt cactctgcta ctttttctc 49
<210>8
<211>50
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
cgttttcact ctgctacttt ttctcaacac ctgccttctg aatggaggag 50
<210>9
<211>50
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
caacacctgc cttctgaatg gaggagcaca tcaccatcac catcacggag 50
<210>10
<211>50
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
cacatcacca tcaccatcac ggagctcagt tacctcctgg aaaacctgag 50
<210>11
<211>55
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>11
gggaccactt tgtacaagaa agctgggttc actgaactat gtaagtcacg tccac55
<210>12
<211>48
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggcttc gaaggagata gaaccatg 48
<210>13
<211>50
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>13
caggcttcga aggagataga accatgaagg aaaatgtggc atctgcaacc 50
<210>14
<211>49
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>14
gaaggaaaat gtggcatctg caaccgtttt cactctgcta ctttttctc 49
<210>15
<211>48
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>15
cgttttcact ctgctacttt ttctcaacac ctgccttctg aatgttca48
<210>16
<211>49
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>16
tctcaacacc tgccttctga atgttcagcc agaccctcct ttggagctg49
<210>17
<211>49
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
cgtgatggtg atggtgatgt gctccatcat tcatggtgaa gtcactagg49
<210>18
<211>47
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>18
caagaaagct gggtttaagc tccgtgatgg tgatggtgat gtgctcc 47
<210>19
<211>37
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
gggaccactt tgtacaagaa agctgggttt aagctcc 37
<210>20
<211>115
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Pro Val Val Val Ala Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val
115
<210>21
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>21
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>22
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ser Ser Thr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val
<210>23
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(84)..(84)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<400>23
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Tyr Arg Arg Pro Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Xaa Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Gly Arg Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>24
<211>113
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Val Val Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val
<210>25
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>26
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Pro Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asn Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ala
100 105 110
Thr Val
<210>27
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>27
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ala Trp Asp Asp Thr Leu
85 90 95
Asn Gly Pro His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>28
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Ser Ser Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val
115
<210>29
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>30
<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Arg Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Asn Trp Thr His Ala Leu Gly Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
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115
<210>31
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>31
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1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gly Trp Asp Gly Arg Leu
85 90 95
Ile Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>32
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Val Thr Val
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
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20 25 30
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
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Thr Val
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<213>智人(Homo sapiens)
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
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<213>智人(Homo sapiens)
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<213>智人(Homo sapiens)
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>40
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<213>智人(Homo sapiens)
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>44
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100 105 110
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>45
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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
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Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>46
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Gly
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Thr Val
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>47
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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100 105 110
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<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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100 105 110
<210>49
<211>108
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>49
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1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
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50 55 60
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Trp Val Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<210>50
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Ser
20 25 30
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Ala Arg Gly Ala Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val
<210>51
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>51
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Thr Ser Ser Ile Gly Ser Asn
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Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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<210>52
<211>118
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<210>53
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>53
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<210>54
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(103)..(103)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<400>54
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Leu Val Thr Val
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<210>55
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>55
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<210>56
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>56
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<210>57
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>57
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<210>58
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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100 105 110
<210>59
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>59
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
<210>60
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
<210>61
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>61
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Leu Ser Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<210>62
<211>118
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Gly Gln Gln Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
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<212>PRT
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65 70 75 80
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<212>PRT
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<400>64
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>66
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<220>
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<213>智人(Homo sapiens)
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>77
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>78
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>79
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<211>399
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
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atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>82
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
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<213>智人(Homo sapiens)
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Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ser Ser
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>84
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
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Glu Thr Ile Thr Leu Asn Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Tyr Lys Tyr
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<213>智人(Homo sapiens)
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Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
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Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>86
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Ala
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<400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
l 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
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Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>88
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
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Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
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115 120
<210>90
<211>124
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>91
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Tyr Lys Tyr
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Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Asp Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>92
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>92
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Tyr Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu His Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Asp Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>93
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>93
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>94
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>95
<211>106
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>95
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>96
<211>106
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>96
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>97
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>97
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210>98
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
權(quán)利要求
1.以10-6M或更低平衡解離常數(shù)(KD)與PRLR胞外域結(jié)合并與下列任一抗體競爭結(jié)合75％以上PRLR的抗體chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。
2.如權(quán)利要求1所述的與下列任一抗體結(jié)合PRLR的相同表位的抗體chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。
3.包含下列任一抗體的1、2、3、4、5或6個CDR的抗體chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體、人基因工程抗體、人抗體、單鏈抗體或抗體片段。
5.如上述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其特征在于，所述CDR內(nèi)的至少一個氨基酸被另一抗PRLR抗體的相應(yīng)CDR的相應(yīng)殘基取代。
6.如上述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其特征在于，所述CDR內(nèi)的一個或兩個氨基酸是經(jīng)過修飾的。
7.如上述權(quán)利要求中任一項所述的與下列抗體的輕鏈或重鏈可變區(qū)有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％一致性的抗體chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。
8.如上述權(quán)利要求中任一項所述的包含人抗體序列的恒定區(qū)和人抗體序列的一個或多個重鏈和輕鏈可變框架區(qū)的抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的抗體，其特征在于，所述人抗體序列是個體人序列、人共有序列、個體人種系序列或人共有種系序列。
10.如上述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其特征在于，所述重鏈恒定區(qū)是修飾的或未修飾的IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、其片段或其組合。
11.如權(quán)利要求10所述的抗體，其特征在于，所述重鏈恒定區(qū)是修飾的或未修飾的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
12.如上述權(quán)利要求中任一項所述的與PRLR的平衡解離常數(shù)為10-6、10-7、10-8或10-9M或更低的抗體。
13.如上述權(quán)利要求中任一項所述的CDR內(nèi)包含保守取代的抗體。
14.如上述權(quán)利要求中任一項所述的在低風(fēng)險和中風(fēng)險殘基上包含保守性或非保守性改變的抗體。
15.如上述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其特征在于，所述輕鏈恒定區(qū)是修飾的或未修飾的λ輕鏈恒定區(qū)、κ輕鏈恒定區(qū)、其片段或其組合。
16.如上述權(quán)利要求中任一項所述的可抑制PRLR二聚化的抗體。
17.如上述權(quán)利要求中任一項所述的可抑制PRLR胞內(nèi)磷酸化的抗體。
18.如上述權(quán)利要求中任一項所述的可抑制MAPK磷酸化的誘導(dǎo)的抗體。
19.如上述權(quán)利要求中任一項所述的可抑制Stat5磷酸化的誘導(dǎo)的抗體。
20.如上述權(quán)利要求中任一項所述的可抑制AKT磷酸化的誘導(dǎo)的抗體。
21.如上述權(quán)利要求中任一項所述的可抑制PRL與PRLR結(jié)合的抗體。
22.如上述權(quán)利要求中任一項所述的可抑制VEGF產(chǎn)生和/或血管發(fā)生的抗體。
23.如上述權(quán)利要求中任一項所述的可抑制癌細胞增殖的抗體。
24.如權(quán)利要求23所述的可抑制乳腺癌、前列腺癌或肺癌細胞增殖的抗體。
25.如上述權(quán)利要求中任一項所述的與另一診斷或治療劑結(jié)合的抗體。
26.一種篩選可與PRLR蛋白的胞外域結(jié)合用于治療癌癥的抗體的方法，該方法包括以下步驟
使包含PRLR的ECD的多肽與包含下列抗體的至少1、2、3、4、5或6個CDR的候選抗體接觸chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189和XHA.06.907；
檢測候選抗體與多肽的結(jié)合親和力，以及
如果測得平衡解離常數(shù)為10-6M或更低則所述候選抗體被鑒定為可用于治療癌癥的抗體。
27.一種系統(tǒng)改變抗體和篩選抗PRLR蛋白胞外域的抗體的方法，其中的抗體可用于治療癌癥，該方法包括以下步驟
制備候選抗體，其中的候選抗體在以下抗體的CDR內(nèi)的一個或兩個氨基酸上包含修飾chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189和XHA.06.907，
使包含PRLR的ECD的多肽與所述候選抗體接觸，
檢測候選抗體與多肽的結(jié)合親和力，以及
如果測得平衡解離常數(shù)為10-6M或更低則所述的候選抗體可被鑒定為可用于治療癌癥的抗體。
28.一種篩選用于治療癌癥的抗PRLR蛋白胞外域的抗體的方法，該方法包括以下步驟
使乳腺、肺或前列腺細胞與候選抗體接觸，其中的候選抗體包含如下抗體的至少1、2、3、4、5或6個CDR或在一個或多個CDR內(nèi)有一個或兩個氨基酸修飾chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189和XHA.06.907；
檢測所述細胞的增殖或存活能力；以及
如果檢測到細胞增殖和存活能力下降則所述候選抗體可被鑒定為可用于治療癌癥的抗體。
29.一種治療癌癥患者的方法，該方法包括給予治療有效量的上述權(quán)利要求中任一項所述抗體的步驟。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述癌癥是乳腺癌、肺癌或前列腺癌。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，給予第二治療劑。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述第二治療劑是阿霉素或柔紅霉素。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述抗體是chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述對象的PRLR表達和HER2-neu表達是陽性的，其中所述第二治療劑是抗Her2-neu抗體。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述對象的PRLR表達和ER表達是陽性的，以及其中第二治療劑是抗ER抗體。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述對象還通過放療或手術(shù)治療。
37.一種靶向表達PRLR的腫瘤細胞的方法，該方法包括給予上述權(quán)利要求中任一項所述的與放射性核素或其他毒素偶聯(lián)的抗體的步驟。
38.如權(quán)利要求30-37所述的方法，其特征在于，所述對象是哺乳動物。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述對象是人。
40.一種包含核苷酸序列的游離核酸分子，其中的核苷酸序列編碼權(quán)利要求1-23中任一項所述的抗體的重鏈或輕鏈。
41.一種包含與調(diào)節(jié)控制序列可操控連接的權(quán)利要求40所述核酸分子的表達載體。
42.一種包含權(quán)利要求41所述載體或權(quán)利要求40所述核酸分子的宿主細胞。
43.一種利用權(quán)利要求42所述宿主細胞制備抗體的方法，該方法包括在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求36所述的宿主細胞以及回收所述抗體。
44.一種通過權(quán)利要求43所述方法制備的抗體。
45.如權(quán)利要求1-23或44中任一項所述的經(jīng)過純化達到按重量計至少95％同質(zhì)性的抗體。
46.一種包含權(quán)利要求45所述抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
47.一種包含上述權(quán)利要求中任一項所述抗體的試劑盒，該試劑盒包含包裝在容器內(nèi)的治療有效量的本發(fā)明的抗體，所述試劑盒任選還包含第二治療劑，以及還可以包含粘帖到容器上或者包裝進容器內(nèi)的標簽，其中標簽描述了容器的內(nèi)容物和提供了關(guān)于使用容器內(nèi)容物治療癌癥的指導(dǎo)和/或說明。
48.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述容器是藥瓶或瓶子或預(yù)裝注射器。
49.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含選自如下一組的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、82、84、86、88、91、95和96。
50.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含選自如下一組的重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO20、2、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、83、85、87、89、90、93、94、97和98。
51.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO88和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO89。
52.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO88和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO90。
53.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO91和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO93。
54.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO91和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO94。
55.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO92和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO93。
56.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO92和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO94。
57.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO95和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO97。
58.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO95和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO98。
59.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO96和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO97。
60.一種可結(jié)合PRLR胞外域的抗體，該抗體包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO96和重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO98。
61.一種可結(jié)合人PRLR胞外域的抗體，該抗體與人PRLR胞外域結(jié)合的平衡解離常數(shù)(KD)比與小鼠PRLR胞外域結(jié)合的平衡解離常數(shù)低至少10,000到15,000倍。
62.如權(quán)利要求61所述的與he.06.275-4結(jié)合相同表位的抗體。
63.一種可與人PRLR胞外域、小鼠PRLR胞外域和大鼠PRLR胞外域結(jié)合的抗體。
64.一種以10-6M或更低的平衡解離常數(shù)(KD)與人、小鼠和大鼠PRLR胞外域結(jié)合的抗體。
65.如權(quán)利要求64所述的與he.06.642-2結(jié)合相同表位的抗體。
66.一種鑒定對象是否需要用權(quán)利要求1-23和49-65中任一項所述的抗PRLR抗體進行治療的方法，該方法包括步驟
(a)從該對象獲得樣品；以及
(b)分析樣品中PRLR、Jak2、Mapk、Stat5、Erk1/2和/或Akt的磷酸化水平；
其中，PRLR、Jak2、Mapk、Stat5、Erk1/2和/或Akt的磷酸化水平是需要用抗PRLR抗體進行治療的指示劑。
67.一種監(jiān)測癌癥對象體內(nèi)的癌癥療法的方法，該方法包括步驟
(a)在開始進行癌癥療法前分析對象的第一樣品的PRLR磷酸化水平；以及
(b)在開始癌癥療法后分析第二樣品，
其中，在開始癌癥療法后磷酸化PRLR的水平降低則說明患者接受了治療有效量的癌癥療法。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述癌癥療法是權(quán)利要求1-23和49-65中任一項所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了PRLR特異性抗體和包含這種抗體的藥物組合物、包含藥物組合物的試劑盒以及預(yù)防和治療癌癥的方法。
文檔編號C12N15/13GK101611058SQ200780030284
公開日2009年12月23日 申請日期2007年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者D·貝丁格爾, J·達米昂諾, M·盧克曼, L·馬斯塔, A·莫扎, G·諾特 申請人:諾華有限公司, 愛克索馬技術(shù)有限公司