專利名稱：：用于改良纖維素的酶法水解的酶組合物和方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于水解纖維素的酶，以及使用該酶的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于酶法水解纖維素以從預處理的木質纖維素原料產生含葡萄糖的水解產物的纖維素酶和f>-葡萄糖苷酶。
背景技術：
：燃料乙醇目前是由諸如玉米淀粉、甘蔗以及甜菜的原料生產的。然而，由于大部分適合生產這些作物的農田已用作人食物的來源，由這些原料生產乙醇的可行性是有限的。再者，由于在轉化過程中使用的化石燃料會產生二氧化碳和其他副產物，由這些原料生產乙醇對環(huán)境有負面影響。由含纖維素的原料(如農業(yè)廢料、草凡沐業(yè)廢料)生產乙醇近年來已受到諸多關注。其中的原因是這些原料可大量獲得且很廉價，并且將它們用于乙醇的生產提供了除燃燒或填埋木質纖維廢料"卜的又一途徑。而且，纖維素轉化的副產品一一木質素一一可用作燃料，替代化石燃料為該過程4^供動力。多項研究已得出這樣結論，即當考慮整個生產和消費的循環(huán)時，使用由纖維素生產的乙醇產生的溫室氣體近乎為零。最有希望用于乙醇生產的木質纖維素原料包括(1)農業(yè)廢料例如玉米秸、玉米芯、玉米纖維、小麥稈、大麥稈、燕麥稈、燕麥殼、稻稈、稻殼、菜籽稈和大豆秸；(2)草例如柳枝稷(switchgrass)、芒屬(miscanthus)、大米草(cordgrass)、黑麥草(ryegrass)和草聲(reedcanarygrass);(3)林業(yè)廢料例如回收的木漿纖維、軟木、硬木和鋸屑；以及(4)糖加工過程殘渣例如甘蔗渣和甜菜廢粕。將木質纖維素原料轉化成乙醇的第一個加工步驟涉及使纖維素材料斷裂以從所述原料中釋放糖單體如葡萄糖，用以在隨后的發(fā)酵步驟中轉化成乙醇。所述兩個主要過程為酸水解，它們涉及使用單步驟的酸處理對所述原料的水解，以及酶法水解，后者涉及^理及隨后的纖維素酶水解。在所述酸水解過程中，在足以使纖維素水解為葡萄糖且使半纖維素成為7木糖和阿拉伯糖的某一溫度、酸濃度及時長下，將所述原料經過蒸汽和強酸如硫酸處理。在使用硫酸的情況下，由所述原料所在的酸化水性溶液重量中的酸重量來判定，所述酸可以是濃的(25-80%w/w)或稀的(3-8%w/w)。然后使用酵母將葡萄糖發(fā)酵成乙醇，并通過蒸餾回收并純化所述乙醇。在所述酶法水解過程中，選擇比酸水解過程中更溫和的蒸汽溫度、酸濃度和處理時間，使得隨著所述木質纖維素原料轉化成泥質大大地增大所述纖維素的表面積，樹艮少有纖維素轉化為葡萄糖。然后，在隨后使用纖維素酶的步驟中將所述預處理的纖維素水解成葡萄糖，所述蒸汽/酸處理在這種情況下被稱為預處理。在添加酶之前，將所述酸性原料的pH調節(jié)至適合于所述酶法7jc解反應的值。具體地，這涉及添加堿至約4至約6的pH，這是纖維素酶的最佳pH范圍，但如果使用嗜堿性纖維素酶，所述pH可更高。在一種類型的預處理中，由所述蒸汽產生的壓力通過噴發(fā)減壓快速地下降，這被稱為蒸汽噴發(fā)(steamexplosion)。Foody(美國專利4，461，648)描述了在蒸汽噴發(fā)預處理中使用的裝置和條件。在pH0.4至2.0下添加硫酸的蒸汽噴發(fā)已經成為標準的預處理方法有20年了。它產生均一的預處理材料，并且與其他預處理工藝相比需要更少的纖維素酶來水解纖維素。纖維素,化所述原料中的纖維素(p-1、4-D-葡聚糖銜的水解以產生諸如葡萄糖、纖維二糖及其他纖維*#產物。概括性術語纖維素酶表示包括外切纖維二糖水解酶(exo-cellobiohydrolase)(CBH)、內切葡聚糖酶(EG)和P-葡萄糖苷酶(PG)的多酶混合物，這些酶可以由許多的植物和微生物產生。纖維素酶可協同地^^作用，以將纖維素水解成葡萄糖。C朋I和CBHII通常作用于纖維素微纖維中葡萄糖聚合物的末端，釋放纖維二糖(TeeriandKoivula，Car6oAFtfr.fwo;7e，1995，12:28-33)，而所述內切葡IMtS^ft用于纖維素上的隨機位置?？傊?，這些酶將纖維素7jc解成更小的纖維S^—一主要是纖維二糖。纖維4故p-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。在iW技術中已經知道，大多數的外切纖維二糖水解酶(CBH)和內切葡聚糖酶(EG)通過糖結合模塊(CBM)如纖維素結合域(C則與所ii^料中的纖維素結合，而包括木霉P-葡萄糖苷酶和曲霉P_葡萄糖苷酶在內的大多數P-葡萄糖苷酶不具有這種結合模塊，因此被留在溶液中。纖維素酶可包含將所述催化域與所,結合模塊連接的連接區(qū)。所iti^接區(qū)被認為有利于所述催化活性域的活性。具有CBD的纖維素酶已經通過遺傳工程產生。例如，美國專利5，763,254(W6ldikeWa7.)公開了這樣的遺傳工程的纖維素降解酶的生產，8即該S^f生自腐質霉(flw附/o/a)、鐮刀菌(F附flr/iwi)和毀絲審(Myce/iV/;幼wYi)并包含糖結合域。該研究的目標;U所述催化活性域、所述交聯區(qū)和所述CBD的新組合產生降解纖維素或半纖維素的酶,或者從那些缺乏CBD的酶產生具有CBD的降解纖維素或半纖維素的酶。然而，這些新型酶降解木質纖維素原料的能力沒有^_證實。酶法水解方法的一個重要的問^A需要大量的纖維素酶，這增加該方法的成本。纖維素酶的費用占水解費用的超過50%。多種因素會增加對所述酶的需求，而特別重要的一個因素是存在降低纖維素酶以及/或者在后續(xù)的糖發(fā)酵中微生物的反應速率的化合物。例如，在該過程中釋放的葡萄糖會抑制纖維素酶，尤其是P-葡萄糖苷酶(Alfaniefa/.，/胞邁k5W.，1990，52:339-350)。在纖維素水解過程中產生的纖維^t是特別強的纖維素酶抑制劑(Tolanefs/.見Biorefineries-IndustrialProcessesandProducts,第1巻，Ka咖"a/.編輯，第9章，第203頁)。雞可溶性抑制劑是在預處理過程中產生的，包,酵解產物(如糖醛和羥基-曱J^t蹈、吹喃衍生物、有機酸(如乙酌及衍生自木素的可溶性酚類化合物。這些化^還會抑制酵母，這會減少乙醇的生成并因此^^斤述方法更加昂貴。雖然可以通it^更稀的濃度下進行所i^7K解以降低所述抑制劑的效應，但是這需^^吏用較大的水解反應器，這會增大所述過程的成本。同時進行糖化作用和發(fā)酵(SSF)是一種將木質纖維生物質轉化成乙醇而的方法，這使葡萄糖對纖維素酶的抑制最小化(見例如Ghoshe〃/.，fz^^e#2'"o6.7fec/wo/.，1982，4:425-430)。在SSF體系中，酶法水解與酵母發(fā)酵葡萄糖成乙醇同時進行。在SSF中，酵母通過將葡萄糖發(fā)酵成乙醇而從所述體系中除去葡萄糖，這會減少對纖維素酶的抑制。然而，該方法的一*點是纖維素SI^被乙醇抑制。另外，一般在35-381C的溫度下進行SSF，該溫JL低于纖維素酶的501C最佳溫度并高于酵母的28匸最佳溫度。該中間溫度導致纖維素酶和酵母的性能都低于標準水平。其結果是，所i^jc解需要很長的M時間以及很大的^器，二者都是昂貴的。5W技術中已經提出了另一種方法以減少葡萄糖、纖維^=*^，可溶性抑制劑的抑制，該方法通it^M應器中進行反應而在整個水解過程中不斷移出水解產物。M^器包^il樣的超濾膜，即該超濾膜保留顆粒和高襯量組分(例如酶)，而使低襯量襯(例械)作為滲透物通it^斤艦。應用^A應器的it禾呈的一個實例i己載于0hlsonandTraghdhCff/'o"cA9"/oe/拔.，1984，26:647-653)中。在該過程中，在裝配有具有10，000分子量截留的膜的反應器中進，處理的黃花柳(sallow)(—個柳彬中)的酶法水解。纖維素酶具有50，000的分子量，因此會^^斤ii^保留在所述水解反應器中，而糖被除去并且被來自具有間歇添加的新鮮底物的i^容器的緩沖溶液替換。由于移出了抑制劑，除了所述可溶,的產量提高外，也增加了所述水解速率。然而，這種A^器的缺點是商業(yè)化的7jq^系需要的膜非常巨大并十分昂貴。所述膜還易于^^斤i^JI中存在的懸浮固阻塞。多個小組已經研究了在酶法水解過程中的收集和回收纖維素酶以減少在所述轉化過程中需要的酶量。在某些情況下，i^涉及不斷iife^J斤ii^^^物中移出水解產物以移出抑制性^^。例如，Ishiharaefa/.Cff/o"cA^/0朋#.，1991，37:948-954)/>開了在反應器中水解蒸過的硬^^M牛皮紙紙漿過程中回收纖維素酶。該過程涉^J斤i^應器中移出纖維素酶^J^給物，隨后通過抽吸it^yj斤述^^中移出含木素的不溶性剩余物。通狄濾AMC解產物(例如葡萄^纖維D中分離出所述濾出液中的纖維素酶，然后將其#至水解^^器中。正如這些研究人員所陳述的，這個體系的缺點是，額外的固體移出步驟由于會增加原料消耗而在工業(yè)應用中是不實用的。另外，大部分的纖維素8|##與所述纖維素的結合，難以回收。Larryefa/.(J;//."/WecA/wA，1986，25:256—261)描述了一種再利用纖維素酶的方法，涉;^E含纖維素(SolkaFloc)的柱iC^應器中進行7K解。通過用穩(wěn)定的緩沖液流i^慮所it^續(xù)i^多出水解的糖。，這些研究人員，移出糖產物將減少產物抑制并提高7jC解效率。然而，由于非結合的P-葡萄糖苷酶和內切葡聚糖酶被M中、3W，得到的水解并不充分。KnutsenandDavisC4///."/oc力e瓜A/o&cA，2002，98-100:1161-1172)^il了一種結^l"沉I^超濾的方法，用于在水解木質纖維生物質的過程中回收纖維素酶。該過程的目標是移出較大的木質纖維顆粒，因#后繼的超濾步驟中佳月的膜濾器不會被阻塞。該過程首先涉及用纖維素酶處i^^質纖維顆粒，然后將所形成的混^^，至傾斜沉降器中。大的木質纖維顆粒一一包括結合于所述顆粒上的酶一一被保留在所述傾斜沉降器中，而較小的顆粒以及可溶性*隨沉降器上溢液被帶出。然后將所述上溢液進料至橫流(crossflow)超濾單元以回收非結合的纖維素酶，而使糖通過。在超濾后，將所回收的纖維素酶添加至水解反應器中。保留在所述傾斜沉降器中的木質纖維顆粒和結合的酶與所述沉降器的下溢液一^被回加至所it^應器中。該體系的一*點是，在商業(yè)^K解^JI器M^上操作(它有可能大約70英尺高并且每小時加工數千加侖的漿紀這種體系將是無法實現的。該體系的第二個缺點是，在所i^應器中葡萄糖和纖維二瞎的濃度在整個過程中保持不變，使得高水平的抑制仍然會發(fā)生。該過程的又一M點是，它需要一個昂貴的超濾步驟以回收非結合的纖維素酶。Moresefa/.(^7;7/.A/oc力e瓜"/o"cA，2001，91-93:297-309)才gil了一種類似于KnutsenandDavis(見上幻描述的結^斜沉#超濾的方法。然而，Morese〃/.的方法涉及一個額外的澄清步驟，該步驟涉>5^超濾前將所i^冗降器上溢M過微孔過濾以減少所i^濾膜的阻塞。MoresWs/.的方法也有與在KnutsenandDavis(見上幻中所描述的那些相同的局限。美國專利3，972，775(WiIkeWa/.)/>開了一種用于回收纖維素酶的方物(spentsolid)的固相。用水沖洗所述殘余固體物以回收其上面吸附的酶，并^^所述得的脫附的酶的沖洗水:^V所ii7K解反應中。剩下的殘余固體物可用作該體系的燃料來源。然而，Wilkee"/.的所述方法面臨著水解后另外水沖洗的成本，這是由于大量的固^^料^^斤述固體的細粒性質使得所ii^M艮大。另外，由于分離水解產物是在所g解反應完成^進行的，該方法沒有移出所述水解M過程中存在的纖維素酶抑制劑。Ramosefa/.Cfiaz^^e7fecA/o/.，1993，15:19—25)乂〉開了H樣一個方法，即在該過程中使用纖維素酶水解蒸汽噴發(fā)的桉樹木片，并且移出可溶性糖并回收酶。該方法包括在選定的孵育時間停止反應，并收集垂熔(sintered)玻璃濾器上未7jc解的、含酶的殘留物。所述M的殘留物經水解緩沖液沖洗以移出可溶性的糖。然后將所述沖洗的殘留物再懸浮于含有新鮮P-葡萄糖苷酶的新鮮水解緩沖液中，并在451C下孵育用于隨后的水解。該方法的問4IA,在再懸浮后重復添加新鮮的P-葡萄糖苷S^^顯著地增加該方法的費用。Leeefa/.Cff/WecA"/0朋#.，1994，45:328-336)在一個包括超過5個連續(xù)水解循環(huán)的步驟中檢測了纖維素酶的回收。該過程包括添加纖維素酶和P-葡萄糖苷酶(Novozym⑧188)至itlt/f匕^^處理的樺木中，并JL^水解12小時后通過過濾回收殘留的底物。然后將新鮮的底物添加至所述回收的殘留底物中以得到2%的總底物濃度，并且將所形成的混合物再懸浮于包含p-葡萄糖苷酶的緩沖液中，使得水解繼續(xù)進行。然后重復3次纖維素酶回^隨后的水解。他們還公開了一個這樣的步驟，即在所有纖維素被水)^^前及之后，回收存在于所述完全^〉'^^中的纖維素酶。與RamosWa/.類似，該過程的一個局限是必須在每個回收步驟將P-葡萄糖苷酶加^v^應物中。美國專利5,962，289(Kilburnefa/.)公開了一種3步的酶法水解。該方法的第一步包括將內切葡，酶和外切葡聚糖酶都添加至將被水解成纖維二糖的木質纖維素材料中。第二步包括將這種材料添加至第二Avicel⑧柱中以吸附內切葡聚糖酶和外切葡,酶。然后，在第三步中將包含纖維二糖的洗脫液施加于包含經CBD固定的p-葡萄糖苷酶的第二Avicel⑧柱中。所述固定的p-葡萄糖苷酶將纖^l7jc解成葡萄糖。該方法的一個局限是葡萄糖的產生在3個不同的過程步驟中完成，這是非常復雜和昂貴的。第二個局限是，以商業(yè)水解過程常用的高流速將部分水解的木質纖維素材料漿液iHit通過Avicel⑧的柱是十分困難的。另外，在所述纖維素水解過程中存在較高的纖維^4t抑制效應。目前，在現有技術中要想實現有效的纖維素的酶法水解尚存在許多困難。一個關鍵的障礙是要克服葡萄糖以及尤其是纖維二糖對纖維素酶的抑制效應。開發(fā)這種體系對于將纖維素轉化成葡萄糖的方法來說仍然是迫切需求的。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及用于水解纖維素的酶以及使用該酶的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及用于酶法水解纖維素以從預處理的木質纖維素原料產生含葡萄糖的水解產物的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶。本發(fā)明的一個目標是提#-種用于處S^質纖維素原料的改良方法。根據本發(fā)明，提供了一種用于酶法水解纖維素以從預處理的木質纖維素原料產生含葡萄糖的7jc解產物的酶組合物，所述酶組合物包含纖維素酶、一種或多種P-葡萄糖苷酶以及用于將所述P-葡萄糖苷酶結合至所述預處理的木質纖維素原料上的粉^劑，其中所述水解通過以下步驟實現產生含有葡萄糖、葡萄糖^聚體或它們的組合的水:解漿液',、以及包含纖;素和木素的未水解纖維固體；12(ii)從所述水解的漿液分離出所述未水解的纖維固體以產生分離的纖維固體，其中所述纖維素酶和所述一種或多種P-葡萄糖苷酶與所述分離的纖維固體結合；(iii)將所述分離的纖維固體再懸浮于一種水性溶液中以產生再懸浮漿液；以及(iv)繼續(xù)水解所述再懸浮的漿液以產生含葡萄糖的7jc解產物。所述粘合劑可以是可操作連接至所述一種或多種P-葡萄糖苷酶上的碳水化合物結合模塊。優(yōu)選地，所述碳水化合物結合模塊是一種纖維素結合域。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物，其中所述纖維素酶由曲霉屬(y^erg/Z/iw)、腐質霉屬(^az/co/a)、木霉屬(7Wc力ocfer鵬)、芽^+f菌屬(勘C27/M)、喜熱裂孢菌屬(r力ei7zw6277cfe)或它們的組合產生。優(yōu)選地，所述纖維素酶由木霉屬產生。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物，其中所述纖維素酶包括選自纖維素酶CBHI和CBHII及它們的組合的纖維4水解酶(CBH)，以及選自纖維素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI及它們的組合的內切葡絲酶(EG)。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，存在于所述JI組合物中的總纖維素酶約75°/。至約10(W(w/w)的與存在于所述jK性漿液中的纖維固體結合。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物，其中所述一種或多種葡萄糖苷酶由曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽孢桿菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。優(yōu)選地，所述P-葡萄糖苷酶由木霉屬或曲霉屬產生。所述P-葡萄糖苷酶可以是天然存在的或者是基因修飾的融合蛋白。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物，其中存在于所述酶組合物中的總P-葡萄糖普酶的約75%至約100。/Uw/w)或者約90%至約100°/。(w/w)包含纖維素結合域。所述纖維素結合域可以是家族I纖維素結合域。再者，所述纖維素結合域可以是細菌的或真菌的纖維素結合域。任選地，所述P-葡萄糖苷酶包含一個接頭，該接頭將所述纖維素結合域可操作地連接于所述P-葡萄糖苷酶。根據本發(fā)明，還提供了酶組合物用于酶法水解纖維素以從預處理的木質纖維素原料產生含葡萄糖的水解產物的用途，所述酶組合物包含纖維素酶、一種或多種P-葡萄糖苷酶以及用于將所述P-葡萄糖苷酶結合至所述預處理的木質纖維素原料上的粘合劑，其中所述酶組合物的用途包含(i)用所述酶組合物部分地水解所述預處理的纖維素原料的水性漿液以萄糖寡聚體或它們的組合的7jC解漿液，以及包含纖維素和木素的未水解纖維固體；(ii)從所述水解的漿液分離出所述未水解的纖維固體以產生分離的纖維固體，其中所述纖維素酶和所述一種或多種P-葡萄糖苷酶與所述分離的纖維固體結合；(iii)將所述分離的纖維固體再懸浮于一種7jc性溶液中以產生再懸浮的漿液；以及(iv)繼續(xù)水解所述再懸浮的漿液以產生含葡萄糖的水解產物。所述粘合劑可以是可操作連接至所述一種或多種P-葡萄糖苷酶上的碳水化合物結^^^:。優(yōu)選地，所述碳水化合物結合模塊是一種纖維素結合域。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物的用途，其中所述纖維素酶由曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽孢桿菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。優(yōu)選地，所述纖維素酶由木霉屬產生。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物的用途，其中所述纖維素酶包括選自纖維素酶CBHI和CBHII及它們的組合的纖維^t水解酶(C朋)，以;Sj選自纖維素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI及它們的組合的內切葡聚糖酶(EG)。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物的用途，其中存在于所述酶組合物中的總''本發(fā)明k涉l:上述"酶組;物的用途，其中所述p:ii糖苷酶由曲霉屬、腐質霉屬、木審屬、芽孢桿菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。優(yōu)選地，所述P-葡萄糖苷酶由木霉屬或曲霉屬產生。所述P-葡萄糖苷酶可以是天然存在的或者是基因修飾的融合蛋白。所述P-葡萄糖苷酶可以是所述宿主固有的，或者是其他屬或種固有并插入至所述宿主以表達的。本發(fā)明還涉及如上述的酶組合物的用途，其中存在于所述酶組合物中的總P-葡萄糖苷酶的約75%至約100%(w/w),優(yōu)選約90%至約100%(w/w)包含纖維素結合域。所述纖維素結合域可以是家族I纖維素結合域。再者，所述纖維素結合域可以是細菌的或真菌的纖維素結合域。任選地，所述P-葡萄糖苷酶包含一個接頭。根據本發(fā)明，還^供了一種用酶組合物將纖維素酶法水解以^w預處理的纖維素原料產生含葡萄糖的水解產物的過程，所述酶組合物包含纖維素酶、一種或多種P-葡萄糖苷酶以及用于將所述P-葡萄糖苷酶結合至所述預處理的纖維素原料上的粘合劑，其中所述過程包含14纖維固體的水解漿液，以及含有葡萄糖、葡萄糖寡聚體或它們的組合的水相；(ii)從所述水解的漿液分離出所述未水解的纖維固體以產生分離的纖維固體，其中所述纖維素酶和所述一種或多種p-葡萄糖苷酶與所述分離的纖維固體結合；(Hi)將所述分離的固體再懸浮于一種水性溶液中以產生再懸浮漿液；以及(iv)繼續(xù)水解所述再懸浮的漿液以產生含葡萄糖的水解產物。所述粘合劑可以是可操作連接至所述一種或多種P-葡萄糖苷酶上的碳水化合物結^M^。優(yōu)選地，所述碳水化合物結合模塊是一種纖維素結合域。所述預處理的木質纖維素原料可來自小麥稈、燕麥稈、大麥稈、玉米秸、大豆秸、菜籽稈、稻稈、甘蔗、甘蔗渣、柳枝稷、草,、大米草或芒屬。本發(fā)明還涉及如上述的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述水性漿液具有約3%至約30W(w/w)的懸浮的或不溶解的固體^。所述^c性漿液可以在所述部分水解步驟(步驟(i))前濃縮。優(yōu)選地，在水中制備所#性漿液。本發(fā)明還涉及如上述的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所#性漿液的pH是約4.5至約5.5，或者約4.5至5.0。所^性漿液的溫度可以是約451C至約55X:。本發(fā)明還涉及如上述的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，以每克纖維素約1.0至約40.0IU的劑量添加纖維素酶。所述纖維素酶可以由曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽a菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。優(yōu)選地，約75%至約100%(w/w)的存在的總纖維素酶與存在于所#性漿液中的纖維固體結合。本發(fā)明還涉及如上述的組合物、所述組合物的用途或方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，以每克纖維素約35至約200IU的劑量添加所述一種或多種P-葡萄糖苷酶。所述P-葡萄糖苷酶可以由曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽孢桿菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。優(yōu)選地，所述P-葡萄糖苷酶由曲霉屬或木霉屬產生。所述P-葡萄糖苷酶可以是所述宿主固有的，或者是其他屬或種固有并插入至所述宿主以表達的。本發(fā)明還涉及如上述的方法，其中所述iMK解的固體經微孔過濾、離心、15真空過濾或加壓過濾分離。優(yōu)選地，所述未水解的固體經微孔過濾分離。繼續(xù)水解所述再懸浮漿液的步驟可以進行約12至約200小時。>ffci^，包含步驟(i)中產生的葡萄糖的流體與包含步驟(iv)產生的葡萄糖的流體結合以產生一種流體。優(yōu)i^，存在于所述水性漿液中的纖維素的約70%至約100%轉化成葡萄糖。在所述再懸浮步驟(步驟(iii))中，所#,液可以是生產用水。本發(fā)明還涉及如上述的方法，其中所速處理水在包含選自以下的水解M器的水幹沐系中進行攪拌罐、非混*、攪拌塔和非混合塔。所述攪拌塔或所述非混合塔可以是下流式塔或上流式塔。所述方法可以是分批過程或連續(xù)過程。本發(fā)明通過考慮在將木質纖維素原料轉化成葡萄糖過程中所進行的步驟中it^，J的困難，克服了財技術中的多M點。通it^M目分離水解的固體并且用水,液再懸浮所述分離的固體，移出存在于所i^M目中并抑制所述纖維素酶的葡萄糖、纖^^^M匕合物，或者降低它們的濃度。在不存在葡萄糖或纖維1的情況下，或者通過降低它們的濃度，可以增強的效率進行所述水解。通過用結合于所述預處理原料的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶進行所述水性原料漿液的水解，所述p-葡萄糖苷酶被攜帶至所述再懸浮的漿液中，而不是隨所述水相被移出。因為P-葡萄糖苷酶存在于所述再懸浮的漿液中，所以當使所述水解繼續(xù)進行時，剩余在所述原料中的大量纖維二糖被有效地轉化為葡萄糖。再者，因為纖維素酶也結合于所述預處理的原料上并被攜帶至所述再懸浮的漿液中，所以當所述水解繼續(xù)時將存在纖維素酶活性。本發(fā)明的又一個優(yōu)點是在繼續(xù)水解所述再懸浮的漿液過程中不需要添加p-葡萄糖苷酶，而如果所述酶留在所述水相中則需要向所述再懸浮漿液中添加，從而降低該過程的費用。本發(fā)明的該
發(fā)明內容沒有必要描ii^發(fā)明的所有特征。通過下文的描述并參照附圖，本發(fā)明的這些特征以及其他特征將變得更為顯而易見，附圖中圖1A為示出了4艮據本發(fā)明的實施方案處理木質纖維素原料的步驟的流程圖。圖1B為示出了使用上流式水解^^應器處理木質纖維素原料的步驟的銶圖。圖2A和2B示出了在再懸浮和非再懸浮的情況下，利用含有具有CBD的P-葡萄糖苷酶的木霉屬纖維素酶水解5%的預處理的小麥稈纖維素。在24小時的時候，再懸浮的7jC解物經itii并被再懸浮，而非再懸浮的水解物##原狀。在圖2A中所述纖維素酶的劑量是16mg/g,在圖2B中所述纖維素酶的劑量是24mg/g。圖3示出了通過含有缺乏CBD的p-葡萄糖苷酶的木霉屬纖維素酶水解5%的預處理的小麥稈纖維素。在24小時的時候，所述^K解物經過濾并^^再懸浮。圖4A和4B為在存在(+)或不存在(-)預處理的小麥稈的情況下孵育后，純化的不具有CBD的P-葡萄糖苷酶(pG)和具有CBD的P-葡萄糖苷酶(PG"CBD)的SDS-PAGE皿。在圖4A中所iW育在4匸下進行，在圖4B中所述孵育在5(TC下進行。在孵育30分鐘后，離心所i^^^^物，上清液級分經SDS-PAGE分離并通過考馬斯藍染色進行顯色。具體實施例方式以下是對優(yōu)選的實施方案的描述。本發(fā)明涉及用于改良纖維素水解的酶。更具體地，本發(fā)明涉及用于改良木質纖維原料的酶轉化的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶，以及使用這些酶的方法。以下對實施方案的說明僅是示例性的，而并不限制有效實施本發(fā)明的必要技術特征組合。本發(fā)明提供了用于加工木質纖維素原料的酶組合物和方法，它通過降低葡萄糖及其他化合物的抑制而從經濟角度改良了酶法水解。所述過程包含纖維素酶和用經粘合劑結合至預處理的原料上的一種或多種P-葡萄糖苷酶進行所述預處理的原料漿液的部分水解，然后從含有葡萄糖、葡萄糖寡聚體和纖維二糖的水相中分離出含有木素和未水解的纖維素的未水解纖維固體。然后將所述分離的固體再懸浮于一種水性溶液中以產生再懸浮漿液。由于所述纖維素酶和p-葡萄糖苷酶能夠與所述固體結合，它們被攜帶至所述再懸浮漿液中。然后繼續(xù)7jc解所述再懸浮的漿液,使得產生含有葡萄糖的水解產物。17通過分離所述固相和7jC相，移出葡萄糖和其他可溶性抑制劑例如纖維二糖，或者降低它們的濃度，使得所述水解在無抑制或者在抑制減少的條件下進行。所述方法可以是一個連續(xù)過程，連續(xù)地補入預處理的原料漿液并取出水解產物。或者，所述方法可以是一個分批過程。用預處理的原料漿液進^1S玄過程，以提高所述纖維素酶對所述原料中的纖維素的消化性。所述纖維素酶至少將所述原料中部分的纖維素轉化為葡萄糖、纖維二糖、葡萄糖寡聚體或它們的組合。在所述過程中用的原料是木質纖維素材料。術語"木質纖維素原料"意指任何類型的植物生物質例如，但并不限于，非木#物生物質、種檔:作物例如但不限于草，例如但不限于C4草，例如，柳枝稷、大米草、黑麥草、芒屬、草蘆或它們的組合；或糖加工殘渣例如，但并不限于，甘蔗渣、甜菜廢粕或它們的組合；農業(yè)廢料例如，但并不限于，大豆秸、玉米秸、稻稈、稻殼、大麥稈、玉米穗軸、小麥稈、菜籽稈、燕麥稈、燕麥殼、玉米纖維或它們的組合；或者林業(yè)生物質例如，但并不限于，回收的木漿纖維、鋸屑、硬木例如白楊木、^b^或它們的組合。再者，所ii^質纖維素原料可以包括纖維素廢料或林業(yè)廢料例如，但并不限于，新聞用紙、紙板等。木質纖維素原料可包括一種纖維，或者木質纖維素原料可包括源自不同木質纖維素原料的纖維混合物。另外，所a質纖維素原料可以包括濕的木質纖維素原料、半干的木質纖維素原料、全干的木質纖維素原料或它們的組合。木質纖維素原料包含的纖維素的量超過約20%，更優(yōu)選超過約30%,還更優(yōu)i^過約40%(w/w)。例如，所述木質纖維素材料可以包含約20%至約5(W(w/w)的纖維素，或更多或介于其之間的4壬何量，例如但并不限于20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48和50%(w/w)的纖維素。所述木質纖維素原料還可包含含量超過約10%的木素，更優(yōu)選的含量超過約15%(w/w)。所*質纖維素原料還可以包含少量的蔗糖、t和淀粉。優(yōu)選的木質纖維素原料的實例包括(1)農業(yè)廢料例如玉米秸、小麥稈、大麥稈、菜籽稈、燕麥稈、稻稈和大豆秸；以及(2)草例如柳枝稷、芒屬、大米草和草蘆。使用經過預處理的纖維素材料實施本發(fā)明。預處理法的目的在于給予充分的枳^a作用和化學作用組合，以破壞纖維結構并增加纖維素酶可接觸的原18料表面積。枳i^作用-"^包括，但并不限于，使用壓力、研磨、碾磨、攪拌、粉碎、壓縮/膨脹，或其他形式的積械作用?；瘜W作用可包括，但不限于，使用熱(通常為蒸汽)、酸、^^J^劑。幾種化學的及機械的預處理方法在本
技術領域：
中是熟知的。在預處理之前，可將所述木質纖維素原料瀝濾。例如，這可以依照wo02/070753(Griffin"a/.,該文獻通過引證的方式納入本文)的所乂^開的方法進行。然而，即使進行了瀝濾，在隨后的預處理過程中仍會產生大量的抑制性化合物。進行預處理以增加所述木質纖維素原料漿液對纖維素酶水解的敏感性。例如，可以進行預處理以將存在于所述^t^質纖維素原料中的半纖維素或其部分水解成單糖例如^Mt、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或它們的組合。優(yōu)選地，進行預處理，使得所述半纖維素幾乎完全水解且少量纖維素轉化成葡萄糖。纖維素在)t^使用纖維素酶的步驟中被水解成葡萄糖。在預處理過程中，一般將濃度為約0.02%(w/v)至約2%(w/v)或介于其之間的伶阿量(測量為純的酸占干原料加上水性溶液的總重量中的重量百分比)的稀釋酸用于預處理所i^K質纖維素原料。優(yōu)選地，所述預處理在約180匸至約250'C的溫度下進行約6秒至約120秒的時間，pH為約0.8至約2.0?？梢栽趩蝹€階段或者在多個階段進行預處理。優(yōu)選地，至少一個階段在上文設定的溫度范圍、時長和pH范圍內進行。對原料進行預處理的方法之一是蒸汽噴發(fā)(steamexplosion)，使用美國專利4，461，648和4，237，226(這些專利通過引用的方式納入本文)所述的工藝*進行。另一種預處理所述原料漿液的方法涉及連續(xù)的預處理，意思是通過一個>^應器連續(xù)地泵入所述木質纖維素原料。連續(xù)的酸預處理是本領域技術人員熟知的，見例如美國專利5，536，325(Brink);共同未決的美國申請60/687，224(FoodyandTolan);美國專利4，237，226(Grethlein;其通過引用的方式納入本文)。根據需^^J^本領域中已知的務他方法制備預處理的原料，例如但不限于，美國專利4，556，430(Conversee"/.;該專利通過引用的方式納入本文)中公開的那些方法。所述預處理的木質纖維素原料可任選地在酶法水解之前用水沖洗。所述沖洗和瀝濾步驟可除去一些纖維素酶和酵母的抑制劑如溶解的糖及糖降解產物、溶解的木質素及含酚化合物，以及系統中的其他有機化合物。然而，雖然預處理之后進行沖洗在本發(fā)明的范圍之內，但是它不能使所有存在的不19溶雜質都被移出，而且會增加該過程的成本。將所述纖維素材料用一種水性溶液調成漿液，以形成水性原料漿液或"水性漿液"。例如，但非意在P艮制，所述水性溶液可以是生產用水、淡水、蒸汽冷凝液或處理回收流體。水性漿液中預處理的木質纖維素原料的濃度取決于顆粒大小、水滯留(waterretention)、泵能力和所述原料的其他性質。所述濃度一M約3%至約30%(w/w)，或約10%至約20°乂(w/w)的纖維固體(也被稱作懸浮固體或不溶固體)，或介于其之間的任何濃度值。所述水性漿液優(yōu)選具有能使其被泵送的固體濃度。本領域中熟知的，懸浮固體或不溶解固體的濃度可通過用玻璃微纖維濾紙過濾漿液樣品、將濾餅用水沖洗并在105匸下^f吏其干燥過夜的方法進4亍測定。所述纖維固體優(yōu)選^^有至少約20%至約70%(按重量計)的纖維素，或介于其之間的任何量。例如所述懸浮固體可以含有30°/。、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%(按重量計)的纖維素。所述水性漿液的pH通常調整到所用纖維素酶的最優(yōu)pH范圍內。一般而言，將所述水性漿液的pH調整到約3.0至約7.0的范圍內，或介于其之間的任何pH。所述pH—般為約4.5至約5.5,或介于其之間的4壬何pH。然而需要理解，如果所用的纖維素酶為嗜堿的或嗜酸的，則漿液的pH可分別高于或低于約4.5至約5.5。所述漿液的pH可用本領域已知的^^T適宜的酸或堿調整。例如，如果所述漿液為堿性(例如，如果進4于了堿性的預處理)可使用硫酸。如果所述漿液為酸性，可使用選自氨水、氫氧化銨、石灰、氫氧化釣、氫氧化鉀、氫氧化鎂、氫氧化鈉或它們混合物的堿調整pH。優(yōu)選地，所ii^選自氨水、氫氧化銨和氫氧化鈉。將所述水性的原料漿液的溫;l調整到對于所述纖維素酶的活性而言的最優(yōu)范圍內。一般而言，大多數纖維素酶的適宜溫度為約45X:至約551C，或介于其之間的任何溫度。但對于嗜熱的纖維素酶而言，所述漿液的溫度可更高。在預處理之后，在調整所述7jC性漿液的溫度和pH之前、之中或之后將纖維素酶和P-葡萄糖香酶與粘合劑一起添加其中。優(yōu)選在調整所述預處理的木質纖維素原料漿液的溫度和pH之后，將纖維素酶和P-葡萄糖苷酶添加至所述漿體中。然后進行所述預處理的木質纖維素材料的部分7JC解。纖維素酶對纖維固體中的纖維素具有水解活性，并含有至少一，化域。纖維素酶通常具有另外的結構域，包括但不限于，碳水化合物結合模塊20或其他功能性域。術語"纖維素酶"或"纖維素酶"意指水解纖維素的酶混合物。所述混合物可以包含葡萄二糖水解酶(glucobiohydrolase)(G朋)、纖維二糖水解酶(CBH)和內切葡聚糖酶(EG)。雖然GBH酶可以構成所述酶混合物的組分，但是它們在纖維素的酶法水解中的使用不如CBH酶和EGS^"遍。在一個非限制性實例中，所述混合物包含C朋酶和EG酶。所述GBH酶主要從其末端水解纖維素多聚體鏈來釋放葡萄糖，而所述CBH酶主要從其末端水解纖維素多聚體鏈來^^放纖維二糖，所述EG酶主要在鏈中間水解纖維素多聚體。所述GBH酶可以是具有類型EC#3.2.1.73的活性的酶，所述CBH酶可以具有類型EC#3.2.1.91的酶活性，且所述EG酶可以具有類型EC#3.2.1.4或EC#3.2.1.151的活性。所述纖維素酶可以由多種植物和微生物產生。本發(fā)明的方法可4吏用任意類型的纖維素酶來實施而不必考慮其來源。研究最為廣泛的、典型的、商業(yè)化生產的纖維素是由曲霉屬、腐質霉屬4霉屬的真菌，以及芽抱ff菌屬及喜熱裂孢菌屬的細菌獲得。由絲狀真菌^b^霉(7Wc力Mer鵬/o塔/6rac力/W咖)產生的纖維素酶包括至少兩種稱為CBHI和C朋U的纖維二糖水解酶和至少4種EG酶。纖維素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI還已經從特異腐質霉(^咖/co/a//^o/e/w)中被分離(見Schuleinefa/.，■Proceec^'/z^so尸f力eSeco/^7ff/C￡Z5^邵o"'咖o"7Wc力oder鵬reese/tW/zz/asesa/^/^/ro/ase51，Espoo1993，P.SuominenandT.Reinikainen，Eds.FoundationforBiotechnicalandIndustrialFermentationResearch,Helsinki8:109-116,其通過引用的方式納入本文)。所述CBHI酶被定義為主要通過兩步置^L^應(retainingmechanism)水解纖維素多聚體鏈的CBH,這是本領域技術人員已知的。所述CBHI酶是進行性的(processive)。所述CBHI酶可以;^糖水解酶(glycohydrolase)家族7、10或家族48的成員。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述CBHI酶是家族7的成員。在另一個較優(yōu)選的實施方案中，所述CBHI酶是來自木霉屬的家族7CBHI。所述CBHII酶被定義為主要通過一步置^L^應(invertingmechanism)水解纖維素多聚體鏈的酶，這是本領域技術人員已知的。所述CBHII酶可以是進行性的。所述CBHII酶可以是家族6、9或74的成員。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述CBHII酶是家族6的成員。在另一個較優(yōu)選的實施方案中，所述CBHII酶是來自木霉屬的家族6CBHII?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的EG酶的實例在以下表1中列出表l:EG酶的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>優(yōu)選地，所述EG酶是真菌酶，例如由木霉屬表達的酶。所述EG酶優(yōu)選具有CBD('纖維素結合切，但是某一特定部分的EG酶可以被包括在缺乏CBD的纖維素酶的混合物中。選擇所述纖維素酶的劑量以將所述預處理原料的纖維素轉化成葡萄糖。例如，適宜的纖維素酶的劑量可為每克纖維素約1.0至約40.0濾紙單位(FilterPaperUnit)(FPU或IU),或介于其之間的任何量。FPU是本領域普通技術人員熟悉的標準單位，根據Ghosea/7d^p/.ffle邁.，1987，59:257-268)定義及測量。在實施本發(fā)明中使用的纖維素酶與所述預處理原料的組分結合。然而應了解，所述酶組合物可以含有一些沒有與所述預處理的木質纖維素原料結合的纖維素酶，例如那些不具有纖維素結合域的纖維素酶。與纖維素(固體)結合的纖維素酶百分率可以是存在于所述酶組合物中的總纖維素酶的約75。/。至100。/Uw/w);例如，與纖維素結合的纖維素酶百分率可以是存在于所述酶組合物中的總纖維素酶的約75、78、80、83、85、87、90、93、95、97或10(W(w/w)。將纖維二糖轉化成葡萄糖是通過P-葡萄糖苷酶完成的。所述術語"P-葡萄糖苷酶"是指任何將葡萄糖雙體、纖維二糖水解成葡萄糖的酶。所述P-葡萄糖苷酶的活性由酶學委員會(EnzymeCo腿ission)按照其活性定義為EC#3.2.1.21。在本發(fā)明中使用的P-葡萄糖苷酶是水溶性的。多種微生物可產生P-葡萄糖苷酶，并且這些酶的性質有差異，所述性質包括結構(分子量、三維取向、a酸組成和活性位點)和催化活性(纖維4水解的速率和動力學以及作用于其他底物的能力)。所述p-葡萄糖苷酶可以有多種來源；然而，在所有情況下，這些p-葡萄糖苷酶都能將纖維二糖水解成葡萄糖。所述P-葡萄糖苷酶可以是家族1或家族3糖苷水解酶，而其他家族成員也可以用于實施本發(fā)明。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選P-葡萄糖苷酶是來自里氏木霉的Bgl1蛋白。其他的形式可以包括來自木霉屬的其他Bgl蛋白或來自其他生物的P-葡萄糖苷酶。所述P-葡萄糖苷酶與所述預處理原料的結合受到將所述P-葡萄糖苷酶結合至所述預處理的木質纖維素原料的粘合劑的影響。所述術語"粘合劑"是指任何用于將所述P-葡萄糖苷酶結合至所述纖維固體的化學化合物。所述粘合劑對所述預處理原料的親和力足夠強以使所述P-葡萄糖苷酶粘附于所述水性原料漿液中的纖維固體上，從而使之可被攜帶至第二步水解(連續(xù)水解)。所述粘合劑可以是以化學修飾的形式粘附于所述P-葡萄糖苷酶上的化適宜的化合物的實例包括去污劑、:面活';;、聚乙二醇、蛋白及蛋白片段。去污劑和表面活性劑的實例包括，但不限于，膽汁酸鵬酸、脫氧膽酸、牛磺膽酸、甘J^酸和甘員IUa酸都是實例)、^J4t苷(n-壬基-P-D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷、n-庚基-p-D-吡喃葡萄糖苷、n-己基-p-D-吡喃葡萄糖苷、十二)^-P-D-麥芽糖苷、辛基-p-D-硫代吡喃葡萄糖苷、吡喃葡萄糖苷和癸基-P-D-麥芽糖苷都是實例)和兩性去污劑(zwittergent)。聚乙二醇的實例包括，但不限于，聚乙二醇和聚氧乙烯。所述粘合劑還可以是蛋白或蛋白片段。蛋白或蛋白片段的實例包括上述被用作結合域的那些?？勺鳛檎澈蟿┑牡鞍椎钠渌麑嵗€包括，但不限于，疏水蛋白、#^菌溶血素、膨脹因子(swollenin)或膨脹素(expansin)?？勺鳛檎澈蟿┑牡鞍灼蔚膶嵗?，但不限于，聚色氨酸、聚酪氨酸和兩性螺旋。優(yōu)選地，所述粘合劑是一個結合域，例如可操作連接至P-葡萄糖苷酶的碳水化合物結合模塊(CBM)。所述術語"碳水化合物結合模塊"或"CBM"是指以非共價與存在于纖維固體中的碳水化合物結合的任何蛋白或肽序列。優(yōu)選地，所述碳水化合物結合模塊是與所述纖維固體中的纖維素結合的纖維素結合域(CBD)。天然發(fā)現的CBD在例如纖維素酶以及在非水解酶的蛋白中作為不連續(xù)域。迄今為止已經鑒定了超過25個家族的CBD序列。用于實施本發(fā)明的CBD可衍生自任意來源的CBD。例如，所述CBD可以來源自細菌或真菌，^E是CBD已經在許多的其他生物中被分離到?？僧a生CBD的微生物的非限制性實例包括曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽孢桿菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合。用于實施本發(fā)明的優(yōu)選的CBD序列是I型CBD,它來源自真菌?；蛘撸龇ɡ缌譱t^酸法(BeaucageandCaruthers,TetrahedronLetters,1981，22:1859-1869,該文獻通過引用的方式納入本文)。所述術語"可操作地連接的"是指所述P-葡萄糖苷酶和所述結合域之間的連接，該連^f吏得所述結合域粘附于所述水性漿液中的纖維固體上。所述連接可以通過一個接頭，或者所述結合域可以連接至所述P-葡萄糖苷酶上而無插入的接頭區(qū)?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的粘合劑的又一個實例是與所述P-葡萄糖苷酶和所述纖維固體都連接的化學物。這種化合物的非限制性實例包括，但不限于，聚陽離子、聚陰離子、絮凝劑和兩性分子。再者，該化學物可以是蛋白或蛋白片段一一例如上述的被用作結合域的那些，或者化學物一一例如上述的被用于化學修飾的那些。所述術語"接頭"是指這樣的#^酸序列，即它與纖維素酶或P-葡萄糖苷酶的纖維素結合域賦連，并將其連接至所述酶的催化活性域。所述接頭區(qū)可以是親水的和不帶電荷的并富含某些M酸，包M氨酸、天冬M、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺或它們的組合。優(yōu)選地，所述接頭結構賦予所述序列以柔性。雖然不希望囿于理論，但是本發(fā)明人認為所述柔性結構有利于所述催化域的活性。然而，如對本領域技術人來說顯而易見的是，接頭并不是必須一定存在的。P-葡萄糖苷酶或纖維素酶結合纖維素的能力可以通過使用預處理的木質纖維素材料的纖維素結合測定進行確定。這種測定是本領域技術人員所通曉的，包含在20"C至40"C的溫度下，在水性溶液中使用粘合劑將5克預處理的木質纖維素材料與50mgfi-葡萄糖苷酶接觸5至15分鐘；然后通過過濾從所述酶分離所述纖維固體并測量溶液中剩余酶的量。所述粘合劑與所述P-葡萄糖苷酶和所述纖維固體結合，從而使得所述P-葡萄糖苷酶隨所述纖維固體保留于所述水解^JI器中。任意來源的P-葡萄糖苷酶都可用于實施本發(fā)明。例如，所述P-葡萄糖苷酶可來源自曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽*菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合。優(yōu)選地，所述P-葡萄糖苷酶衍生自木霉屬或曲霉屬。來源自木霉屬的P-葡萄糖苷酶具有74，000的分子量(這通過SDS-聚丙烯,凝歐電泳測量)并具有8.3的等電點(這通過非變性等電聚焦聚丙烯,皿電泳測量)。所述p-葡萄糖苷酶可以是所述宿主固有的，或者是其他屬或種固有并插入至所述宿主以表達的。具有CBM(例如CBD)的P-葡萄糖苷酶可以是通itit樣的遺傳構建體產生的融合蛋白，即該遺傳構建體包含啟動子序列、編碼P-葡萄糖苷酶的序列和編碼CBM的序列。所述遺傳構建體在一個合適的表達系統中表達，所述表達系統例如細菌的真菌表達系統，如曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽孢桿菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合。另外，具有CBM的天然存在的P-葡萄糖苷酶可用于實施本發(fā)明。天然存在的P-葡萄糖苷酶可分離自曲霉屬、腐質審屬、木霉屬、芽a菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合。例如，天然存在的具有CBD的P-葡萄糖苷酶已經從白腐真菌黃孢原毛平革菌(戶力a朋eroc力aefecAr7^o^or/咖)中純化并表征(LymareZa/.，J/7//.^z^r朋.7"J,61:2976-2980，其內容在此通過引用的方式納入本文)。添加至所述水性漿液中的p-葡萄糖苷酶的劑量水平可以是每克纖維素約5至約400p-葡萄糖苷酶單位，或介于其之間的任意量，或者每克纖維素約35至約200e-葡萄糖苷酶單位，或介于其之間的任意量。所述0-葡萄糖苷酶單位依照Ghose的方法(見上文)測量。優(yōu)選存在足夠高的葡萄糖苷酶濃度以確保纖維二糖不會在水解過程中集聚而抑制纖維素酶作用。本領域技術人員應理解，木霉屬以及其他產生纖維素酶的微生物通常只產生有限量的葡萄糖苷酶。可用應用White25andHindle，美國專利6,015,703(該專利通過引用的方式納入本文)中列出的方法使由木霉屬產生的P-葡萄糖苷酶的水平升高?；蛘?，可以在單獨的曲霉屬發(fā)酵中產生P-葡萄糖苷酶并將其添加至所述纖維素酶混合物中。應了解，不是所述酶組合物中所有的葡萄糖苷酶都與所述固體結合。例如，存在于所述酶組合物中具有CBD的P-葡萄糖苷酶的量可以是所存在的總P-葡萄糖苷酶的約75%至100%(w/w),或介于它們之間的任意范圍；約85%至100%(w/w),或介于它們之間的任意范圍；約90%至100%(w/w),或介于它們之間的任意范圍。例如，具有CBD的p-葡萄糖苷酶的量相對于存在于所述酶組合物中的總P-葡萄糖苷酶量可以是約75、78、80、83、85、87、90、93、95、97或100%(w/w)。所述纖維素酶和p-葡萄糖苷酶可以在水性溶液中處理，或者被加工成粉末或顆粒形式。可以在任意時間點將所述酶添加至所述水性漿液中，然后將所述水性漿液導入水解反應器?；蛘撸梢詫⑺雒钢苯犹砑又了鏊夥磻髦?，但是優(yōu)選在導入所述水解反應器之前添加酶以使混合充分?？梢允褂帽绢I域技術人員熟悉的混合裝置將所述酶混合至所述水性漿液中。圖1A是這樣的一個非限制性實例，即如何對如上文所述預處理的;^質纖維素原料進行纖維素酶水解。在纖維素酶水解之前，將所述水性原料漿液IO冷卻。這可以通過使用第一熱交換器20來進行，該熱交換器與葡萄糖產流體30或其他適宜的流,熱。然后可以使用第二流體例如第二熱交換器50中的冷水45進一步冷卻所述7jc性漿液10。然后將所述漿液10泵入水解配料罐(make-uptank)60中，同時被泵入的還有具有纖維素結合域的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶70,以及調節(jié)pH的氨水80。在該實例中，將所述水解配,60的內，混合，并通過管120從所述配#^60泵出至水解罐130中。所述配料罐60可用于調節(jié)pH并達到所需的漿液溫度。本領域技術人員來說顯而易見的是，可以在別處將所述酶與所述預處理的木質纖維素原料混合，所述別處例如進料至所述配,60的管線中包括，但不限于，第一熱交換器20的上游、所述第一熱交換器20和第二熱交換器50之間的點、所述原料即將進入所述配j^60之前的點。還可以在所述預中；例如可以將它們添加至管120中。在添加所述酶之后，使所述預處理的木質纖維素原料被部分水解。所述術語"部分水解，，是指水解所述預處理的木質纖維素原料漿液，使得未出現所述漿液完全轉化成葡萄糖。該水解的進行使得所述水性漿液中部分的纖維素保持不被轉化。這些剩余的纖維素在下文更詳述的進一步水解步驟中被轉化成纖維二糖、葡萄糖寡聚體、葡萄糖或它們的組合。所述水解可以形成約30%至約80%(w/w)，或者約30%至約60W(w/w)的纖維素被轉化成葡萄糖；例如，30、33、35、38、40、43、45、50、53、55、58、60、70或8(^(w/w)的纖維素可被轉化成葡萄糖?？墒沟盟隼w維素材料的部分水解持續(xù)進行約12至約24小時，或者它們之間的任意時長。例如，所述反應時間可能是約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時,或者它們之間的任意時間。在進行部分水解之后，包含纖維素和其他不溶解組分的未水解纖維固體組成了所述部分水解漿液的固相?？纱嬖谟谒龉滔嘀械牟蝗芙饨M分除了包括非木質纖維組分或對纖維素酶隋性的其他材料(例如木素和二氧化硅化合物)"卜，還包括除纖維素外的沒有被所述纖維素酶消化的未轉化固體。應了解，所述固相可包含液體。所述固相可具有40-80%的含濕量；例如，所述固相可以具有40、45、50、55、60、65、70、75或80%的含濕量。所述部分水解漿液的水相包含抑制纖維素酶的葡萄糖。可存在于所述水相的其他可溶性組分包括葡萄糖寡聚體；糖降解產物，例如糖醛和羥基-曱基糖醛；有機酸，例如乙酸；及衍生自木素的酚類化合物。所述術語"水解M器"是指用于通過纖維素酶和P-葡萄糖苷酶7jc解所述預處理的木質纖維素原料漿液的反應容器。必須適宜地建造所述水解反應器以適應所述水解。可以對水解反應器加裝蒸汽、熱水或其他熱源的外套以保持所需的溫度。所述水解反應器可以是高徑比大于2:1的塔，或者是高徑比小于2:1的罐。所述7jc解可以在作為包含一個或多個水解反應器的水解體系的一部分的水解M器中進行。所述術語"水解體系"涵蓋水解反應器以##^、泵或其他輔助裝置。在所述7jc解體系中選用的水解反應器的數量取決于水解反應器的價格、水性漿液的體積以及其他因素。對于商業(yè)級的乙醇廠，水解反應器的數量一般是4至12個。所述水解可以在"固體保留型水解^JI器"中進行。本文使用的術語"固體保留型水解反應器"^^旨這樣的水解^JI器，即該水解反應器保持纖維固體的時間比保持水性漿液水相的時間長，以增加所述纖維素酶和P-葡萄糖苷酶與纖維素的反應時間。固體保留型水解反應器可以是一種非混合的水解27反應器，也就是"^4所述水解反應過程中不對所述反應器內含物進行^攪拌。一種適宜于實施本發(fā)明的非混合的水解反應器的實例是wo2006/063467(FoodyWa/.)描述的上流式反應器，該公開通過引用的方式納入本文。所述固體保留型水解反應器還可以是混合反應器，在這種情況下，在水解反應過程中對所述^JI器內含物進行^l攪拌。在所述水解罐中的有效混合可以通過泵輪或泵實現，這是本領域中公知的。如果所述固體保留型水解反應器是塔，那么它可以是上流式塔，其中所述水性漿液和酶直接在所述塔的底部進入塔，并被向上泵通過所述塔?；蛘?，所述塔可以是下流式塔，其中所述水性漿液凈皮向下泵通過所述塔。所述上流式塔或下流式塔可以是非混合的?；蛘?，可以以非連續(xù)水平(discreetlevel)進行混合。參照圖1A，在一個非限制性實例中，將含葡萄糖和未水解纖維固體的7jc解漿液從所述水解反應器130的頂部經管線170移出，并導入微孔過濾單元180中。所述微孔過濾單元180從所述水解的漿液水相分離出含纖維素的纖維固體。本領域技術人員還應了解，所述纖維固體含有滲入其中的液體。然后將這些分離的纖維固體(管線195)在第二水解反應器200中再懸浮，并繼續(xù)進4亍水解。如前述，在所述水解過程中，纖維素酶結合于所述預處理的木質纖維素原料的纖維素上。結合于所述預處理的木質纖維素原料的葡萄糖普酶也將結合于所述纖維固體上。因此，當從所述漿液的^M目分離出所述纖維固體的時候，不但外切纖維二糖水解酶(CBH)和內切葡聚糖酶(EG)，而且p-葡萄糖苷酶都將與所述纖維固相同時被留下。許多方法可用于從所述水相分離所述未消化的纖維固體。它們可包括完全地或幾乎完全地從所述水相分離出所述纖維固體的方法，以及僅部分Ak^所述水相分離出所述纖維固體的方法。例如，可以通過膜過濾、離心、真空過濾或加壓過濾從所述水相分離出所述纖維固體。一種優(yōu)選的膜過濾方法是微孔過濾，一種優(yōu)選的離心方法涉及將所述漿液泵過水力旋流器(hydroclone)。實現本發(fā)明的一個并非意在限制的優(yōu)選方法包括在如W02006/063467(其內容在此通過引用的方式納入本文)描述的沉降反應器中進行所述水解。一個參^了上流式水解反應器的水解體系的實例顯示于圖1B中。與圖1A中相同的參照編號表示相同的工藝步驟。如圖1B中所示，將所28述管線120中的水性漿液進料至水解反應器130中。這可以通過一條向下通過所述反應器中部的管線進行，并通過M器140在底部添加所述漿液?；蛘?，所述漿液料可以直接至位于所述反應器底部的M器140中。所述水性漿液以慢到足以使得纖維固體沉降的垂直速度向上流經所述反應器。其結果是，所述7JC相以比所述纖維固體更短的時間通過所述反應器。所述結合的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶與所述纖維固體一塊被留在所述反應器中，而所述水相流出所述反應器。所述結合的P-葡萄糖苷酶可確保纖維二糖在所述水解中被轉化成葡萄糖，而不會抑制纖維素酶。所述未水解的固體經管線170隨所述水相被從所述反應器中轉運出，并且通過微孔過濾單元180被從所述水相中分離出。在從所述含葡萄糖的水解產物分離出所述纖維固體的步驟后得到的分離固體物可包含約50%至約80%的水分。所述含濕量取決于使用的分離方法、所選的對所述固體脫水的程度以及除水的效率。所述分離的固體可經水沖洗以提高被除去的葡萄糖量。在固體保留型或非固體保留型水解M器中水解之后，將所述纖維固體分離、再懸浮，并繼續(xù)水解。將所述纖維固體再懸浮于適宜于進一步水解所述再懸浮漿液的水相中。用于再懸浮所述固體的^Mi溶液優(yōu)選是水，但也可以使用其他水性溶液。所述水可以是淡水、生產用7jc或蒸汽冷凝液。為再懸浮而添加的水性溶液量可以與水解前存在于所述水性漿液中的量相同，或優(yōu)選略少于該量。最小量是泵或輸送以及混合所述漿液的必需量。所述再懸浮的漿液不含葡萄糖以及其他可溶性抑制劑，或者它們的濃度被顯著降低。在沒有葡萄糖、纖維二糖和抑制劑的情況下，或者通過降低它們的濃度，可以以提高的效率進行所述進一步水解步驟。再參照圖1A，可以通過以下途徑進行所述再懸浮，即將所述分離的固體與水210-^經管線195導入至第二水解>^應器200中，然后將它們再懸浮，產生再懸浮的漿液。所述固體可以以約3%至約3(W(w/w)的固體濃度，或者介于它們之間的任意濃度，例如，約l(W至約20Hw/w)的懸浮固體，或者介于它們之間的任意濃度，再懸浮于所述液體中。在所述再懸浮漿液中懸浮的固體的濃度優(yōu)選等于或略高于在分離固體前在所述預處理的原料漿液中懸浮的固體的濃度。在將所述纖維固體再懸浮之后，使所述7jc解繼續(xù)進行以將所述纖維素轉化成含葡萄糖的水解產物?？梢允顾鲈賾腋{液的水解再進行約12-12029小時；例如可以使所述再懸浮的漿液的水解進行約12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、90或120小時。所述第二水解^^應器200的底部可以逐漸變細，以形成一個使最重的固體可以沉降并經管線230通過泵220移出的通道。(見圖1B)。然后可以將這些固體物送遞用于木素處理160。通常，所述再懸浮漿液的pH范圍是約3.0至約7.0，或者介于它們之間任意pH范圍；優(yōu)選的pH范圍是約4.5至約5.5。如果所用的纖維素酶為嗜堿的或嗜酸的，則漿液的pH可分別高于或4氐于約4.5至約5.5。將所述再懸浮溶液的溫度調整到對于所述纖維素酶的活性而言的最優(yōu)范圍內。一般而言，大多數纖維素酶的適宜溫度為約451C至約551C，或介于其之間的任何溫度。例如，可以將所述漿液的溫度調整到約45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或551C。M于嗜熱的纖維素酶而言，所述溶液的溫度可更高。參照圖1A，可以經管線240從所述第二水解反應器200頂端回收所述水解的漿液，然后導入至沉M250中，其中在所述水解漿體的水相中包含葡萄糖并且在纖維固體中包含未水解的固體和任何未水解的含纖維素顆粒。所述纖維固體沉降至所述沉,250的底部。所述含葡萄糖的水相30可以經泵移出。所述未水解的固體可以從所述沉降罐250經管線280泵出。術語"7jc解產物"是指在酶法水解過程中產生的產物包括，但不限于存在于所述7jc相中的葡萄糖。除葡萄糖之外，所述水解產物的水相還可以包含纖維二糖、葡萄糖寡聚體或它們的組合。少量的未轉化的纖維素和非纖維素材料或者對纖維素酶惰性的其他材料，可能被攜帶至所述水相中?？梢詮乃銎咸烟橇黧w中分離出這些固體物，產生無固體顆粒的制劑。雖然上述的體系應用了兩個水解反應器，但是所述方法可以在超過兩個的水解反應器中進行。還需要了解，在所述第二水解之后，所得到的水解漿液可以經進一步水解。這可能會涉及從所述水解的漿液中分離所述固相，并將所述分離的固體再懸浮以產生再懸浮的漿液。這些步驟可以重復1-5次，或者介于其之間的4壬意次，優(yōu)選l-2次。再者，在整個所述處理步驟中，可以將所述分離的固體送遞至一個或多個上流式或下流式水解反應器中。例如，可以將所述分離固體物的第一部分回收至一個上流式反應器中，并將所述分離固體物的第二部分添加至一個下流式>^應器中。可以將在部分水解步驟后得到的含葡萄糖的流體與從繼續(xù)水解所述再懸浮漿液得到的含葡萄糖的流體合并，產生合并的糖流體。例如，參照圖1A，將所述含葡萄糖的水性溶液經管線185移出并添加至葡萄糖流體30中?；蛘?，對所述部分水解和所述再懸浮水解的過程中產生的水相分別進行發(fā)酵或進一步處理?？梢詫⑼ㄟ^7jC解纖維素從所述預處理的木質纖維素原料產生的葡萄糖發(fā)酵成乙醇。發(fā)酵葡萄糖和其他糖成乙醇可以通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法進行，并且可能受到包括酵母和細菌或基因修飾微生物的多種微生物的影響，例如，但不限于，W095/13362、W097/42307中描述的那些，或者如AlcoholProductionFromLignocellulosicBiomass:TheIogenProcess(in:TheAlcoholTextbook,NottinghamUniversityPress,2000)中所述；它們被通過引用的方式納入本文。下述實施例中將對本發(fā)明作進一步闡述。但應當理解的是，這些實施例的目的只在于示例說明，不應當用于以4^f可方式限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1:在上流式水解反應器中用具有CBD的纖維素酶和0-葡萄糖苷酶水解預處理的原料參照圖1B，用含20%水分的小麥稈以91t/hr制備預處理的原料漿液。根據Foody,美國專利4，461,648的教導，將所述稈用錘磨機磨碎成20目(mesh)并用230匸的蒸汽和稀釋于422,000kg/hr水中的3314kg/hr碌k酸93%(w/w)加熱。當所述預處理的木質纖維素原料漿液10從所述預處理^^應器出來時，使用與水性葡萄糖流體30或其他適宜流體換熱的熱交換器20將其冷卻。然后使用第二流體例如熱交換器50的冷水45進一步將所述預處理原料漿液10冷卻至約45'C至約55X:的溫度。然后將所述預處理原料漿液10泵入水解配柳60中，同時被泵入的還有酶的水性溶液70，所述酶水性溶液包含來自真菌木霉屬的劑量為每克纖維素19IU的纖維素酶以及劑量為每g纖維素145IU的如實施例5所述制備具有CBD的P-葡萄糖苷酶。這是所述水解塔的iW。但應指出的是，還可以在別處添加所述酶70;例如，可以在為所述水解反應器i^F的^^T管線內添加所述酶70。即將添加酶之前還可以將氨水80以1463kg/hr的速率添加至所述漿液10中，以將pH調整至約4.5至5.0。用攪拌器100將所述水解配料罐60的內容物混合，然后將所述漿液10用泵110沿管120從所述配料罐60泵出，至7個類似的水解>^應器之一，其中水解反應器130是這種并聯操作的反應器之一。所述水解反應器130包含布料器140，用于維持所述酶處理的漿液的均勻分布。如WO2006/063467中所述，水解反應器130是一個非混合的上流式沉降反應器。所述反應器是直徑60英尺、高60英尺的罐。將所述漿液10以300gpm的速率和約10。/。(w/w)的纖維固體濃度添加至所述水解反應器130的底部。所述罐逐漸變細，以形成一個^吏最重的固體沉降并經管線145通過泵142移出的通道?？梢詫⑦@些固體物經管線160送出用于木素處理，或者被分別地回收或排棄。所述水相和纖維固體流上所述罐中，所述纖維固體以慢于所述液體的iiJL在所述罐中沉降和上升。在所述水相約72小時的停留時間并且濃度12M(w/w)濃度的纖維固體約130小時的停留時間后，將所述漿液從所述罐中排出。所述纖維素轉化率為約95%。將所述水解的漿液150——即其包含60g/L葡萄糖的水相以U要包含木素和二氧化M未水解纖維素的纖維固體一一經管線170從所述水解>^應器130的頂部移出，并以300gpm的速率導入微量過濾單元180中。所述微量過濾單元180從所述水相分離出含纖維素、木素以及結合的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶的纖維固體。所述水相包含少量的酶及葡萄糖流體，將它經管線185移出并送出用于通過酵母發(fā)酵成乙醇。將管線195中的包含結合的纖維素酶和&-葡萄糖苷酶的所述分離纖維固體送遞至第二7jc解反應器中用于進一步水解。實施例2:在繼續(xù)7jc解的上流式水解反應器中用具有CBD的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶水解預處理的原料本實施例涉及用具有CBD的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶酶水解預處理的原料，然后從所述水相分離未水解的纖維固體并且再懸浮所述纖維固體。在第二水解反應器中水解所述包含結合的0-葡萄糖苷酶和纖維素酶的再懸浮纖維固體。用具有CBD的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶水解預處理的原料是在如實施例1所述的上流式7JC解反應器中進行。然而，在本例中，選取所述水解反應器的尺寸，使得在約24小時的停留時間、約55%的纖維素轉化后將所述液體排出罐，產生部分水解的漿液150。將所述部分水解的漿液150——其包含30g/L葡萄糖的水相以及含有木素和二氧化>^^未水解纖維素的纖維固體一一經管線170從所述第一水解反應器130的頂部移出，并以900gpm的速率導入微量過濾單元180中。所述微量過濾單元180從所述部分水解漿液水相分離出含纖維素、木素、結合的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶的固體。所述水相包含少量的酶及葡萄糖流體，經管線185將它移出并添加至葡萄糖流體30中。將包含結合的纖維素酶和p-葡萄糖苷酶的所述分離纖維固體經195與水210—塊導入至第二水解反應器200中，以產生再懸浮的漿液，然后i^至亦為上流式水解反應器的第二水解反應器200中。所述第二反應器的進料速率是約450gpm，且所述液體駐留時間是約48小時。與所述第一水解^^應器130類似，所述第二水解反應器200的底部逐漸變細，以形成一個使最重的固體可以沉降并經管線230通過泵220移出的通道。然后可以將這些固體物經管線160送出用于木素處理或者被分別移出或排棄。然后將葡萄糖以及任何含未水解纖維素的顆粒和含木素的顆粒經管線240從所述第二水解反應器200的頂部排出，并導入沉,250中。所述固體在所述沉,250底部沉降，且含葡萄糖的所述水解產流體30經泵260移出。所述沉降的固體被泵270經管線280從所述沉,250泵出。然后這些固體經管線160被送出用于木素處理。流體30被送遞至所述第一熱交換器或者用于通過酵母發(fā)酵成乙醇。實施例3:通過包括具有纖維素結合域(CBD)的P-葡萄糖苷酶的酶進行纖維素水解本實施例描述通過底物的固體分離和再懸浮對預處理的纖維素進行水解。使用具有CBD的fi-葡萄糖苷酶水解的性能優(yōu)于使用不具有CBD的P-葡萄糖苷酶的性能。通過用0.6。/減酸(w/w)連續(xù)預處理原料并且以蒸汽加熱至183t:達3分鐘，準備了預處理的小麥稈。所述預處理的原料經過量的水沖洗，并經真空過濾以除去大部分的水。所述沖^^的原料塊包含30%的固體，并且所述固體包含51%的纖維素，余量主要包含木，、木素和二氧化硅。來自木霉深度培養(yǎng)發(fā)酵物的兩種纖維素酶混合物被用于該實驗中。兩種混合物都包含提高水平的P-葡萄糖苷酶，以保證在水解過程中不積聚纖維二糖。葡萄糖苷酶的7JC平通過WhiteandHindle，美國專利6，015，703的方法提高。一個混合物包含163g/L蛋白和131IU/mL濾紙纖維素酶活性。該批("常規(guī)的")包含缺乏纖維素結合域的天然P-葡萄糖苷酶。所述33e-葡萄糖苷酶活性通過Ghose(1987)的標準測定測量為1235IU/mL。第二批("具有CBD的pg")包含32.5g/L的蛋白，20.7IU/mL的濾紙纖維素酶活性，以及250IU/mL的P-葡萄糖苷酶活性。實施例5更詳細地描述了具有CBD的P-葡萄糖苷酶的制備。通過使用250mL的螺;^燒瓶進行了纖維素水解。所述總水解重量是每燒瓶IOOg，濃度相當于5%纖維素的預處理小麥稈中以每克纖維素16或24mg蛋白的劑量添加的酶，余量包含pH4.8的50mM的檸檬酸鈉緩沖液，其中含0.5%苯曱酸鈉作為防腐劑。在添加所述酶之前，在501C下通過振蕩燒瓶將所述預處理小麥稈底物在所述緩沖液中水化過夜。在所述水解過程中，所述燒瓶在501C的轉動搖床中以250rpm振蕩。對于使用過濾和再懸浮的7jc解，在24小時的時候將所述燒g所述搖床上移出，然后將其內含物經iti^璃微纖維濾紙真空過濾。測量所述濾液體積為40-50mL,用等體積pH4.8的50mM檸檬酸鈉緩沖液替換所述濾液。與在過濾和再懸浮之前進行的水解類似，然后繼續(xù)所述振蕩水解96小時。對于常規(guī)的水解，振蕩著進行所述水解120小時而不進行過濾或再懸浮。對于所有水解，周期性地取出800ML樣品并轉移至微型離心過濾器中，并以12，000rpm離心2分鐘，從所述水相分離不溶性固體。收集所述上清液用于葡萄糖分析。在離心前通過煮沸5分鐘iM^驗大部分樣品，以確保纖維二糖未積聚。通過酶法測量所述上清液中的葡萄糖濃度。通過在HPLC上測量確認低纖維二糖濃度(〈1g/L)。在每次水解結束后進行基于使用泉琉酸的水解的纖維素測定，并基于葡萄糖測量確認未轉化纖維素的濃度。圖2A示出了使用具有CBD的p-葡萄糖苷酶的纖維素酶的水解結果，其中纖維素酶劑量為每克纖維素中16mg蛋白。所述再懸浮的水解優(yōu)于不經再懸浮而進行的常規(guī)水解。其原因是24小時后過濾所述水解物除去了大量存在的葡萄糖。通過除去所述葡萄糖，消除了所述終產物對纖維素酶的抑制，并且與所述常規(guī)水解中存在葡萄糖的情;;U目比，所述水解以較高的速率進行并且可達到更高的轉化水平。有效水解所需的0-葡萄糖苷酶結合于纖維素并被攜帶至所述再懸浮7jc解液中。圖2B示出了與圖2A相似的結果，不同之處是所述酶劑量為24mg/g，而不是圖2A中的16mg/g。圖3示出了用常規(guī)纖維素酶的水解，其中所述P-葡萄糖苷酶缺乏CBD。34以16和24mg/g的劑量進行所述水解24小時。在此時，將所述漿液過濾，并且將所述水解物再懸浮并繼續(xù)水解。再懸浮之后的水解速率纟艮低，產生很少的葡萄糖。這種較低的水解速率的原因是所述P-葡萄糖苷酶缺乏CBD且不與所述纖維素結合，更確切地是在過濾過程中隨濾液流失。纖維二糖的積聚會抑制纖維素酶并降低水解速率。實施例4:具有CBD的P-葡萄糖苷酶與漂白的小麥稈纖維素的結合通過陰離子交換色鐠及隨后的陽離子交換色譜從全纖維素酶混合物中純化P-葡萄糖苷酶和具有CBD的p-葡萄糖苷酶。在41C或50X:下，所述純化蛋白與用檸檬酸緩沖液調節(jié)至pH4.8的2.56g/L預處理小麥稈，或者僅與pH4.8的檸檬酸緩沖液孵育30分鐘。在孵育后，將所述樣品離心并將上清液級分通過SDS-PAGE進行分析(圖4A和4B)。如圖4A中所示，在存在或不存在預處理小麥稈的情況下在41C下孵育后，在上清液中檢測到相同量的P-葡萄糖苷酶。這被66kDa處的帶所表明，并表明了缺乏CBD的p-葡萄糖苷酶不與所述預處理的小麥稈結合。相反，純化P-葡萄糖苷SI"CBD完全與預處理的小麥稈結合，在所述上清液中沒有檢測到它們，這被以下結果表明即在不存在預處理的小麥稈情況下有70kDa的帶，并且在存在預處理的小麥情況下所述帶消失。這i兌明，CBD是P-葡萄糖苷酶結合至所述纖維固體所需的。在50"C下得到了類似的結果(圖4B)。實施例5:p-葡萄糖苷酶/CBD融合物在里氏木霉(7Wc/^cfef附"中的表達該實施例描述了M氏木霉林M2C38A^因修飾的衍生體分離基因組DNA，構建基因組DNA文庫，克隆多個基因，來自里氏木霉株M2C38的遺傳構建體，以及P-葡萄糖苷酶/CBD遺傳構建體在里氏木霉林BTR213中的轉化和表達。里氏木霉抹M2C38和BTR213是IogenCorporation的專利抹(proprietarystrain),它們矛汴生自里氏木霉林RutC30(ATCC56765，MontenecourtandEveleigh,脅.C6e邁.紋，1979，181:289-301),后者又衍生自里氏木霉林Qm6A(ATCC13631MandelsandReese,/勘c^i7o人，1957，73:269-278)。在該實例中，限制性內切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶和大腸桿菌DNA多聚酶1的Klenow片段購自Gibco/BRL、NewEnglandBiolabs、BoehringerMannheim或Pharmacia,并依照這些廠商的建議使用。具有校讀活性的7Vo聚合酶(BoehringerMannheim)根據廠商的方案被用于所有多聚SIM:式反應(PCR)中。潮霉素B購自CalBiochem。5.l克隆里氏木霉^/厶c6力Ac6力么j^/L和/^i"基因。為了分離基因組DNA，用無菌接種環(huán)將從馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板收集的里氏木霉孢子接種于50mL的馬鈴薯葡萄糖肉湯(Difco)中。在281C下以200rpm將培養(yǎng)物振蕩2-3天。將菌絲體在GFA玻璃微纖維過濾器(Whatman)上過濾并用冷的去離子水清洗。將真菌塊在液氮中凍結并且用預冷的研缽和研桿研磨成粉末；將0.5g粉末化的生物菌體再懸浮于5mLpH7.5的100mMTris、50mMEDTA加1%的十二烷_^^酸鈉(SDS)溶液中。將裂解產物離心(41C，5000g離心20分鐘)以使細J!W片成片狀沉淀。將上清液用l倍體積的緩沖液(10mMTris、1mMEDTA,pH8)-飽和的苯酚萃取，然后用1倍體積的緩沖液-飽和的苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)萃取以去除可溶蛋白。通過添加0.1倍體積pH5.2的3M醋酸鈉及2.5倍體積冷的95"yi乙醇從溶液中沉淀DNA。在-201C下孵育至少1小時后，通過離心(4t:,5000g離心20分鐘)使DNA沉淀成片，用10mL70%乙醇沖洗，在空氣中晾干并再懸浮于1mLpH8.0的10mMTris、1mMEDTA溶液中。通it^p入核糖核酸酶A(BoehringerMannheim)至終濃度0.1mg/mL并在37x:下孵育1小時消化RNA。依次用1倍體積的緩沖液飽和的苯酚和1倍體積的緩沖液飽和的苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)萃取以從該DNA溶液中去除核糖核酸酶。再次用0.1倍體積pH5.2的3M醋酸鈉及2.5倍體積冷的954乙醇沉淀所述DNA,通過離心4吏之成片，用70%的乙醇沖洗，在空氣中晾干并再懸浮于50pLpH8.0的10mMTris、1mMEDTA溶液中。通過測量溶^^260nm下的吸光度確定DNA的^l度(p.CIinSambrook,FritschandManiatis，"MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarborPress1989,在后文中稱為Sambrook使用從里氏木霉菌林M2C38分離的基因組DNA構建兩個質粒文庫和一個噬菌體文庫。在質粒pUC119中構建所述質粒文庫(VieraandMessing,"Isolationofsingle—strandedplasmidDNA",MethodsEnzymol.153:3，1987)，步驟如下將體積IOOpL的lOjag基因組MA在37"C下用2單位/yg的^//7fi0n、勘/zfll或fcoRl限制性內切酶消化20小時。將該消化的DNA于0.04MTris-醋酸鹽、1mMEDTA中用0.75%瓊脂糖亂&電泳進行分離并用溴化乙錠染色。將對應于目的基因大小漆于發(fā)表的信息和DNA印跡)的皿片切下并經過電洗脫以回收DNA片段(Sambrooketal.,第6.28-6.29頁)。通扭含有20-50ng/mL的載體:插入DNA摩爾比為2:1的DNA、1mMATP及5單位T4DNA連接酶且總體積為10-15pL的連接反應液中于4'C下反應16小時，將這些富集的DNA片段連接至pUC119中以形成基因文庫。使用CellPoratorSystem(Gibco/BRL)依照廠商的方案將該連接反應物電穿孔大腸桿菌菌林hb101，并在含70mg/mL氨千青霉素的LB瓊脂上篩選轉化體。通過菌落轉移雜交(colonylifthybridization)鑒定了攜帶來自于重組體pUC119-#//7孤、或-fcoRI文庫的c6力入c始2或克隆的大腸桿菌HB101轉化體將l-3x1(T個菌落轉移至HyBond加尼皿(Amersham)上；將膜的菌落面向上置于用0.5MNa0H、1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘以裂解細菌細胞并變性DNA;然后通過將膜的菌落面向上置于用pH7.5的1.5MTris、1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘進行中和；將膜在空氣中晾30分鐘，然后通過在80匸下烘烤2小時將所述DNA固定于膜上。在含有10-50ng耙DNA、0.2mM每種d(GCT)TP、0.5pMdATP、20-40nCioc-32p-dATP、10pmole寡核苷酸引物和O.5單位Taq聚合酶且總體積為20jiL的標記反應液中，通^±^)7/5孤、勘izfll或fcoRl片段的富集池中分別PCR擴增&/厶cM7和c6力2編碼區(qū)的短片段(0.7-1.5kB)制備了32p-標記的探針。該反應經過6-7個擴增循環(huán)(95X:，2分鐘；56匸，1.5分鐘；70匸，5分鐘)。通過加入0.5mL10%(w/v)三氯醋酸和0.5mg酵母tRM沉淀所述擴增的"P-標記的DM。通過微量離心4吏DNA成片沉淀，用1mL70%的乙醇沖洗2次，在空氣中晾干并再懸浮于pH7.5的1MTris、1mMEDTA溶液中。將已經固定有重組pUC119質粒的尼龍膜在熱封口的袋中于60-65t:下于pH7.5的lMNaCl、1%SDS、50mMTris、1mMEDTA溶液中用含100jug/mL變性的剪切鮭精DNA預雜交l小時。在熱封口的袋中于60-65匸下于相同緩沖液中用僅含50pg/mL變性的剪切鮭精DNA及5x106-5x10737cpm變性的^/厶c6/l或c6力2探針雜交16-20h。將膜用lMNaCl、0.5%SDS于60X:下沖洗1次，持續(xù)15分鐘；用O.3MNaCl、0.5%SDS于60匸下沖洗2次，每次持續(xù)15分鐘；用0.03MNaCl、0.5%SDS于55匸下沖洗1次，持續(xù)15分鐘。將膜再次放入熱封口的袋中并在-70C下暴露于KodakRPX射線膠片下16-48小時。依照廠商的方案將X-射線膠片顯影。挑選顯示強信號或弱信號的菌落并在含70jug/mL氨千青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用堿裂解法(Sambrook，etal.，第1.25-1.28頁)從這些培養(yǎng)物中分離質粒DNA，并通過限制性消化、DNA雜交(Sambrook，etal.，第9.38-9.44頁)和PCR分析(Sambrook，etal.，第14.18-14，19頁)進行分析。通過用1.0kb的^A探針進行的pUC119-#/77孤文庫的菌落轉移雜交鑒定了攜帶^/7基因的克隆，所述探針是使用設計用于擴增公開的序歹i"Barnett，Berka，andFowler，見"CloningandAmplificationoftheGeneEncodinganExtracellularP-glucosidasefrom7Wc力ocfer鵬ree夕e/:EvidenceforImprovedRatesofSaccharificationofCellulosicSubstrates"Bio/Technology,第9巻，June1991，第562-567頁，在本文中稱為"Barnett，etal.")的bp462-1403的寡核苷酸引物制備的。分離了^//克隆pJEN200,它包含6，0kb的對應于啟動子、結構基因和終止序列的#//7孤片段。通過用0.7kb的c6/l探針進行的pUC119-勘/aHl文庫的菌落轉移雜交鑒定了攜帶c6力7基因的克隆，所述探4十是^吏用i殳計用于擴增^^開的c6力7序列(Shoemaker,Schweikart,Ladner，Gelfand，Kwok，MyamboandInnis，"Molecularcloningofexo-cellobiohydrolyase1derivedfrom7Wc力oder邁areese/strainL27"，Bio/Technology1:691-696，1983，在下文中稱為Shoemaker"a/.)的bp597-1361的寡核苷酸引物制備的。分離了c6力7克隆pC0R132,它包含5.7kb的對應于啟動子(4.7kb)和lkb的c6/l結構基因的勘iaHl片段。通過這，將2.5kb的含有c6/l啟動子(2.1kb)和5'末端c6力7編碼區(qū)(0.4kb)的fcoRl片段亞克隆至pUC119中，生成pCB152。通過用1.5kb的c6力2探針進行的對pUCl19-fc凍l文庫的菌落轉移雜交鑒定了攜帶的克隆，所述探針是使用設計用于擴增公開c始2序列(Chen，GritzaliandStafford,"NucleotidesequenceanddeducedprimarystructureofcellobiohydrolaseIIfrom7Wc力odei"邁areese/"，Bio/Technology5:38274-278，1987,在下文中稱為Chen"".)的bp580-2114的寡核苷酸引物制備的。分離了MA克隆pZUK600,它包含4.8kb的對應于啟動子(600bp)、結構基因(2.3kb)和終止子(1.9kb)的fcoRl片段。在入載體XDASH(Stratagene,Inc.)中構建噬菌體文庫，步驟如下用2、1、0.5和0.5單位/jug的勘iaHI在37"C下消化基因組DNA(3jng)1小時，產生9-23kB大小的片段。M次消化產生的DNA通過以下步驟純化用l倍體積的Tris-飽和的苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)萃取，然后用10juLpH5.2的3M醋酸鈉及250/i195%乙醇(-201C)沉淀。通過微量離心使該消化的DNA成片沉淀，用0.5mL冷的70%乙醇沖洗，在空氣中晾干并再懸浮于IOnL無菌的去離子水中。通過瓊脂糖皿電泳(在O.04MTris-醋酸鹽、1mMEDTA中的0.8%瓊脂糖)確認9-23kB大小的DNA片段的富集。在含有2單位T4DNA連接酶和1mMATP的總體積為5n1的反應液中于41C下反應過夜，將消化的DNA(0.4pg)連接至lyg以勘/zfll(Stratagene)預消化的XDASH臂中。使用GigaPacknGold包裝蛋白(packagingextracts)(Stratagene)依照廠商的方案將連接混合物包裝至噬菌體顆粒中。用大腸桿菌宿主菌林XL1-BlueMRA(P2)滴定該文庫，發(fā)現其含有3x105個獨立克隆。使用DIG標記和探測試劑盒(BoehringerMannheim)#^照廠商方案，通過隨機引物標ie^PCR擴增的c始Ax/z^和/^ir基因的編碼區(qū)制備了異羥基洋地黃絲配基-11-dUTP(Digoxigen-11-dUTP)標記的探針。通斷XDASH文庫的噬斑轉印雜交鑒定了含有c6力厶WW和/7^基因的基因組克隆。對于每個目的基因，將lx104個克隆轉移至Nytran(SchleicherandSchull)尼;W上。通it將膜的喧斑面向上置于用0.5MNa0H、1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5^裂解噬菌體顆粒并變性噬菌體DNA;然后通過將膜的喧斑面向上置于用pH7.5的1.5MTris、1MNaCl^的印i^l氏(VWR238)上5糾進行中和;將膜在空氣中晾30辨，然后通狄80X:下烘烤2小時將DNA固定于膜上。將膜在熱封口的袋中于65X:下用含6xSSPE、5xDenhardt、1%SDS加100jig/mL變性的剪切,DNA的溶液預雜交2小時。然后將膜在熱封口的袋中于65X:下用含50yg/mL變性的剪切絲DNA及0.5jig異鞋基洋地黃絲配基一dUTP標^^針的相同緩沖液雜交過夜。將膜用2xSSPE、0.1%SDS于室溫下沖洗15分鐘2次，用0.2xSSPE、0.1%SDS于65C下沖洗15分沖2次，用2xSSPE沖洗5分沖1次。依照廠商的方案，通過與抗-異羥基39洋地黃4^配基/堿性磷酸酶抗體綴^^、5-溴-4-氯-3-吲咮磷酸和4-硝基藍四氮唑(BoehringerMannheim)的^鑒定了陽性雜交克隆。通過用異羥基洋地黃^配基-dUTP標i2^針的第二輪篩選進一步純化了陽性雜交克隆。按照SambrookWa/.(1989)第2.118-2.121頁中的描述，分離單克隆及純化噬菌體DNA不同^Jt是CsCl梯度步驟由使用l倍體積的苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)及1糾積的氯仿異戊醇(24:1)的萃取所^R。用0.1糾積pH5.2的3M醋酸鈉及2.5倍體積冷的95%乙醇沉淀DM。用0.5mL冷的70%乙醇沖洗沉淀的噬菌體DM,在空氣中晾干并再懸浮于50nLpH8.0的10mMTris、lmMEDTA溶液中。通過將純化喧菌體DNA限制性消化及使用與用于篩選入DASH文庫的相同的異鞋基洋地黃4^配基-dUTP標i2^針進行MA印跡雜交(Sambrook，etal.，第9.38-9.44頁)，鑒定包含目的基因的限制片段。通過與用于噬斑轉印的相同的方法雜交所并顯影陽性雜交的片段。一S^定了來自每個ADASH克隆的所需限制片段，重復進行限制性消化，將片段于TAE中用0.8%瓊脂糖皿上分離并切下所需的帶。使用SephaglasBandPr印試劑盒(Pharmacia)依照廠商的方案從凝膠片上洗脫所述DNA。通過4吏用含有7^開c6力/序列(Shoemakeretal.)的bp45-2220的c6力7探針進行的對入DASH文庫(實施例2)的菌落轉移雜交，鑒定了攜帶cM7基因的克隆。通過將從XDASHc6力7克隆純化的噬菌體DNA進行限制性消化分離了1.8kb的含c6力7編碼區(qū)(0.5kb)的3，端和c6W終止子(1.3kb)的勘/zfll片段。將該片段亞克隆入大腸桿菌質粒載體pUC119的勘/aHl位點，生成質粒pCBlTa。通過4吏用含有7〉開W/l序歹iJ(Saarelainen，Paloheimo，Fagerstrom，SuominenandNevalainen,"Cloning,sequencingandenhancedexpressionofthe7Wc力ocfer鵬reese/endoxylanasen(pi9)geneW/2"，Mol.Gen.Genet.241:497-503，1993,在后文中稱為Saarelainenetal.)的bp100-783的x/W探針進行的對入DASH文庫(實施例2)的菌落轉移雜交，鑒定了攜帶W/^基因的克隆。通過將從入DASHW/^克隆純化的噬菌體DNA進行限制性消化分離了5.7kb的含j^72的啟動子(2.3kb)、編碼區(qū)(0.8kb)和終止子(2.6kb)的片段。將該片段亞克隆入pUC119的化/zl位點，生成質粒pXYN2K-2。通過使用含有公開序歹寸(Vanhanen，Penttila，LehtovaaraandKnowles，"Isolationandcharacterizationofthe3-phosphoglyceratekinasegene(p^ir)fromthefilamentousfungus7Wc力octer鵬reese/"，Curr.Genet.15:181—186，1989)的bp4-1586的探針進行的對入DASH文庫(實施例2)的菌落轉移雜交，鑒定了攜帶/7W基因的克隆。通過將從入DASH/7#克隆純化的噬菌體DM進行限制性消化分離了5.0kb的含/^i基因的啟動子(2.9kb)、編碼區(qū)(1.6kb)和終止子(0.5kb)的化oRl片段。將該片段亞克隆入pUC119的fcoRl位點，生成質粒pGK5.0。5.2種建/-^萄潛奪雜奴迷4'謬X/H-C朋-7T本實施例描述了構建這樣的一種載體，即該載體被設計成表達成熟P-葡萄糖苷酶編碼區(qū)和包含木霉屬纖維二糖水解酶I的接頭-纖維素結合域的肽的融合蛋白。在該構建體中，融合蛋白的表達由木霉屬纖維4水解酶I(c6力i)啟動子和木聚糖酶(xln2)分泌信號肽指導。使用引物以月ra聚合酶從所述基因組&/7克隆pJEN200中擴增缺少C-末端丙氨酸殘基的p-葡萄糖苷酶編碼區(qū)(bp474-2679)，以在公開的&/7序列(Barnettetal.)的上游恰好bp474處插入J6al位點，在bp2676處插入化/7l位點，后者在終止密碼子后1個密碼子處。該擴增片段不經過消化即被亞克隆至pUC19的S啦l位點，生成質粒pBgnsl。通過用Z6a/和iT/ml消化從pBgnsl中釋放缺少終止密碼子的并插入至用Z6a7和iT/w7消化的pCB219N中，生成pBgns2。為了制備pCB219N，使用對應于公開的c6A基因(Chenetal.，1987)3，非翻譯區(qū)的bp2226-2242同源且在5，端包含"/l位點的引物以及與pZUK600中c6力2的3'端的fcoRl位點下游退火的pUC正向引物(Cat.No.1224，NewEnglandBiolabs),從pZUK600模板擴增c6力2終止子片段。在設計的和fcoRl位點消化該片段，并插入至pUC119的相應位點，生成pCB219。將fcoR1-^打接頭(Cat.No.35310-010，Gibco/BRL)插入至pCB219的單fcoRl位點，生成pCB219N。使用包含直接位于公開的義//2序列(Saarelainenetal.)的bpl02下游的船el位點的x/W專用引物以及與1//72基因5'端的i^/l位點的上游退火的pUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)，以/Vo聚合酶從所述基因組x/z^亞克隆pXYN2K-2中擴增包含j7tz2基因啟動子和分泌信號的2.3kb片段(bp-2150至+99，其中+1表示ATG起始密碼子)。該i//lPCR產物經fcoRl(它作為來自pXYN2K-2的pUC119聚合接頭的一部分被擴增)和順el消化，并被_插入至質粒pBR322L中，該質粒是通it^勤力l和5W1位點之間插入5^1-yWl-5Wl接頭從質粒pBR322制備的。然后用Klenow41鈍化所形成的質粒pBR322LXN中的z/z^啟動子5'端的AcoRl，并添加^el接頭(Cat.No.1086，NewEnglandBiolabs)生成pBR322SpXN。通過m消化c6力7基因組亞克隆pCB152分離包含c始7啟動子的bp-1399至-204的1.2kb#//7孤片段。該片段被用于替換載體pBR322SpXN中包含j7/2啟動子的bp-1400至bp-121的#//2孤片段，生成質粒pBR322C/X。用和勘H切割pBgns2質粒，并分離包含無終止密碼子的編碼區(qū)以及之后的c6A終止子的4.2kb片段。將該序列插入至用順el和;Vbrt和J6al具有相容的突出端)切割的質粒pBR322C/X中。進行這種克隆形成了這樣的表達盒，即可以在c6w啟動子和1//72分泌信號肽控制下從該表達盒表達無終止密碼子的成熟P-葡萄糖苷酶。該表達盒質粒為pC/XBgns，且在所述^/7編碼區(qū)和所述c6力2終止子之間具有單f/wl位點。為了獲得c6力7接頭和CBD區(qū)，使用引物通過PCR擴增含有公開c6/l基因(Shoemakeretal.)bpl665至bp1882bp的DM片段，在所述片段的5'端同時插入f/wl和ii7el位點并在3'端插入vT;wl位點。定位所述5'化"1位點，以使得pC/XBgns中的^/7編碼區(qū)的閱讀框和^力7接頭+CBD的閱讀框精確融合。所述3'"/l位點緊接著位于所述天然c6力7編碼區(qū)終止密碼子之后。這個215bp的PCR產物經f/wl消化并插入至pC/XBgns的單iT/wl位點中，產生最終的表達盒載體pC/XBg-CBD。作為插入所述限制位點的結果，該構建體表達的最終融合蛋白將在^/7編碼序列的Val713和c6W的編碼區(qū)的Ile474之間包含3個額外的氨基酸(Pro-Thr-Ser)。使用/Vo聚合酶AMI"粒pVU1005(VandenElzen，Townsend，LeeandBedbrook，"Achimaerichygromycinresistancegeneasaselectablemarkerinplantcells",PlantMol.Biol.5:299-302，1989)中擴增用作里氏木霉選擇性標記的大腸桿菌潮霉素磷酸轉移酶基因(力/必。設計引物以分別在力;力編碼區(qū)(公開力p力序列的bp211-1236，GritzandDavies，"Plasmid-encodedhygromycinbresistance:thesequenceofhygromycinBphosphotransferasegeneanditsexpressioninEscherichiacoliandSaccharomycescerevisiae"Gene25:179-188,1983)的5'和3'端引入和位點。所述PCR產物經辦力l和)^/zl消化，并被插入至pUC119的聚合接頭區(qū)的相應位點中。所得到的質粒pHPT100被用作起始質粒用于構建所i^擇盒。在該質粒中引入兩個新的接頭區(qū)，以有利于在木霉屬宿主中插X^達力/A基因必需的啟動子和終止子片段。在所述力W序列5'端#//7孤和&力1位點之間插入-J6al-Z力o1-&力1接頭，并在所述力/力序列3'端f/wl和i^cl位點之間插入f/7/zI-^a-5^I接頭之間插入。該構建g稱為pHPT102。設計用于擴增/7^i"啟動子(Vanhanen，Saloheimo，Ilmen,KnowlesandPenttila，"Promoterstructureandexpressionofthe3-phosphoglyceratekinasegene(/7^ir力of7Wc力ocfer邁areese/"，Gene106:129-133，1991)的引物，以分別在所述啟動子的位置-970和+1處引入位點和S/7力I位點。這些位點在IC^被用于將啟動子插入至pHPT102的J7wl和&力1位點中，生成pHPT115。使用與在bp1877-1882包含"il位點的3'非翻譯區(qū)(公開的c6力7序列的bp1864-1899)退火的引物以及與pCBlTa中c6力7終止子3'端&oRl位點的下游退火的pUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)，以月ra聚合酶從pCBlTa中擴增1.3kbc6力7終止子片段。所述c6力/終止子PCR產物經"/l消化，并插入至pHPT115的單iT/7/zl位點中，生成選擇性盒質粒pHPT136。為了制備所述轉化載體,通過以下方式從pC/XBg-CBD中分離包含啟動子的5'遠端區(qū)、cMJ啟動子的bp-1399至-204、,//72啟動子的bp-121至+99和分泌信號肽、P-葡萄糖苷酶/CBD融合物的編碼區(qū)以及c6力2終止子的5.8kb表達盒用iVbtl消化，用KlenowDNA聚合絲化所述iVbrt位點并用^el消化。將該5.8kb^el/A^1片段插入至這樣的pHPT136的力/力分泌盒的單上游中，即該pHPT136經Z/wl消化，以KlenowDNA聚合S^fc化并且經J6al消化(處el和J&l具有相容的突出端)。在所述力/A分泌盒中cM7終止子的3'末端的單位點將所述最終轉化栽體pC/XBg-CBD-TV線性化，并將其作為線性載體經如下所述的微粒轟擊引入里氏木霉BTR213中。乂遂鄉(xiāng)產絲必_^雄2"將BiolisticPDS-1000/He系統(BioRad;E.I.DuPontdeNemoursandCompany)用于轉化里氏木霉林BTR213的孢子，所有步驟如廠商的推薦進行。M-IO鵠顆粒(O.7ym的中間粒徑)被用作微載體。如下的參數被用于優(yōu)化所述轉化1100psi的破裂壓強、29mmHg的氦壓強、0.95cm的間距、16mm的巨載體穿行距離以及9cm的to巨離。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上用lxl()e個孢子制備平板。在28t)下孵育轟擊的平板。在轟擊4小時后，通過鋪加添加40單位/mLHygB的選擇性PDA培養(yǎng)基對孢子進行初M擇。在281C下孵育轟擊的平板。在3-6天的培養(yǎng)后可觀察到轉化體；然而，需要進一步孵育以獲得孢子形成。在孢子形成開始后，進行第二選擇過程以分離單個的轉化體。用接種環(huán)從所述平板上采集孢子，并再懸浮于無菌水中。然后將該懸浮物濾過以玻璃微纖維插塞的無菌注射器。這使得孢子通過，而將不需要的菌絲體留下。需要確定該懸浮物中的孢子濃度，隨后將稀釋物鋪于添加0.75%Oxgall(Difco)和HygB(20單位/mL)的PDA平板上，得到每平板20-50個孢子。將Oxgall作為菌落限制劑，從而使得單菌落在這些第二選擇平板上分離。在2-3天后可觀察到分離的菌落。丄4在濕沐潛##〃-,萄溏茅雄將木霉屬的單菌落轉移至PDA平板上用于繁殖每個培養(yǎng)物。孢子形成是均勻地接種振蕩燒瓶所必需的，這些燒瓶被用于測驗所述培養(yǎng)物產生P-葡萄糖苷酶和纖維素酶的能力。所述培養(yǎng)基的組分如下表2:培養(yǎng)基組分組分濃度(NH4)2S046.35g/LKH2P04楊g/LMgS047H202.02g/LCaCl2'2H200.53g/L玉米漿6.25g/LCaC0310.00g/L碳源"5-10g/L微量元素*1mITL*微量元素溶液含5g/LFeS047H20;1.6g/LMnS04H20;1.4g/LZnS047H20。**5g/L葡萄糖加10g/LSolkafloc(當使用c6力7或其他纖維素酶啟動子時)、10g/L木聚糖(當使用x/z^啟動子時)或與指導P-葡萄糖苷酶表達的啟動子相容的其他碳源。碳源可以在pH2至7下作為水性溶液單獨滅菌，然后加入至其余溶液中。每個1升燒瓶中的液體體積是150mL，初始PH為5.5,并且在接種前將每個燒瓶于121X:下通過蒸汽高壓滅菌器滅菌30分鐘。對于天然細胞和轉化的細胞，如上文5.3節(jié)中所ii^PDA平板分離孢子，并在每個燒瓶中接種l-2x106個孢子。在28X:下以200rpm振蕩所述燒瓶6天。通過濾過GF/A玻璃微纖維(Whatman)收集包含分泌性蛋白的濾液。使用Bio-Rad蛋白測定(Cat.No.500-0001)并以木霉屬纖維素8|#為標準確定所述蛋白濃度。如Ghose，1987中所述確定p-葡萄糖苷酶活性。丄J炎>^A/h/7oc^T,遞《f式^tf^A7^Z^;^—絲潛絲使用實施例5D的步驟以10g/LSolkafloc和5g/L葡萄糖作為碳源培養(yǎng)天然林BTR213和來自該宿主的4H^1059A。結果顯示于表2中。所述天然林產生0.19IU的P-葡萄糖苷酶/mg蛋白。從c始J啟動子和1//72分泌信號表達P-葡萄糖苷酶/CBD融合物的轉化體1059A產生7.6IU/mg的P-葡萄糖苷酶。ii^明比天然林增加40倍，所述天然林代表大多數的p-葡萄糖苷酶水平。表3:在150mL的燒瓶培養(yǎng)物中由里氏木霉林BTR213和1059A產生P-葡萄糖苷酶的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>權利要求1.一種用于酶法水解纖維素以從預處理的木質纖維素原料產生含葡萄糖的水解產物的酶組合物，所述酶組合物包含纖維素酶、一種或多種β-葡萄糖苷酶以及用于將所述β-葡萄糖苷酶結合至所述預處理的木質纖維素原料上的粘合劑，其中所述水解通過以下步驟實現(i)用所述酶組合物部分地水解所述預處理的木質纖維素原料的水性漿液以產生含有葡萄糖、葡萄糖寡聚體或它們的組合的水解漿液，以及包含纖維素和木素的未水解纖維固體；(ii)從所述水解的漿液分離出所述未水解的纖維固體以產生分離的纖維固體，其中所述纖維素酶和所述一種或多種β-葡萄糖苷酶與所述分離的纖維固體結合；(iii)將所述分離的纖維固體再懸浮于一種水性溶液中以產生再懸浮漿液；以及(iv)繼續(xù)水解所述再懸浮漿液以產生含葡萄糖的水解產物。2.根據權利要求1的酶組合物，其中所述粘合劑為一種可操作連接至所述一種或多種P-葡萄糖苷酶上的碳水化合物結合模塊。3.根據權利要求2的酶組合物，其中所述碳水化合物結合模塊是一種纖維素結合域。4.根據權利要求1的酶組合物，其中所述纖維素酶由曲霉屬(^/7e^27/w)、腐質霉屬(^咖/co/a)、木霉屬(7Wc力Me，a)、芽孢桿菌屬(勘c///^)、喜熱裂孢菌屬(7eiYzw6//7cfe)或它們的組合產生。5.根據權利要求4的酶組合物，其中所述纖維素酶由木霉屬產生。6.根據權利要求1的酶組合物，其中所述一種或多種p-葡萄糖苷酶由曲霉屬0^/76"http:///"5)、腐質霉屬(仇ra/co/a)、木霉屬(7Wc力ocfer咖)、芽孢桿菌屬(勘c/7/z/5)、喜熱裂孢菌屬(r力er邁o6/y六fe)或它們的組合產生。7.根據權利要求6的酶組合物，其中所述一種或多種p-葡萄糖苷酶由木霉屬或曲霉屬產生。8.根據權利要求3的酶組合物，其中所述纖維素結合^A家族I纖維素結合域。9.根據權利要求3的酶組合物，其中所述纖維素結合^A細菌或真菌纖維素結合域。10.根據權利要求3的酶組合物，其中所述一種或多種p-葡萄糖苷酶包含一種將所述纖維素結合域可操作地連接于所述P-葡萄糖苷酶的接頭。11.根據權利要求1的酶組合物，其中所述一種或多種P-葡萄糖苷酶U然存在的。12.根據權利要求1的酶組合物，其中所述一種或多種e-葡萄糖苷酶U因子務飾的融^^白。13.根據權利要求3的酶組合物，其中存在于所述酶組合物中的總p-葡萄糖苷酶的約75。yi至約100%(w/w)包含纖維素結合域。14.根據權利要求13的酶組合物，其中存在于所述酶組合物中的總P-葡萄糖苷酶的約90%至約100%(w/w)包含纖維素結合域。15.根據權利要求l的酶組合物，其中所述纖維素酶包括選自纖維素酶CBHI和CBHn及它們的組合的纖^j^t水解酶，以;sj逸自纖維素酶EGi、EGn、EGIV、EGV和EGVI及它們的組合的內切葡,酶。16.根據權利要求1的酶組合物，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，存在于所述酶組合物中的總纖維素酶的約75%至約10(W(w/w)與存在于所述水性漿液中的纖維固體結合。17.—種酶組合物用于酶法水解纖維素以從預處理的木質纖維素原料產生含葡萄糖的水解產物的用途，所述酶組合物包含纖維素酶、一種或多種P-葡萄糖苷酶以及用于將所述P-葡萄糖苷酶結合至所述預處理的木質纖維素原料上的粘合劑，其中所述酶組合物的用途包含漿液以產生含有-葡萄糖、葡萄糖寡聚體或它們的l且合的^解漿液，以及包含纖維素和木素的未水解纖維固體；(ii)WJ斤述水解的漿液分離出所述未水解的纖維固體以產生分離的纖維固體，其中所述纖維素酶和所迷一種或多種fi-葡萄糖苷酶與所述分離的纖維固體結合；(iii)將所述分離的纖維固體再懸浮于一種水性溶液中以產生再懸浮的漿液；以及(iv)繼續(xù)水解所述再懸浮的漿液以產生含葡萄糖的水解產物。18.根據權利要求17的所述酶組合物的用途，其中所述粘合劑是一種可操作連接至所述一種或多種0-葡萄糖苷酶上的碳水化合物結合模塊。19.根據權利要求18的所述酶組合物的用途，其中所述碳水化合物結合模塊是一種纖維素結合域。20.根據權利要求17的所述酶組合物的用途，其中在所述部分7jc解步驟(步驟(i))中，所述纖維素酶由曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽孢桿菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。21.根據權利要求20的所述酶組合物的用途，其中所述纖維素酶由木霉屬產生。22.根據權利要求17的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述一種或多種P-葡萄糖苷酶由曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽#菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。23.根據權利要求22的所述酶組合物的用途，其中所述一種或多種p-葡萄糖苷酶由木霉屬或曲霉屬產生。24.根據權利要求19的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述纖維素結合J^A家族I纖維素結合域。25.根據權利要求19的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述纖維素結合^A細菌或真菌纖維素結合域。26.根據權利要求19的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述一種或多種p-葡萄糖苷酶包含一種將所述纖維素結合域可操作地連接于所述P-葡萄糖苷酶的接頭。27.根據權利要求17的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述一種或多種P-葡萄糖苷酶是天然存在的。28.根據權利要求19的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述一種或多種P-葡萄糖苷酶是基因修飾的融M白。29.根據權利要求19的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，存在于所述酶組合物中的總P-葡萄糖苷酶的約75%至約100°/。(w/w)包含纖維素結合域。30.根據權利要求29的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，存在于所述酶組合物中的總e-葡萄糖苷酶的約90%至約100%(w/w)包含纖維素結合域。31.根據權利要求17的所述酶組合物的用途，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述纖維素酶包括選自纖維素酶C朋I和CBHn及它們的組合的纖維4水解酶，以及選自纖維素酶EGI、EGII、EGIV、EGV和EGVI及它們的組合的內切葡，酶。32.根據權利要求17的所述酶組合物的用途，其中在所述部分7jc解步驟(步驟(i))中，存在于所述JI組合物中的總纖維素酶的約75%至約100%(w/w)與存在于所述水H漿液中的纖維固體結合。33.—種用酶組合物將纖維素酶法水解以^^預處理的木質纖維素原料產生含葡萄糖的水解產物的方法，所述酶組合物包含纖維素酶、一種或多種P-葡萄糖苷酶以及用于將所述P-葡萄糖苷酶結合至所述預處理的木質纖維素原料上的粘合劑，其中所述過程包含(i)用所述酶組合物部分地水解所述預處理的木質纖維素原料的水性漿液以產生含有葡萄糖、葡萄糖寡聚體或它們的組合的水解漿液，以及含有包括纖維素和木素的未水解的纖維固體；(ii)>^^斤勤目中分離出所述未7jc解的纖維固體以產生分離的纖維固體，其中所述纖維素酶和所述一種或多種p-葡萄糖苷酶與所述分離的纖維固體結合；(iii)將所述分離的固體再懸浮于一種水性溶液中以產生再懸浮的漿液；以及(iv)繼續(xù)7jc解所述再懸浮的漿液以產生含葡萄糖的水解產物。34.根據權利要求33的過程，其中所述粘合劑是一種可操作連接至所述一種或多種P-葡萄糖苷酶上的碳水化合物結合模塊。35.根據權利要求34的方法，其中所述碳水化合物結合模塊是一種纖維素結合域。36.根據權利要求33的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述水性漿液具有約3%-約3(^(w/w)的懸浮的或不溶解的固體含量。37.4艮據權利要求33的方法，其中所述未水解的纖維固體經微孔it^慮、離心、真空過濾或加壓過濾分離。38.根據權利要求37的方法，其中所述未水解的纖維固體經微孔過濾分離。39.根據權利要求33的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))前將所述水性漿液濃縮。40.根據權利要求33的方法，其中所述方法在包^~~個或多個選自以下的水解瓦應器的水幹沐系中進行攪,、非濕^、攪拌J^和非混^^塔。41.根據權利要求40的方法，其中所述攪拌塔AJi流式塔。42.根據權利要求40的方法，其中所述非^^塔;Ui流式塔。43.根據權利要求33的方法，其中所述過程是分批過程。44.根據權利要求33的方法，其中所述過程是連續(xù)過程。45.根據權利要求33的方法，其中所#性漿液中約70%至約100%的纖維素被轉化成葡萄糖。46.根據權利要求33的方法，其中包含步驟(i)中產生的含葡萄糖的流體與包含步驟(iv)產生的含葡萄糖的流體結合，產生結合的糖流體。47.根據權利要求33的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述預處理的木質纖維素原料來自小麥稈、燕麥稈、大麥稈、玉米秸、大豆秸、菜籽稈、稻稈、甘蔗、甘蔗渣、柳枝稷、草蘆、大米草或芒屬。48.根據權利要求33的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，以每克纖維素約1.0至約40.0IU的劑量添加纖維素酶。49.根據權利要求33的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，以每克纖維素約35至約200IU的劑量添加所述一種或多種p-葡萄糖苷酶。50.根據權利要求33的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述纖維素酶由曲霉屬、腐質霉屬、木霉屬、芽*菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。51.根據權利要求33的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，所述P-葡萄糖苷酶由曲霉屬、腐質審屬、木霉屬、芽孢桿菌屬、喜熱裂孢菌屬或它們的組合產生。52.根據權利要求51的方法，其中所述p-葡萄糖苷酶由曲霉屬或木霉屬產生。53.根據權利要求33的方法，其中所述繼續(xù)水解步驟(步驟(iv))進行約12至約200小時。54.根據權利要求33的方法，其中所述部分水解步驟(步驟(i))進行約12至約24小時。55.根據權利要求33的方法，其中在所述部分水解步驟(步驟(i))中，存在于所述JI組合物中的總纖維素酶的約75%至約100W(w/w)與存在于所^K性漿液中的纖維固體結合。56.根據權利要求33的方法，其中在所述再懸浮步驟(步驟(iii))中，所述水性溶、M生產用水。全文摘要提供了一種用于酶法水解纖維素以從預處理的木質纖維素原料產生含葡萄糖的水解產物的方法，以及用于該方法中的酶。所述方法包含用纖維素酶、一種或多種β-葡萄糖苷酶以及用于將所述β-葡萄糖苷酶結合至存在于預處理的木質纖維素原料的水性漿液中的纖維固體上的粘合劑部分地水解所述水性漿液。然后將所述未水解的纖維固體從所述水解的漿液中分離。然后將如此得到的分離的纖維固體再懸浮于水性溶液中，產生再懸浮漿液。然后繼續(xù)所述水解，產生含葡萄糖的水解產物。文檔編號C12P19/14GK101501206SQ200780030237公開日2009年8月5日申請日期2007年6月22日優(yōu)先權日2006年6月22日發(fā)明者J·S·托蘭,J·托馬斯黑克,T·懷特申請人:埃歐金能源公司